Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

Published: March 6, 2013 doi: 10.3791/50141
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

Summary

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

Abstract

אינטראקציות פיסיות בין תחומי שומנים משובצים אלפא הסליל של חלבוני קרום לשחק תפקיד מכריע בקיפול והרכבה של קומפלקסי חלבוני קרום ובתהליכים דינמיים כגון הטרנסממברני (TM) איתות ובקרה של רמות חלבון על פני קרום תא. הבנת התכונות המבניות נהיגת העמותה של רצפים מסוימים דורשת ניתוחי biophysical וביוכימיים מתוחכמים של מתחמי פפטיד TM. עם זאת, hydrophobicity הקיצוני של תחומי TM גורם להם קשים מאוד לתמרן תוך שימוש בטכניקות כימית פפטיד סטנדרטיות, וייצור של חומר הלימוד המתאים לעתים קרובות מוכיח להחריד מאתגר. זיהוי תנאים שבם פפטידים יכולים לאמץ תצורות סליל יציבות ומתחמי צורה ספונטנית מוסיף רמה נוספת של קושי. כאן אנו מציגים הליך לייצור קומפלקסי פפטיד TM הטרו dimeric מחומרי הומו או שבאים לידי הביטוי בE. colאני, ובכך מאפשר שילוב של תוויות יציבות איזוטופים לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) או חומצות אמינו לא טבעיות ליישומים אחרים יחסית זול. החדשנות המרכזית בשיטה זו היא שקומפלקסי TM מיוצרים וטהרו כמכלולים הקשורים קוולנטית (דיסולפיד crosslinked-) כי יכול להיוצר מבנים יציבים, stoichiometric והומוגנית כאשר מחדש לחומרי ניקוי, שומנים בדם או חומרים אחרים קרום כוזבים. אנו מציגים גם נהלים מותאמים בקפידה לביטוי וטיהור שחלים גם אם הפקת תחומי TM בודדים או מתחמי crosslinked ולספק ייעוץ להתאמת שיטות אלה לרצפי TM חדשים.

Introduction

בפרוטוקול זה הליך שפתחנו להפקת מתחמי דיסולפיד התייצבו-הטרנסממברני של פפטידים (TM) למחקרים מבניים באמצעות NMR פתרון. ההליך מנצל את הביטוי החזק הניתן על ידי מערכת היתוך ΔtrpLE1413 (ראה להלן) ומאפשר מתחמי פפטיד TM של הרכב מוגדר להיות שנוצר תוך שימוש בטכניקות תיוג-איזוטופ היציב מתוחכמות עבור ניסויי NMR רבי ממדים מודרניים. יש לנו מועסקים הטכניקות הללו כדי לקבוע כמה מבני NMR שחשפו מידע חדש וחשוב על איך immunoreceptors הלימפוציטים-מפעילות מורכבים מיחידות משנת חלבון קרום רבות באמצעות אינטראקציות בין תחומי TM (לאחרונה בדק ב1). טכניקות אלו חלות על מערכות רבות אחרות בממברנה חלבונים, כמו גם מגוון רחב של שיטות אנליטיות במורד זרם בנוסף לתמ"ג פתרון. אמנם הדוגמא שניתנה כאן מנצלת שאריות ציסטאין ילידיםליצירה מורכבת, שמחק באופן טבעי דיסולפיד מלוכדות החלבון, העיצוב הוא מתאים באותה מידה גם ליצירת קשרי דיסולפיד מהונדסים לייצב מתחמי שבדרך כלל מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות חלשות יותר, שאינן קוולנטיים כגון הומו והטרו מתחמי TM dimeric של קולט גורם גדילה באפידרמיס חלבונים (EGFR)-משפחה 2-4 או מתחמי integrin αβ heterodimeric 5,6.

רצפים פפטידים מאוד הידרופובי כגון אלה נגזרים משומני bilayer התפרסות על חלקים של חלבוני TM הם נושאים קשים ביותר למחקרים ביוכימיים וbiophysical. בנוסף להיות מאוד מאתגר לתמרן באמצעות חלבון סטנדרטי וטכניקות כימית פפטיד, הם לעתים קרובות למדי רעילים לתאים ולכן קשים לייצר recombinantly. אנחנו 7,8 ואחרים 9-11 יש לו הצלחה משמעותית לבטא רצפים פפטידים כה קשים בחיידקים כבמסגרת Carboxy-מסוףfusions לגרסה שונה של ΔtrpLE1413 הרצף נגזרת מE. coli trp אופרון 12. פוליפפטיד trpLE ~ 13 kDa מקודד על ידי רצף זה יכול להיות מיוצר ברמות גבוהות תחת אמרגן T7 והוא לגמרי מקומי לגופי הכללה בי בעיות הנוגעות לרעילות ו / או חוסר יציבות עוקפות. שינוי של הרצף על ידי תוספת של תג 9-היסטידין 13 וחיסול שאריות מתיונין וציסטאין פנימיים מרצף trpLE 14 fusions אפשר trpLE-פפטיד להיות מטוהר על ידי מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה ומתעכל באמצעות ציאנוגן ברומיד (CNBr-מסוף אמינית ) כדי לשחרר את רצף הפפטיד הרצוי. אנחנו השתמשנו בהצלחה במערכת זו כדי להביע יותר מתריסר רצפים שונים כמו fusions trpLE מייצג ברי חלבון קרום המכילים עד ארבעה תחומי TM (7,8 ותוצאות לא פורסמו; ראו סעיף דיון גם).

חדשנות מרכזית בפרוטוקול זה היא זיהוי של תנאים בי fusions בלתי המובנה וצורה הגרועה מאוד מסיס trpLE-TM יכול להיות יעיל דיסולפיד crosslinked-בהקשר של זרימת עבודה יעילה. כמה היבטים של ביטוי, טיפול תשואה גבוהה וטיהור של מוצרים פפטידים גם מוטבו ביסודיות, ואת ההמלצות שהציגו כאן הן לא פחות רלוונטיות לייצור שאינם דיסולפיד crosslinked-מוצרים (monomeric) TM פפטיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט ועיצוב Construct

לשכפל את הרצפים של עניין לוקטור PMM-פפטיד (אשר יכול להיות מסופק על פי בקשה) בשימוש באתרי הגבלת BamHI (ראה תרשים 1) HindIII ו. להוסיף גדילי הדנ"א כפול צריך לשלב, לפי הסדר הבא: אתר HindIII; קודון מתיונין אחת למחשוף CNBr; E. פפטיד coli קודון המותאם לקידוד רצף; קודון עצירה; אתר BamHI. כל methionines האחר בפפטיד צריך לחסל ורצף dipeptide ASP-Pro יש להימנע ככל שזה יהיה גם הבקיע בתנאים חומציים.

שאריות ציסטאין ייחודיות צריכות להיות הציגה לכל רצף פפטיד פי המיצוב הרצוי של crosslink דיסולפיד במתחם סופי, וכל cysteines האחר יש מוטציה לסרין. פלסמיד נושא קלטת התנגדות kanamycin לבחירה.

2. ביטוי של trpLE-peptiפיוז'ן דה

  1. איפור ובינוני סטרילי מסנן M9/Kan מינימאלי צמיחה (0.1 המ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgSO 4, 3 ג'/ ליטר KH 2 PO 4, 7.5 גר '/ ל' Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 גר '/ L NaCl, 1 גרם / L NH 4 Cl, 4 גרם גלוקוז / L, סולפט 50 מ"ג / ליטר kanamycin). תוספת עם Centrum מלא לאבץ כדי לספק B-ויטמינים ומתכות קורט: לפזר 1 טבלית ב40 המ"ל H 2 O עם הערבוב למשך 30 דקות, צנטריפוגות כדי להסיר חומר מסיס וסטרילי סינון supernatant הכתום. פתרון חנות מנייה ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות ולהשתמש 4 מ"ל / ליטר בM9.
    הערה: 15 4 Cl N-מועשר NH, 13 גלוקוז C-מועשר או מבשרים אחרים יציב, איזוטופ שכותרת-עשוי להיכלל במדיום M9 בשלב זה אם רוצה.
  2. לחסן תרבות המתנע 100 מ"ל מהפך טרי BL21 (DE3) המתח E. חיידק במדיום M9/Kan. לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס עם הרעד ב 200 סל"ד.
  3. למחרת בבוקר, בדוק את OD 600 של תרבות המתנע - זה צריך להיות בטווח של 2 או יותר. דלל את תרבות 100 מיליליטר המתנע לנפח כולל של 1 הליטר Centrum-M9 תוספת בינונית. התפצל לשתי 2 צלוחיות מבולבלות L (500 מיליליטר תרבות בכל בקבוק) ולגדול ב 37 ° C רועד ב 140 סל"ד עד 600 OD מגיע 0.6.
  4. הגדר את הטמפרטורה ייקרה עד 18 מעלות צלזיוס ולהמשיך רועדים לשעה 1, המאפשר תרבויות להתקרר לחלוטין לפני הגיוס.
  5. קח לדוגמה טרם גיוס לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1), לאחר מכן להוסיף IPTG לריכוז סופי 0.1 מ"מ כדי לגרום ביטוי של היתוך trpLE-פפטיד. להמשיך ולצמוח ב18 ° C/140 סל"ד הלילה (16-20 שעות) תחת אינדוקצית IPTG.

3. הכנת גוף הכללה ועקידת מטריקס ניקל

  1. OD 600 של תרבויות ביטוי הלילה במדיום מינימאלי הסופי הוא משתנה וshould להיות בין 2.5 ל 5.0. קח דוגמה לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1) ולאסוף תאים על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב5000 x גרם.
  2. Resuspend תא גלול מתרבות 1 ליטר בחיץ תמוגה מ"ל 50 (50 mM טריס-HCl pH 7.5, 20 מ"מ β-ME, 0.2 מ 'NaCl). מתלי תא ניתן לאחסן קפוא לעיבוד מאוחר יותר.
  3. Lyse תאים על ידי sonication על קרח בתפוקה מקסימלית לדקות 1 ומנוחה על קרח למשך 5 דקות. אנו משתמשים Sonicator Misonix 3000 (600 ואט פלט לכל היותר) עם קצה בעצמה גבוהה להחלפת ½ אינץ'. חזור sonication / קירור לשלושה מחזורים.
  4. איסוף הכללת גוף חומרי לא מסיסה (IB) על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב20000 XG ולהשליך supernatant. שכבה רופפת, דקה של פסולת תא בצבע בהיר יכולה להיות גלויה בחלק העליון של IB הגלולה הצפופה, זה יכול להיות נשטף באמצעות מים או חיץ עם תסיסה עדינה. ניתן לחזור על שלבים 3.3 ו 3.4 כדי לשפר את הטוהר של שבריר IB אם desiאדום. דוגמאות של גלולה וחומר supernatant צריכות לקחת לניתוח SDS-PAGE כדי לאשר לוקליזציה היתוך trpLE-TM לגופי הכללה.
  5. ממס IB כדורים בguanidine פתרון (6 M guanidine HCl, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 מ"מ β-ME), תוך שימוש ב25-50 מ"ל לליטר של תרבות מעובד. צעד זה יחייב כמה שעות עם תסיסה וsonication קל מדי פעם.
  6. נקה IB lysate ידי צנטריפוגה לשעה 1 ב75,000-100,000 XG ו20 ° C. למזוג supernatant וסינון דרך קרום מיקרומטר 0.2.
  7. שלב פינה IB lysate, בצינור 50 מיליליטר חרוטים או כלי גדול שיכול להיות סגור היטב, עם שרף זיקת ניקל שנשטף במים ומתאזנים לפתרון guanidine. השתמש שרף התיישב מ"ל 3-4 לליטר של תרבות מעובדים לfusions שמבטא במידה דומה כמו trpLE-DAP12TM מוצג כאן (איור 3, בסמטה 2). לאגד תצווה על ידי דוגר בלילה בחדר לא emperature עם ערבוב עדין.

4. Crosslinking חמצונים בטור

  1. טען השעית lysate / ניקל IB השרף לעמודת זרימה הכבידה ריקה עם תמיכת מיטה נקבובית, והוסיף ברציפות עד שכל הנפח זורם דרכו. לאסוף ולשים בצד flowthrough, שעדיין עשויה להכיל חלבון היתוך לא מאוגד.
  2. שטוף את שרף ניקל ידי זרימה הכבידה עם 5 כרכי המיטה של ​​תמיסת אוריאה (8 אוריאת M, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl) המכילים 5 מ"מ β-ME.
  3. שטוף את שרף ניקל שוב עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה בלי β-ME.
  4. שטוף את שרף ניקל פעם שלישית עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה שכבר השלימו עם 20 מיקרומטר CuSO 4 ו2 מ"מ החמצון גלוטתיון. לאחר שטיפה זו, סגור את שקע העמודה ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר היווצרות קשרי דיסולפיד מקסימלי.

5. Elution וquantitation TFA

תוכן "> זהירות: חומצת Trifluoroacetic (TFA) גורמת לכוויות קשות במגע עם עור ואדים הם מעצבן ביותר TFA המרוכז יש להשתמש רק במנדף כימי אושר בהגנה על עין וכפפות ללא לטקס בדקו את התאימות הכימית מכולם.. חומרים בשימוש; פוליפרופילן תואם את כל השלבים של פרוטוקול זה.

  1. לשטוף את פתרון אוריאת חמצון עם 10 כרכי מיטה של ​​מים ולייבש את מיטת העמודה על ידי יישום שורת ואקום לשקע עמודה.
  2. סגור את שקע העמודה ולהוסיף 1.5 כרכים של מיטה המסודר (99-100%) TFA. מערבב את שרף ניקל עם מרית קטנה כדי להבטיח אפילו חשיפה לחומצה ודגירה במשך 5 דקות. פתח את שקע העמודה ולאסוף eluate החומצה, pressurizing עדינות עם מזרק או קו האוויר דחוס במידת צורך לדחוף את כל הנוזלים.
  3. חזור על שלב elution חומצה עם 1.5 כרכים עוד מיטה של ​​TFA המסודר. לעבוד במהירות בשלב זה כדי להימנע מפירוק מלא של beadeד agarose מטריצה. תשואת חלבון ניתן לקבוע בשלב זה על פי משוואת באר למברט ומקדם ההכחדה הטוחנת התיאורטית של רצף trpLE-פפטיד. לדלל מדגם של eluate TFA (1:20-01:50) בtrifluoroethanol (TFE) ולמדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, באמצעות TFA / TFE באותו הדילול כריק.

6. עיכול CNBr

זהירות: ברומיד Cyanogen (CNBr) הוא רעיל ביותר ויש לטפל רק בברדס אשר כימי קטר. PPE כולל משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות לטקס שאינם נדרשים באופן מוחלט. CNBr הוא תגובה ללחות ויש להביא לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. צור קשר עם משרד הביטחון המוסדי לקבלת הוראות לנטרול / סילוק של פתרונות CNBr מזוהמים וחומרים.

  1. דלל את eluate החומצה לריכוז TFA סופי 80% על ידי בנוסף dropwise של מים תוך כדי הערבוב בעדינות. אם נוצר משקע,dd חזרה נפח קטן (0.5-1 מ"ל) של TFA המסודר עד שהתמיסה מבהיר, אז מחדש נכונה עד 80% במים. קח 5 מדגם מראש לעכל μl לניתוח SDS-PAGE, הקפאה בחנקן נוזלי וlyophilizing המדגם באופן מיידי.
  2. הוסף גבישי CNBr לכ -0.2 גר '/ מ"ל, מטפל לשקול כימי הרעילה בבטחה בצינורות סגורים, מראש שקלו או באמצעות איזון בתוך מנדף הכימי. מערבב בעדינות עד שהיא נמסה לחלוטין. לשטוף ולאטום את כלי תגובה בגז אינרטי (חנקן או ארגון זרם) ולדגור שעות 3-4 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור.
  3. קח 5 מדגם הפוסט לעכל μl לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. להעביר את התגובה לקלטת לעכל תאית מחדש דיאליזה או צינורות (יצטט תאית יתמוסס בחומצה מרוכזת) עם הפסקת משקל מולקולרית של 3.5 kDa או פחות, בהתאם לגודלו של מתחם פפטיד הצפוי. דיאליזת הלילה עד 4 ליטר מים במנדף הכימי כדי להפחית את ריכוז TFA ולפרק כל CNBr unreacted. השאר מקום בקלטת הדיאליזה או צינורות לגידול משמעותי בנפח (כמו שתיים ושלושה של פי) במהלך דיאליזת הלילה.
  4. הסר את פתרון תגובת הדיאליזה עם משקע הושעה מקלטת הדיאליזה או צינורות (רוב החלבון יזרזו כאשר ריכוז TFA מצטמצם) ולהעביר את ההשעיה עד 50 צינורות חרוטי מ"ל. הקפא וlyophilize להסיר מים ועקבות של CNBr / TFA. צעד זה עשוי לדרוש כמה ימים.
    זהירות: שניהם תגובה לעכל דיאליזה ודיאליזת המים צריכה להמשיך להתייחס אליהם כרעיל וטפל / נפטר עם אמצעי זהירות מתאים.
  5. דוגמאות של תרבויות משלבים טרם גיוס וקציר, הכללת הגוף supernatant וגלול, eluate TFA וCNBr-מתעכל חומר עשויות להיות מנותחות על ידי SDS-PAGE. הכן את הדגימות על ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בInvitrogen NuPAGE LDS samplחיץ דואר. דגימות לעכל eluate וTFA צריך להיות מוכן בתנאי שני הקטנה ולא להפחתה לזיהוי ולהערכה של מוצר crosslinking חמצונים.
  6. הפרד את הדוגמות על 12% ג'ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide באמצעות MES-SDS חיץ פועל לרזולוציה אופטימלית של המוצרים לעכל הקטנים ביותר.

7. טיהור של מכלולי פפטיד דיסולפיד-crosslinked HPLC התהפך שלב

  1. ממס עד 100 מ"ג של מוצרים לעכל lyophilized לחומצה פורמית 2-3 מ"ל מסודר ועומס על preparative קנה מידה (21.2 x 150 מ"מ) Agilent ZORBAX SB-300 C3 עמודת PrepHT בממס (בדרך כלל אצטוניטריל 10-20% או 5 -10% Isopropanol במים עם 0.1% TFA).
  2. Elute את המוצרים לעכל בשיפוע של B ממס (אצטוניטריל או isopropanol עם 0.1% TFA) על לפחות 5 כרכי עמודות. ראה דיון להצעות על הבחירה של שיפוע תנאים אופטימליים לרצפים פפטידים שונים.
  3. לקחת50-100 דגימות μl מכל שבריר HPLC לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. הסרת ממסי HPLC היא מהירה וצריכה להיות מלא ב1-2 שעות.
  4. הכן דגימות HPLC lyophilized לSDS-PAGE ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בחיץ מדגם LDS NuPAGE Invitrogen ללא סוכן צמצום. מצננים ולפצל כל דגימה שווה ל 2 צינורות microcentrifuge, והוסיף DTT 100 מ"מימ לאחד מהם וחימום מחדש לזמן קצר.
  5. הפרד את דגימות HPLC המופחתות ואינן מופחתות על 12% ג'ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide עם MES-SDS ריצת חיץ כאמור לעיל. פפטידים קטנים, הידרופובי לעתים קרובות לא יתפסו Coomassie הכתם היטב ולא יכולים לרוץ במשקלים המולקולריים הצפויים שלהם. עם זאת, השוואה של דגימות מופחתות ואינן מופחתות צריכה להקל זיהוי של המוצרים וההערכה של טוהר פפטיד crosslinked.
  6. נתח את שברי מועמד פפטיד המכילים על ידי מטריקס בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסה (MALDI TO-F) ספקטרומטריית מסה (ראה דיון) כדי לזהות את המין של עניין ולאשר המוניים הצפויה שלו.
  7. שלב, להקפיא וlyophilize שברי HPLC המכילים קומפלקס הטהור, crosslinked TM פפטיד ולקחת משקל יבש של המוצר הסופי כדי לקבוע את התשואה. שברים עם תוכן isopropanol גבוה לא יכולים להישאר קפואים. אם שברי פפטיד להתייבש עד לסרט ולא מוצר lyophilized אוורירי, מחדש להתמוסס לחלוטין בסרט נפח קטן של טהור hexafluoroisopropanol (HFIP), להקפיא וlyophilize שוב. מוצר HFIP טופל צריך להיות חרוט קטן, לבן, כי הוא הטה קלות החוצה ומשקליו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רמת הביטוי להושגה fusions trpLE היא משתנה ותלוי מאוד ברצף החומצות האמינו של הפפטיד המצורף. איור 3 מציג את ניתוח SDS-PAGE של טרם הגיוס (1 נתיב) וזמן של קציר (מסלול 2) דגימות מתרבות שהניבה כ 120 מ"ג של היתוך טהור, שלם trpLE-DAP12TM מ1 ליטר של התרבות ומטריצת ניקל מ"ל 4. כל היתוך trpLE-DAP12TM היה מקומי להכללת גוף הכדורי (מסלול 4) בניגוד לsupernatant (3 נתיבים).

כ 70% מהיתוך ניקל מטוהר-trpLE-DAP12TM היה דיסולפיד-crosslinked לטופס dimeric (איור 3, נתיבים 5 ו 6: דגימות שאינן מופחתות, וירידה של eluate TFA). זו היא תוצאה אופיינית להיתוך trpLE-DAP12TM, אבל יעילות crosslinking תשתנה בהתאם למיקום של cysteines המהונדס. מוצרי פפטיד DAP12TM אינם לזיהוי בקלות בדגימות כלל CNBr לעכל (נתיבים 7, 8),אבל השוואה של ההיתוך השלם ולהקות בר trpLE במדגם העיכול המופחת (מסלול 8) מציינת שהעיכול של ההיתוך היה ~ 60% מלא.

איור 4 מראה את ההפרדה של מוצרים לעכל ידי הפוך השלב HPLC באמצעות עמודת C3 preparative קנה מידה (סך יכולת קשירה ~ 200 מ"ג של חלבון). בגלל התוכן הריחני של ההיתוך נמוך אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הספיגה ב214 ננומטר ולא 280 ננומטר. עבור 90 מ"ג הטווח זה של חמצון, CNBr-מתעכל היתוך trpLE-DAP12TM הומס בחומצה פורמית מסודרת מ"ל 3 והועמס על העמודה ב% ממס 100 (60% H 2 O, אצטוניטריל 40%, 0.1% TFA). מוצרי עטופות eluted בשיפוע שני שלבים של 0-60% ואחרי 60-90% B ממס (75% isopropanol, אצטוניטריל 25%, 0.1% TFA) בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה. המוצרים העיקריים הכלולים בכל שבריר לפי ניתוח SDS-PAGE (איור 5) הם ציינו לעיל הכרומתוגרמה באמצעות קודי אסיgned באיור 2. ראה אופטימיזציה של elution השיפוע HPLC בסעיף הדיון לפרטים נוספים על תנאי אופטימיזציה הדרגתית לרצפים פפטידים שונים.

מוצרי פפטיד ניתן לזהות בנקל בSDS-PAGE (איור 5) וMALDI-TOF (6 איור) ניתוחים של שברי HPLC העיקריים. פפטידים DAP12TM ו, בניסיון שלנו, הרבה פפטידים TM הידרופוביות אחרים, לרוץ עם שיעורי הגירת קטינה באופן משמעותי בהשוואה למשקל המולקולרי הצפוי שלהם (3366 דלתון מונומר ודלתון דימר 6730 עבור 15 המינים N-שכותרתו מוצגים כאן). התנהגות זו קשורה באופן ישיר לכמות פפטיד הועמסה על ג'ל והתוצאות ברצף של משקלים מולקולריים לכאורה כסכום הטעון מגוון (מידע לא מוצג). עם זאת, השינוי בניידות electrophoretic של שיא 5 עם הפחתה עם DTT 100 מ"מימ (השווה נתיבים 7 ו 8) מזהה זה כפפטיד crosslinkedמוצר. MALDI-TOF MS ניתוח מאשר את זהותו של פפטיד dimeric עם השיא העיקרי ב6729.2 Daltons ומגלה אין מוצרים עיקריים אחרים (איור 6). התשואה הסופית של דיסולפיד crosslinked-DAP12TM פפטיד homodimer הטהור מהיערכות זו הייתה 7.5 מ"ג לליטר של התרבות.

איור 1
איור 1. רצף ה-DNA של אזור קידוד trpLE-DAP12TM עם תרגום חומצת אמינו. אזורים עיקריים של רצף פוליפפטיד מודגש וצבעים שונים עם תוויות בצד הימין. את השאריות הייחודיות הפנימיות מתיונין (MET) וציסטאין (Cys) למחשוף ציאנוגן ברומיד (CNBr) וcrosslinking חמצונים מודגשות בצבע תכלת וסגול, בהתאמה. אתרי הגבלת BamHI (מודגש ועם קו תחתון) HindIII וייחודיים בפלסמיד ואמאy לשמש כדי להחליף את רצף הפפטיד TM עם רצף נוסף של ריבית.

איור 2
איור 2. תרשים סכמטי של ההליך. השלבים העיקריים בפרוטוקול מצוין בתוויות טקסט. מגזרים עיקריים של היתוך trpLE-DAP12TM מקודדים באמצעות צבע כמו באיור 1. מוצרי פוליפפטיד עיקריים מצעדים לעכל crosslinking ומתויגים AF והם מפורטים כאן עם התיאור שלהם ומשקלים מולקולריים צפויים (15 N מתויג-): [א] שבר trpLE: 13769 Daltons; [B] היתוך שלם trpLE-DAP12TM: 17118 Daltons , [ג] שלם trpLE-DAP12TM היתוך דימר: 34233 Daltons; [ד] היתוך יחיד בקע trpLE-DAP12TM דימר: 20482 Daltons; [E] monomeric DAP12TM פפטיד: 3366 Daltons; [F] dimeric DAP12TM פפטיד: 6730 Daltons. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. ניתוח SDS-PAGE של צעדי הביטוי, טיהור, crosslinking ולעכל trpLE-DAP12TM דגימות תרבות (1 מסלול, טרם גיוס, צעד 2.5; נתיב 2, קציר, צעד 3.1). ודגימות prep גוף הכללה (3 נתיבים, supernatant; נתיב 4, גלולה; צעד 3.4) הופחתו עם DTT mM 100. eluate TFA מטור ניקל (נתיבי 5 ו 6; שלב 6.1) ומדגם שלאחר CNBr (נתיבים 7 ו 8; צעד 6.3) היה לרוץ אינם מופחת (NR) ויורדת עם 100 המ"מימ DTT (R) כפי שצוין כדי לאשר דיסולפיד-crosslinked מוצרים. * מוצר פפטיד monomeric וdimericשל E ו-F הן גרוע דמיינה ידי מכתים Coomassie ולכן לא ניתן לגילוי בג'ל זה.

איור 4
איור 4. טיהור התהפך שלב HPLC של דימר DAP12TM דיסולפיד-crosslinked. חמצון, CNBr מתעכל וlyophilized מוצרי היתוך trpLE-DAP12TM (90 מ"ג) שהומסו בחומצה פורמית 3 מ"ל (100%) והועמסה על Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT (21.2 x 150 מ"מ) בטור ממס (60% H 2 O, אצטוניטריל 40%, 0.1% TFA). שיפוע בשני שלבים של 0-60% ואחרי 60-90% B ממס (75% isopropanol, אצטוניטריל 25%, 0.1% TFA) היה לרוץ בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה לelute מוצרים קשורים. שברים שנאספו כזרימה דרך (FT) וארבע פסגות עיקריות מסומנות מעל העקבות הספיגות 214 ננומטר (AU: שרירותי בלתי) שלה ואת המוצרים העיקריים הכלולים בכל חלק מסומנים באמצעות קודים שהוקצו באיור 2. שיא המוצר הרצוי DAP12TM crosslinked מוצללת.

איור 5
איור 5. ניתוח SDS-PAGE של מוצרי HPLC הפוך-שלב. זרימה דרך (FT) והשיא 1 דגימות הורצו אינן מופחת. שיא 2, 3 ו 4 דגימות להריץ גם אינן מופחת (NR) ומופחתת על ידי טיפול עם 100 המ"מימ DTT (R) כדי לאמת את הזהות של מוצרי דיסולפיד crosslinked. המוצרים העיקריים בכל שבריר (עם הקודים שלהם הוקצו באיור 2) היו [FT, Pk1]: בר, trpLE; [Pk2]: B, בשלמות trpLE-DAP12TM ההיתוך מונומר ו-C, דימר היתוך השלם; [Pk3]: ד ', אחת בקע trpLE-DAP12דימר TM ו-E, monomeric DAP12TM פפטיד; [Pk4]: F, דימר DAP12TM דיסולפיד-crosslinked. * כפי שנדון (ראה REULTS ייצוג), משמרת ריכוז תלוי בניידות הופכת את המוצרים נמוכים MW בPk3 (ע"נ ו R) וPk4 (R) להיראות משקולות מולקולריות שונות למרות ששני המוצרים הם פפטיד monomeric.

איור 6
איור 6. ניתוח MALDI-TOF המוני spectrometric של HPLC-מטוהרי DAP12TM פפטיד דימר. מדגם של שבריר HPLC 4 (μl 1) היה מעורב 1:01 בתמיסה רוויה של חומצת sinapinic (SA) במטריצת אצטוניטריל והבחין על גבי שכבה דקה של מטריצת SA מיובשת מפתרון המוכן רווי באתנול. ניתוח MALDI-TOF חושף מוצר בפפטיד DAP12TM הצפוי crosslinked דימר המונישל 6730 Daltons (6729.2098; 15 N מתויג-), כמו גם מוצרי קטין ב3365.7105, סביר להניח שהמינים כפולים המיוננים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הביטוי של fusions trpLE-TM. מניסיוננו, fusions trpLE-TM מבוטא היטב במדיום התרבות עשיר על 37 מעלות צלזיוס, ובתנאים שתוארו כאן התרבות הוכיחו מוצלחים עבור רצפים שונים המכילים 1-4 תחומי TM עם תשואות הנעות 50-150 מ"ג / ליטר של היתוך טהור, ללא פגע. קידוד fusions שלוש או ארבעה שברי TM GPCR (CCR5 האנושי TM1-TM3 וTM4-TM7, בהתאמה) או שבר קטליטי ליבה של peptidase פפטיד אות האנושית (ארבעה תחומי TM, ראה שופט 15) מייצג הנמוכים ביותר בטווח זה של ביטוי רמות, ואילו גרסות DAP12TM הקשורים קשר הדוק לרצף משמש כאן מייצג את הקצה העליון של הטווח (נתונים שלא פורסמו). ריכוז IPTG האופטימלי צריך להיקבע באופן ניסיוני עבור כל רצף חדש. התקן שלנו הוא 0.1 מ"מ, וריכוזים גבוהים יותר (עד 1 מ"מ) בדרך כלל תוצאה של תשואה בשל שתי רמות הביטוי הנמוכות באופן משמעותי וצפיפות תרבות נמוכהקציר לא (ראה לדוגמה באיור 1 א 7 הפניה).

וריאציות על הפרוטוקול שהוצג. הפרוטוקול מפורט כאן מתארות את הייצור של דיסולפיד crosslinked-TM פפטיד מורכב, DAP12TM 8 homodimer. לחלופין, בפרוטוקול להתאים בקלות לייצר פפטידים monomeric ידי השמטת שני הצעדים שנועדו לשטוף להסיר צמצום הסוכן וחמצן את המוצרים המאוגדים (4.3 ו -4.4). אנחנו השתמשנו בעבר וריאציה אחרת של ההליך דיווחה כאן כדי לייצר מורכב התייצב קוולנטית TM פפטיד המייצג את DAP12-DAP12-NKG2C TM הרכבת trimeric (ראה התייחסות 8 ושיטות שתוארו בו). ביישום זה, 1-TM היתוך trpLE-DAP12 והיתוך 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C היו מעורבים בשלב קציר התרבות לפני הכנת גוף הכללה (צעד 3.1-3.2). ההליך כלל צעד HPLC נוסף לבודד את heterodimeric crosslinked trpLEמוצר היתוך מeluate החומצה (שלב 5.3) לפני CNBr לעכל. טיהור C3 של מוצרי פפטיד הביאה התאוששות של דימר דיסולפיד-crosslinked DAP12TM שבגדיל אחד נשא תחום TM NKG2C כבמסגרת היתוך C-מסוף. מבנה NMR הפתרון מורכב זה במיצלות דטרגנטים אשר כי תחום TM NKG2C התאסף עם DAP12 באורינטציה שלו הילידים, אנטי המקבילה 8. השלבים הנוספים בוריאציה זו באופן משמעותי את התשואה של התוצר הסופי: הכנה טיפוסית הניבה 8-10 מ"ג של פפטיד "trimer" מ4L של היתוך 1 בשילוב עם עודף של 2. וריאציה זו מייצגת פרוטוקול התחלה טוב עבור חוקרים המבקשים לייצר מתחמי דיסולפיד-התייצב המכילים שני רצפי TM שונים.

הערות על טיהור ניקל זיקה. Elution של חלבון מעמודת ניקל המיובשת באמצעות חומצה מרוכזת היא הליך חריג ולא מקובל מחדששימוש במטריצת ניקל. ניסיונות elute את fusions trpLE-TM מאוד הידרופובי באמצעות imidazole או EDTA הביאו להתאוששות לא מלאה של חלבון ואת מיני crosslinked מעדיפים נשמרו בעמודה (תוצאות לא פורסמו). הכמות המומלצת של מטריצת ניקל ופרוטוקול הלילה יצווה מחייב מוטבו בזהירות כדי להרוות את המטריצה ​​עם חלבון trpLE-TM ובכך למזער את שיתוף הטיהור של מזהמים. אנחנו באופן שגרתי להתאושש מוצרים מאוד טהורים עם תשואות שעולות משמעותי על יכולת הקשירה המפורסמת של סיגמא HIS-בחירת ניקל זיקת מטריקס (15-20 שרף מ"ג / מ"ל). Elution החומצה מבטל גם צעדי ביניים הנדרשים למעבר לCNBr העיכול, ותשואה המוגברת של מוצרי crosslinked יותר מקיזוז העלויות של מטריצת ניקל, במיוחד כאשר סימון בריאגנטים-איזוטופ היציב יקרים לתמ"ג.

תנאי ציאנוגן ברומיד לעכל. שחרורו שלפפטידים TM התמזגו מtrpLE בCNBr מבוצע בדרך כלל באמצעות 70% חומצה פורמית כממס משום שגם שיעור התגובה ומסיסות חלבון הם חיוביים ביותר בתנאים אלה. עם זאת, פעמי טיפול חייבות להיות כל זמן קצר יחסית (מתחת 1 שעה לעיכול), כדי למנוע esterification formyl של סרין ותראונין שאריות 16,17 ואולי אני-formylation של שאריות טריפטופן 18, שינויים שניתנים לאיתור על ידי ספקטרומטריית מסה כמינים שנצפה מסה הוא 28 Daltons (n) יחסית למסה הצפויה. העדפתנו לTFA כפי שמתואר כאן נמנעה מהשינויים הללו לחלוטין. מחשוף האנזימטית של היתוך trpLE-TM באמצעות הפקטור Xa פרוטאז ב1% טריטון X-100 כבר דיווח על 11, אך המסיסות הגרועה של רוב fusions trpLE-TM והסיבוך של חוסר נגישות אתר מחשוף במיצלות דטרגנטים כנראה להגביל את התועלת הכללית של זו גישה.

טיהור pepti HPLC התהפך שלבמוצרי דה מCNBr לעכל הוא הצעד המאתגר ביותר בהליך זה, וסביר דורש אופטימיזציה עבור כל רצף חדש trpLE-TM. התצפיות הבאות מגיעות מעיבוד רצפים רבים ושונים והם עשויים להיות נכונים גם לגבי רוב fusions trpLE-TM:

בחירת השלב נייח אנו מוצאים עמודות Agilent ZORBAX יציב בונד C3 (300 גודל נקבובי, 5 מיקרומטר גודל חלקיקים). להיות שלב מעולה נייח במונחים של הסלקטיביות, כוח לפתרון ויציבות תחת חשיפה כבדה לחומצה מרוכזת. חצי preparative (9.4 קוטר מ"מ) וpreparative קנה מידה (21.2 מ"מ קוטר) גדלים זמינים ובצעו היטב בידינו. C4, diphenyl ושלבים נייחים cyanopropyl עשוי גם לספק אלטרנטיבת פפטיד סלקטיביות שימושית במגוון hydrophobicity דומה בהשוואה ל-C3.

הכנת מוצרים לעכל לHPLC. פירוק מוצרי lyophilized CNBr לעכל במסודר עבורמיקרופון חומצה מספקת את התוצאות הטובות ביותר עבור הפרדת HPLC. הכנה TFA או בממסים אורגניים כגון אצטוניטריל, trifluoroethanol וdimethylformamide לעתים קרובות תוצאות מסיסות נמוכה, הקטין עמודה מחייבת ו / או elution של מוצרים בפסגות רחבות המכילות מינים רבים. יש להקפיד להכין מוצרים בחומצה פורמית מייד לפני טעינת טור בגלל חשיפה ממושכת יכולה לגרום לשינוי של formyl sidechains פפטיד 16-18 כפי שנדונה לעיל.

אופטימיזציה של elution השיפוע HPLC. אנחנו בדרך כלל מתחילות עם אצטוניטריל 10-20% או 5-10% isopropanol במים עם TFA 0.1% כfusions ממס א TrpLE-TM והמוצרים לעכלם מומסים בחומצה פורמית יחייב את עמודת C3 כב עד 40% אצטוניטריל כפי שמוצג כאן (איור 4). הרבה מבר trpLE המשוחרר יכול לזרום דרך בתנאים אלה (שימו לב שבר trpLE הוא המוצר היחיד בחלבון FTשבריר איור 5: 1, נתיב), ואנחנו מנצלים את ההבחנה הזאת כדי להגדיל את הקיבולת הכוללת של מחייבת העמודה למוצרים הרצויים. Acetonitrile וisopropanol יעילים מאוד כממסים הדרגתיים, ולעתים קרובות אנו מגיעים למצבי השיפוע הסופיים שלנו על ידי ערבוב פתרוני ממס קיימים מראש לשנות פרופילי elution, וכתוצאה ממתכונים לפעמים מוזרים אך יעילים כמו 75% isopropanol, Acetonitrile 25%, 0.1 פתרון TFA% משמש כB פתרון לטיהור DAP12TM שמוצגת כאן. מוצרים מאוד הידרופובי שהיו בעייתיים כבר eluted באמצעות אצטוניטריל או isopropanol עם תוספת של עד 10% trifluoroethanol (TFE) וריכוזים גבוהים של TFA (עד 0.3%) בשניהם A ו-B (תוצאות לא פורסמו). אחרים דיווחו על תוצאות טובות באמצעות שלבים ניידים חומצת butanol / אצטית עם שלב נייח C4 9.

ניתוח של מוצרי עיכול. שניהם טכניקת הניתוח המרכזיתזה משמש כאן, SDS-PAGE וMALDI-TOF MS, יכולים להיות מסובך מאוד מהאופי הידרופובי של מוצרי trpLE-TM. דגימות אנליטיים Lyophilized מתגובות CNBr / TFA לעכל ופיצולי HPLC לפעמים לרוץ כמו אגרגטים משקל מולקולרי גבוה בג'ל SDS-עמוד. אנו מוצאים כי טיפול של דגימות lyophilized עם נפח קטן של HFIP מחדש lyophilization לפני ההכנה לSDS-עמוד לעתים קרובות תרופות לבעיה זו. רצפים פפטידים TM יתכן גם שלא בקלות היינן במהלך ניתוח MS MALDI-TOF, ולכן יכולים לתת אותות חלשים מאוד. יש לנו להשתמש הליך אופטימלי להכנת דגימות פפטיד TM בי פתרון רווי של חומצת sinapinic (SA) באתנול, ראה לראשונה בצלחת והמיובשת לעשות שכבה דקה אחידה של מטריקס. מדגם של שבריר HPLC פפטיד המכיל מעורבים 1:01 בתמיסה רוויה של SA באצטוניטריל, ואז ראה על גבי שכבת המטריצה ​​המיובשת. בידות שלנו, תשואות בין שיטה זו ו2 יותר אות לרעש פי שישה להשוותד לאיתור פפטיד: תערובת SA ישירות על גבי צלחת MALDI נקיה.

יישומים במורד זרם. שיטות עבור בנייה מחדש של מתחמי פפטיד TM לתוך מערכות שומנים או חומרי ניקוי לNMR פתרון ויישומים במורד זרם אחרים להשתנות במידה רבה ובדרך כלל חייב להיות מותאמים בקפידה לכל מערכת ויישום חדשים. דיון מלא בפרמטרים המעורבים הוא אפוא הרבה מעבר להיקף של מאמר בפרוטוקול זה. לפרטים של הכנת מדגם מיישומים מוצלחים באמצעות NMR פתרון, אנחנו מפנים את הקורא לסקירות האחרונות אלה על הנושא 1,19 והפניות בו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מימון עבור עבודה זו ניתן על ידי ביטוח בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC פרויקט מענק 1011352 לMEC וMJC; תכנית מחקר עצמאית מכוני תשתיות תמיכה [IRIISS] מענק לWEHI) והממשלה ויקטוריאני (VESKI חדשנות המלגה לMEC; תמיכת מדינה ויקטוריאני ממשלה תפעולית תשתיות לWEHI). MEC הוא עמית אליזבת שנייה מלכת המועצה למחקר האוסטרלי. EFXB מודה תמיכה מתכנית נורמה ילדת שוסטר המלגות באוניברסיטת מלבורן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanogen bromide ALDRICH P.No- C91492,CAS-506-68-3 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol SIGMA-ALDRICH P.No M7154, CAS Number 60-24-2 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SIGMA-ALDRICH Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid Merck KGaA K41186564 Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea UNIVAR, AJAX FINECHEM Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE Amresco P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100 SIGMA Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel SIGMA-ALDRICH Catalog Num- P6611 IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized SIGMA-ALDRICH Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator QSONICA S-3000 (discontinued) Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 Bio-Rad Laboratories Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size Agilent Product No: 895150-909 Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels Life Technologies NP0341BOX Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO Thermo Scientific Product No: 87724 Sample dialysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 73 ביולוגיה מבנית כימיה הנדסה כימית ביופיסיקה גנטיקה ביולוגיה מולקולרית חלבונים בממברנה חלבונים מבנה מולקולרי תחום הטרנסממברני כימית פפטיד מבנה חלבון קרום קולטני מערכת חיסון התהפך שלב HPLC HPLC פפטידים שומנים חלבונים שיבוט TFA elution עיכול CNBr NMR ביטוי תרבות תא
מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M.,… More

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M., Krshnan, L., Byrne, E. F. X., Call, M. J., Call, M. E. Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies. J. Vis. Exp. (73), e50141, doi:10.3791/50141 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter