Summary
膜嵌入蛋白结构域之间的相互作用的生物物理和生物化学的研究面临许多技术上的挑战，首先是获得适当的学习材料。本文描述了一种用于生产和纯化二硫键稳定的的跨膜肽复合物，是适合用于结构分析通过溶液的核磁共振（NMR）和其他的分析应用的协议。
Abstract
脂质嵌入的膜蛋白，α-螺旋结构域之间的物理相互作用起着至关重要的作用，在膜蛋白复合体的折叠和装配和跨膜（TM）信令和细胞表面蛋白水平的调节，例如动态过程。了解这些关联的特定序列的结构特点，需要复杂的生物物理和生物化学分析TM肽复合物。然而，TM域的极端疏水性使得它们非常难以操纵使用标准的肽化学技术，生产合适的学习材料常常被证明是令人望而却步具有挑战性的。确定的条件下，肽可以采用稳定的螺旋构象，并形成复合物， 自发地增加了更深一层的难度。在这里，我们提出了一种程序，均聚物或杂二聚体TM肽复合物，从材料的生产是在大肠杆菌中表达的关口，从而允许稳定同位素标签用于核磁共振（NMR）或其他应用程序相对廉价的非天然存在的氨基酸的掺入。在此方法中的关键的创新是作为共价结合 （二硫键交联的）组件改组为洗涤剂，脂质或其他膜-模拟物时，可以形成稳定的，化学计量的和均质的结构，TM配合物的生产和纯化。我们还提出了精心优化的程序也同样适用，无论是生产单TM域或交联复合物的表达和纯化，并提供这些方法来适应新的TM序列的意见。
Introduction
该协议的细节一个过程中，我们已开发生产出二硫键稳定的复合物的跨膜肽（TM）采用溶液NMR结构研究。这个过程需要利用所提供的强大的表达ΔtrpLE1413融合系统（见下文），并允许使用先进的稳定同位素标记技术，现代化的多维NMR实验TM肽复合物的定义组成。我们采用这些技术来确定的NMR结构淋巴细胞活化免疫受体如何从多个膜蛋白亚基组装TM域之间的相互作用（1）最近检讨发现重要的新信息。这些技术适用于许多其他的膜蛋白的系统，以及广泛的下游除了溶液的NMR分析方法。虽然这里给出的例子利用本地的半胱氨酸残基创建一个复杂的，模仿自然的二硫键键合的蛋白，设计是同样适合于创建工程二硫键稳定的复合物，通常是由较弱，均聚物和杂二聚体TM配合物的非共价相互作用，如保持在一起表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白2-4或异源二聚体αβ整合复合物5,6。
非常疏水的肽序列，如那些来自脂质双层跨越TM蛋白的部分是极为困难的课题，生物化学和生物物理研究。除了是非常具有挑战性的操作使用标准的蛋白质和多肽化学技术，他们往往对细胞的毒性，因此难以产生重组。我们7,8和9-11有显着的成功表达这样的困难在细菌的肽序列帧中的羧基端来自大肠杆菌的修改版本的ΔtrpLE1413序列融合到大肠杆菌色氨酸操纵12。 〜13 kDa的trpLE由该序列编码的多肽可以在T7启动子下的高的水平，并产生完全定位于包涵体的问题有关的毒性和/或不稳定的规避。该序列通过加入一种氨基末端9-组氨酸标记13和消除从trpLE序列内部蛋氨酸和半胱氨酸残基，14允许trpLE-肽融合到由金属离子亲和层析法进行纯化和消化使用溴化氰（CNBr改性），以释放所需的肽序列。我们已经成功地使用这个系统来表达更多的十几家不同序列的trpLE融合膜蛋白片段包含多达四个TM域名（7,8和未公布结果;也见讨论部分）。
“在本协议中的关键创新是确定的条件下，其中的的非结构化和难溶trpLE-TM融合可以有效地二硫键交联的背景下，一个精简的工作流程。高收益的表达，处理和纯化的多肽产品的几个方面也得到了彻底的优化，这里提出的建议同样适用于非二硫键交联（单体）TM肽产品的生产。
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Protocol
1。克隆的结构和设计
感兴趣的序列克隆到PMM-肽用HindIII和BamHI限制性位点（参见图1）的载体（可以按要求提供）。按以下顺序：一个HindⅢ位点的双链DNA，插入应纳入CNBr裂解; E 的一个单一的蛋氨酸密码子大肠杆菌密码子优化的编码序列的肽，一个终止密码子，一个BamHⅠ位点。应消除所有其他的肽中的蛋氨酸和二肽序列天冬 - 亲应避免，因为它也可以在酸性条件下裂解。
一个独特的半胱氨酸残基应被引入每个肽序列，根据所需的定位，在最终的复合物的二硫化物交联，和所有其他半胱氨酸应突变为丝氨酸。该质粒携带用于选择卡那霉素抗性盒。
2。表达trpLE-pepti的去融合
- 化妆和无菌过滤器M9/Kan最小的生长培养基中（0.1毫的CaCl 2，2mM的用MgSO 4，3克/升KH 2 PO 4，7.5克/升的Na 2 HPO 4·2H 2 O，0.5克/升的NaCl， 1克/升NH 4 Cl的 ，4的g / L葡萄糖，50mg / L的硫酸卡那霉素）。补充中枢完成A提供B族维生素和微量金属元素：1片溶解在40毫升H 2 O混合30分钟，离心除去不溶物和无菌过滤器的橙色上清锌。在4℃下在黑暗中，长达2个星期，并使用4 ml / L的在M9存储原液。
注：15 N-富集的NH 4 Cl的 ，13 C-富集的葡萄糖或其他稳定的同位素标记的前体可以被包括在M9培养基中，在此阶段，如果需要的话。 - 接种到100毫升的新鲜转化BL21（DE3）菌株E.发酵大肠杆菌中M9/Kan介质。在37℃下生长过夜以200rpm振荡。
- 第二天早晨，检查起动文化的OD 600 -这应该是在2或更大的范围内。稀释到1升中心区补充的M9培养基中的总体积为100毫升发酵。分裂成两个2升的折流板的烧瓶（在每个烧瓶中的500毫升培养），生长于37℃下摇动，在140的转速，直到OD 600达到0.6。
- 振动筛温度设定到18°C，并继续振荡1小时，使文化完全冷却后方可上岗。
- 以诱导前样品进行SDS-PAGE分析（相当于50微升从培养在OD 600 = 1），然后添加IPTG至终浓度0.1mM的诱导表达的trpLE-肽融合。在18°C/140转过夜（16-20小时），在IPTG诱导下继续保持增长。
3。包涵体的制备及镍基绑定
- 在基本培养基上过夜表达培养最终OD 600是可变的，昭民联是在2.5和5.0之间。 SDS-PAGE分析以用样品（相当于50微升从培养物的OD 600 = 1），并以5,000×g离心20分钟收集细胞。
- 来自1 L培养在50ml裂解缓冲液中（50mM的Tris-HCl 20mM的pH为7.5，β-ME，0.2M NaCl）中重悬细胞沉淀。可以冷冻贮存，购买处理的细胞悬浮液。
- 通过超声处理裂解细胞，在冰上在最大输出为1分钟，休息5分钟，在冰上。我们使用Misonix的超声波仪，3000（最大输出功率600瓦），一个半英寸高强度更换的提示。重复为三个周期的超声波处理/冷却。
- 通过离心收集不溶性包含体（IB）的材料，在20,000 xg离心15分钟，并弃去上清液。浅色的细胞碎片松散的，薄层顶部致密的IB丸可以是可见的，这可以使用温和搅拌的水或缓冲液与被冲走。步骤3.3和3.4可重复，以提高纯度的IB部分，如果德斯黎红色。应采取的沉淀和上清材料的样品SDS-PAGE分析，以确认trpLE-TM的融合本土化，包涵体。
- 将IB颗粒溶解在胍溶液（6M的盐酸胍，50mM的pH为8.0的Tris-HCl，200 mM氯化钠，1％的Triton X-100，5mM的β-ME），使用25-50毫升每升培养处理。这一步将需要好几个小时，与搅拌，偶有轻度超声。
- 在75,000-100,000 xg离心1小时和20℃，溶胞产物通过离心清除IB滗析出上清液，通过0.2微米的膜过滤器。
- 联合清零IB裂解液，在50毫升锥形管或更大范围内的可以封闭的容器安全，与镍亲和树脂已与水和平衡到胍溶液洗涤。使用3-4毫升结算的每公升树脂处理文化的融合，表达了类似的程度，，作为trpLE-DAP12TM在这里显示（ 图3，泳道2）。批量绑定孵育过夜房T emperature与温和的混合。
4。列的氧化交联
- IB裂解液/镍树脂悬浮加载到一个空的重力流柱与多孔床的支持，不断增加，直到整个体积流量通过。搜集和整理一边穿过峰，这可能仍包含未绑定的融合蛋白。
- 用5个床体积的含有5mMβ-ME的尿素水溶液（8M尿素，50mM的pH为8.0的Tris-HCl，200mM NaCl的），通过重力流的镍树脂洗净。
- 镍树脂，再与洗净的5个床体积的尿素溶液， 没有 β-ME的。
- 镍洗净树脂用5柱床体积的尿素水溶液，已补充用20μMCuSO 4的氧化型谷胱甘肽和2mM三分之一时间。此冲洗后，关闭柱出口，并在室温下孵育30分钟，以允许最大的二硫键的形成。
5。 TFA洗脱和定量分析
内容“> 注意：三氟乙酸（TFA）导致严重的烧伤与皮肤接触和烟雾有强烈刺激性。集中TFA只应使用经批准的化学通风柜的用眼保护和非乳胶手套。检查所有的化学相容性所用材料，聚丙烯兼容此协议的所有步骤。- 洗出来的氧化剂的尿素溶液与10个床体积的水，并通过施加真空线柱出口干燥柱床。
- 关闭柱出口增加1.5床体积的整齐（99-100％）TFA。搅拌镍树脂与一个小抹刀将确保甚至暴露于酸，孵育5分钟。打开柱出口，收集的酸性洗脱液，轻轻加压如有必要，用注射器或压缩空气管线推所有的液体。
- 重复酸洗脱步骤与1.5床体积的纯TFA。快速工作，在此步骤中，以避免完全溶解的beadeð琼脂糖基质。蛋白质产量可确定在这一点上，按照比尔 - 朗伯方程和理论的trpLE肽序列的摩尔消光系数。稀释的TFA洗脱液（1:20至1:50）的三氟乙醇（TFE）的样品，并测量在280nm处的吸光度，使用TFA / TFE，在相同的稀释作为空白。
6。溴化氰消化
注意：溴化氰（CNBr）是剧毒，只有在经批准的化学通风柜应处理。个人防护装备，包括防护眼镜，实验室外套，非乳胶手套是绝对必要的。溴化氰反应水分，并应提请冷却至室温后再开。请联系您的机构安全办公室中/出售的CNBR污染的解决方案和材料上的说明。
- 通过滴加水稀释到80％的最终的TFA浓度的酸的洗脱液，同时轻轻混合。如果沉淀物的形式，日体积小（0.5〜1毫升）的纯TFA，直至溶液澄清，然后重新正确与水的80％。取5微升预消化的样品进行SDS-PAGE分析，在液氮中冻结，并立即冷冻干燥样品。
- 到约0.2克/毫升，添加的CNBr晶体照顾权衡的有毒化学品的安全封闭的，预先称重的试管中，或使用化学通风柜内部的平衡。轻轻混匀，直至完全溶解。冲洗和惰性气体（氮或氩气流）下密封反应容器中，并在室温下孵育3-4小时，避光。
- 5微升，消化后的样品进行SDS-PAGE分析，并立即冻结和冻干。摘要反应转移用截留分子量为3.5 kDa的或更少的再生纤维素透析盒或管（醋酸纤维素溶解在浓酸），根据预期的肽复合物的大小。透析过夜，4升的水在化学通风柜，以减少的TFA浓度和分解任何未反应的CNBr。留出空间，在透析磁带或管道的量显着增加（高达两到三倍），在透析过夜。
- 取出透析的透析盒或管（大部分蛋白质会析出时，反式脂肪酸的浓度降低）悬浮沉淀的反应溶液和悬浮液转移到50毫升锥形管。冻结并冷冻干燥以除去水和溴化氰/ TFA的痕迹。此步骤是可能需要数天。
注意：透析的消化反应和透析用水应继续被视为有毒适当的预防措施和处理/处置。 - 预诱导和收获阶段，包涵体上清液和沉淀，TFA洗脱液和溴化氰消化的材料的培养的样品可以通过SDS-PAGE分析。准备样品通过加热至95℃，在Invitrogen公司的NuPAGE LDS SAMPLË缓冲区。 TFA洗脱液和消化样品应准备在还原和非还原条件下的氧化交联，以促进产品的识别和评价。
- 分离出的样品在12％的NuPAGE预制双 - 三丙烯酰胺凝胶使用MES-SDS电泳缓冲液为最小的消化产品的最佳分辨率。
7。二硫键交联的肽复合物的反相HPLC纯化
- 溶解冻干消化产品100毫克到2-3毫升整齐甲酸和负载到制备规模（21.2×150毫米）中的Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT端在溶剂A中（通常为10-20％乙腈或5列-10％异丙醇在水中含0.1％TFA）。
- 洗脱梯度的溶剂B（用0.1％TFA的乙腈或异丙醇）中的至少5倍柱体积的摘要产品。建议选择最优梯度条件不同的肽序列进行讨论。
- 采取50-100微升样品从每个HPLC级分的SDS-PAGE分析和冻结并立即冷冻干燥。高效液相色谱法溶剂的去除是快速的，应在1-2小时完成。
- 准备冷冻干燥的HPLC样品进行SDS-PAGE，通过加热至95℃，Invitrogen公司的NuPAGE LDS样品缓冲液中， 与没有还原剂 。冷却，平均每个样品拆分成2个离心管中，加入100 mM的DTT他们重新加热简要之一。
- 分隔的还原和非还原的HPLC样品，在12％的NuPAGE预制双 - 三丙烯酰胺凝胶与MES-SDS运行缓冲液，如上。小，疏水性多肽往往不考马斯染色以及可能无法运行在预期的分子量。然而，还原和非还原的样品相比，应便于识别的交联的肽纯度的产品和评估。
- 分析的候选肽的部分，由基质辅助激光解吸电离飞行时间，飞行（MALDI-F）质谱（见讨论），以确定该物种的利益，并确认其预期的质量。
- 结合，冻结和冻干HPLC含有纯的，交联的TM肽复合物的级分，并采取干重量为最终产物，以确定产量。异丙醇含量高的分数可能不会保持冻结。如果肽级分干燥的膜，而不是一个蓬松的冻干产品，重新溶解膜完全纯的六氟异丙醇（HFIP）的一个小体积中，冻结并再次冻干。的的HFIP过的产品应该是一个小的，白色的圆锥体，轻松放倒，称重。
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Representative Results
trpLE融合实现的表达水平是可变的和严重依赖于连接的肽的氨基酸序列， 图3示出了预诱导的SDS-PAGE分析（泳道1）和时间的收获（泳道2）从文化，取得了约120毫克的纯的，完整trpLE DAP12TM融合从1升的文化和4毫升镍基样品。所有的trpLE DAP12TM融合的定位包涵体的沉淀（泳道4），而不是为上清液（泳道3）。
约70％的镍-纯化trpLE DAP12TM融合是二硫键交联的二聚体形式（ 图3，泳道5和6：非还原和还原样品的TFA洗脱液）。这是一个典型的结果为trpLE DAP12TM融合，但交联效率将随工程半胱氨酸安置。 DAP12TM肽产品是不容易识别的总的CNBr消化样品（泳道7和8）中，但减少消化样品中的完整的融合和trpLE片段带（泳道8）的比较表明，消化的融合的时间是，已完成60％。
图4示出了用反相HPLC分离的摘要产品使用制备规模C3列（总结合容量〜200毫克的蛋白质）。由于融合的芳烃含量是低的，我们通常监测波长为214 nm，而不是280 nm处的吸光度。此运行90mg的氧化，溴化氰消化trpLE DAP12TM融合溶解在3ml整齐甲酸中并加载到100％溶剂A（60％H 2 O，40％乙腈，0.1％TFA）中的列。束缚的产品，在一个两阶段的梯度的0-60％，其次是60-90％溶剂B（75％异丙醇，25％乙腈，0.1％TFA），在10毫升/分钟的流速洗脱。根据SDS-PAGE分析（ 图5）中包含的各组分的产品主要是上面所示的色谱图使用的代码阿西在如图2 gned。在讨论中优化梯度条件，对不同的肽序列的详细信息，请参阅优化的高效液相色谱梯度洗脱 。
肽产品中的SDS-PAGE（ 图5）和MALDI-TOF（ 图6）的主要的HPLC馏分的分析，很容易识别。 DAP12TM肽，根据我们的经验，许多其他的疏水性TM肽，运行显着减少迁移率相比，其预期的分子量（3366道尔顿单体及二聚体为6730道尔顿这里显示的15 N标记的物种）。这种行为是直接相关的凝胶上加载和结果，在一个连续的表观分子量的肽的数量，作为加载的量是变化的（数据未示出）。然而，这在减少用100mM DTT的（比较泳道7和8）时的峰5的电泳迁移率的改变标识作为交联的肽产品。 MALDI-TOF MS分析确认的身份的二聚体肽与主要的峰在6729.2道尔顿，并没有发现其他主要的产品（ 图6）。二硫键交联的纯DAP12TM肽的同型二聚体从该制剂中的最终产量是7.5毫克每升培养。
图1。 trpLE-DAP12TM编码区与它的氨基酸翻译的DNA序列。被高亮显示，并用颜色编码的多肽序列的主要区域的带有标签的右侧。独特的内部蛋氨酸（Met），半胱氨酸（Cys）残基的溴化氰（CNBr）裂解和氧化交联中高亮显示青色和紫色，分别。 HindIII和BamHI酶切位点（粗体和下划线）是唯一的质粒和马可以用来取代TM肽序列与另一序列的权益。
图2。示意图的过程。协议的主要步骤显示文本标签。颜色编码的的trpLE DAP12TM融合的关键环节， 如图1所示 。被标记为从交联和消化步骤的主要多肽产品AF和此处列出了对它们的描述和预期的分子量（15 N-标记的）：[A] trpLE片段：13,769道尔顿; [B]完好trpLE DAP12TM的融合：17,118道尔顿[C]完整的DAP12TM trpLE融合二聚体：34,233道尔顿; [D]单裂trpLE DAP12TM融合二聚体：20,482道尔顿; [E]单体DAP12TM肽：3366道尔顿; [F]的二聚体DAP12TM肽：6730道尔顿。 点击此处查看大图 。
图3。 SDS-PAGE分析，表达，纯化，交联和消化步骤trpLE-DAP12TM。的文化样品（泳道1，诱导前，步骤2.5;泳道2，收获，步骤3.1）和的包涵体准备样品（第3道，上清;车道4，颗粒;步骤3.4），用100 mM DTT减少。 TFA洗脱液镍柱（泳道5和6，步骤6.1）和后的CNBr样品（泳道7和8;步骤6.3）运行非还原（NR）和降低用100mM DTT（R）所示，以确认二硫化交联的产品。 *，单体和二聚体的肽产物的 E 和 F的差可视化进行考马斯染色，因此，未检测到该凝胶。
图4。反相HPLC纯化DAP12TM二硫键交联的二聚体。氧化，溴化氰消化并冻干trpLE DAP12TM融合产品（90毫克）溶解在3毫升甲酸（100％），并装载到采用Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT端（21.2×150mm）柱：溶剂A（60％H 2 O，40％乙腈，0.1％TFA）。一种两阶段的由60-90％溶剂B（75％异丙醇，25％乙腈，0.1％TFA）梯度的0-60％，然后运行在流速为10毫升/分钟，以洗脱结合的产品。馏分收集流过（FT），上面标有4个主要的峰在214nm处的吸光度跟踪（AU：任意联合国它）和各馏分中包含的产品主要是表示使用在图2中的代码分配。所需的DAP12TM交联产物峰的阴影。
图5。非还原SDS-PAGE分析的反相HPLC产品流通过（FT）和峰1样品运行。峰2，3，4个样品同时运行非还原（NR），并减少治疗用100 mM DTT（R），二硫化交联产物的身份进行验证。各馏分的主要产品（用自己的代码分配在图2中），PK1 [FT]： 甲 ，trpLE片段; [峰2]：B，完好trpLE DAP12TM融合单体和C，完好融合二聚体; [PK3]： D，单裂trpLE DAP12单体DAP12TM肽TM二聚体和E，PK4：F，二硫键交联DAP12TM的二聚体。 *如讨论（见代表REULTS），以浓度依赖的流动性使得转变PK3（NR和R）和PK4（R）中的低分子量的产品似乎是不同的分子量，即使这两种产品的单体肽。
图6。 MALDI-TOF质谱分析的HPLC-纯化DAP12TM的肽二聚体。HPLC馏分4的样品（1微升）1:1混合，芥子酸（SA）的矩阵在乙腈中的饱和溶液中，薄薄的一层之上斑点干燥的SA矩阵中的饱和溶液，在乙醇中制备的。 MALDI-TOF分析，揭示了在的预期DAP12TM肽交联二聚体质量的产品6730道尔顿（6729.2098; 15 N标记），以及作为一个小产品3365.7105，最有可能的双离子物种。 点击这里查看大图 。
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Discussion
根据我们的经验， 表达的融合trpLE-TM。trpLE-TM融合低表达丰富的培养基中在37℃下，和这里所描述的培养条件为许多不同的序列，含有一至四个TM域，产率范围已证明是成功的为50〜150 mg / L的纯的，完整的融合。融合编码三-或四-TM G蛋白偶联受体片段（人CCR5 TM1-TM3和TM4-TM7分别）或人类信号肽肽酶（4 TM域;见文献15）的芯催化片段代表在此范围内的最低的表达的水平，而这里所使用的序列表示的范围内的最高端（未发表的数据）密切相关的DAP12TM变种。最佳IPTG浓度应通过实验来确定对于每一个新的序列。我们的标准是0.1毫米，和更高的浓度（高达1毫摩尔），通常会导致产率显着降低，由于两个较低的表达水平和下培养密度吨收获（见参考文献7中例如图1A）。
变化对所提出的协议，该协议概述这里描述二硫键交联的TM肽复合物，8 DAP12TM同型二聚体的生产。可替换地，协议是很容易适合于产生通过省略的两个设计的洗涤步骤以除去还原剂和氧化的的绑定产品（4.3和4.4）的单体肽。我们先前已使用的程序的另一种变化报告在这里产生一个共价键稳定TM肽复合物代表的三聚体 DAP12，DAP12 - NKG2C的TM装置（见参考文献8和其中所描述的方法）。在此应用中，混合培养收获阶段1-TM trpLE DAP12融合和2-TM trpLE-DAP12-NKG2C融合包涵体制备（步骤3.1-3.2）之前。该程序包括一个额外的HPLC步骤孤立的异源二聚体交联trpLE从酸的洗脱液（步骤5.3）的CNBr消化前的融合产物。 C3纯化肽产品导致回收二硫键交联的DAP12TM二聚体，其中一条链进行的NKG2C的的TM域作为一个帧中的C-末端融合。这种复杂的结构，在洗涤剂活性剂胶束的溶液NMR证实，的NKG2C TM域与DAP12组装在其本机，反平行取向8。在本变形例中的额外的步骤，显着减少了最终产品的产率：从4L 1熔接结合用过量的第二，一个典型的制剂，得到8-10毫克的肽“三聚体”。这种变化协议的研究人员希望二硫键稳定的复合物含有两种不同的TM序列是一个良好的开始。
镍亲和纯化上的注意事项，从干燥的镍柱使用浓酸的蛋白质洗脱程序是一个不寻常的，是不适合于重新使用的镍基体。尝试极其疏水trpLE-TM融合使用咪唑或EDTA洗脱导致不完全恢复的蛋白质上的柱（未发表的结果）和交联的种优先保留。推荐量的镍基和夜间批处理约束力的协议，经过精心优化，饱和的矩阵trpLE-TM蛋白，从而最大限度地减少污染物的净化。我们经常在恢复非常纯净的产品，收益率显着超过了广告的Sigma选择镍亲和基质（15-20毫克/毫升树脂）的结合能力。的酸洗脱也消除了所需的中间步骤过渡到溴化氰消化，和交联产物的收率增加超过抵消的镍基体的成本，特别是当标签用昂贵的稳定同位素试剂用于NMR。
溴化氰消化条件。释放稠TM从trpLE在溴化氰肽通常作为溶剂使用70％的甲酸进行，因为反应速率和蛋白质溶解度在这些条件下是非常有利的。然而，治疗时间，必须保持相对短的（根据摘要的为1小时），以避免甲酰基酯化的丝氨酸和苏氨酸残基16,17和可能的I-甲酰化的色氨酸残基18，修改是由质谱作为物种，其观察到的质量检测是28（n）的相对于预期的质量道尔顿。我们倾向于TFA这里描述的完全避免这些修改。酶裂解的trpLE-TM融合Xa因子蛋白酶在1％的Triton X-100已被11日报道，但最trpLE-TM融合和裂解位点的复杂交通不便的洗涤剂胶束的溶解性差，限制的一般效用这种方式。
反相HPLC纯化pepti的溴化氰消化的产品从是最具挑战性的步骤，在此过程中，可能需要为每个新的trpLE-TM序列的优化。以下几点意见来处理许多不同的序列，并有可能为大多数trpLE-TM融合成立：
固定相的选择，我们找到安捷伦ZORBAX稳定债券的的C3列（300Å孔径5微米的颗粒大小），以优越的选择性固定相，解析力和浓酸严重暴露下的稳定性。半制备直径（9.4毫米）和制备规模（21.2毫米直径）尺寸可供选择，并表现非常出色，在我们的手中。 C4，二苯基和氰基固定相还可以提供有用的替代肽相比，在一个类似的疏水性范围内的选择性至C3。
解散整齐的为冻干的溴化氰精华产品摘要产品的制备高效液相色谱法。麦克风酸HPLC分离提供了最好的结果。下游TFA或有机溶剂，如乙腈，三氟乙醇和二甲基甲酰胺常常导致较低溶解度，减少列绑定和/或洗脱的产品，在包含多个物种的宽峰。必须小心，以制备的产品在甲酸中紧接列加载，因为长时间的暴露会导致甲酰基肽侧链的变形例16-18，如上面所讨论的。
优化的HPLC梯度洗脱。我们通常用10-20％的乙腈或5-10％异丙醇的水，用0.1％TFA作为溶剂A. TrpLE-TM融合和摘要的产品溶解在甲酸开始将绑定C3列作为高达40％的乙腈，如下所示（ 图4）。大部分解放区trpLE片段的可流过在这些条件下（ 请注意 ，trpLE片段是唯一的蛋白质产物在FT分数： 图5，泳道1），我们已经利用这种观察的列所需的产品，以增加整体的结合能力。乙腈和异丙醇作为梯度溶剂是非常有效的，并且我们经常通过预先存在的混合溶剂溶液以修改洗脱曲线到达在我们的最终的梯度条件，导致有时奇怪，但有效的配方，如75％的异丙醇，25％乙腈，0.1 ％TFA溶液作为B液使用此处所示的DAP12TM纯化。非常疏水的有问题的产品，已洗脱使用乙腈或异丙醇，加入高达10％的三氟乙醇（TFE）和增加浓度的TFA（最多0.3％）中：A和B（未发表的结果）。其他已报道的良好的效果，用丁醇/乙酸流动相用的碳原子数为4的固定相9。
分析摘要产品。这两种主要的分析技术S用于此处，SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS，可以并发trpLE TM产品极其疏水性质。冻干的CNBr / TFA消化反应和HPLC级分的分析样品从有时运行作为高分子量的聚集体在SDS-PAGE凝胶。我们发现，治疗冻干样品用小体积的HFIP和重新冻干之前制剂进行SDS-PAGE往往补救这个问题。 TM肽序列也可能不容易电离MALDI-TOF MS分析过程中，因此可以给予非常微弱的信号。我们已经使用的优化过程的制备中，芥子酸（SA）在乙醇中的饱和溶液中，第一点上的板和干燥，使均匀的薄层矩阵TM肽样品。的含肽的HPLC级分1:1混合与SA在乙腈中的饱和溶液中，然后将试样干燥后的基体层的顶部上发现。在我们的手中，这一方法2和6倍的更大的信号 - 噪声之间的比较d来发现的肽：SA混合物直接到一个干净的MALDI板。
下游应用领域。重组TM肽复合物，油脂或洗涤剂溶液NMR和其它下游应用系统的方法有很大的不同，通常必须精心定制每一个新的系统和应用程序。因此，一个完整的讨论所涉及的参数范围远远超出了本协议的文章。我们成功的应用解决方案，NMR样品制备的详细信息，请参阅这些评论的话题1,19和参考文献的读者。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作的经费是由国家健康与医学研究委员会，澳大利亚（NHMRC项目赠款1011352 MEC和澳门赛马会，独立研究机构基础设施支援计划IRIISS拨款，以WEHI）和维多利亚州政府（VESKI创新奖学金MEC;维多利亚州政府运营基础设施的支持WEHI）。 MEC是一个英国女王伊丽莎白二世的澳大利亚研究委员会研究员。 EFXB承认，从诺玛·希尔达·舒斯特在墨尔本大学的奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
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