Summary
Biofysiske og biokemiske studier af samspillet mellem membran-embedded proteindomæner står over for mange tekniske udfordringer, hvoraf den første er at opnå passende undersøgelse materiale. I denne artikel beskrives en protokol til fremstilling og oprensning af disulfid-stabiliserede transmembrane peptidkomplekser, der er egnede til strukturel analyse ved opløsning kernemagnetisk resonans (NMR) og andre analytiske anvendelser.
Abstract
Fysiske interaktioner mellem lipid-indlejrede alfa-helikale domæner af membranproteiner spiller en afgørende rolle i foldning og samling af membran-proteinkomplekser og dynamiske processer, såsom transmembran (TM) signalering og regulering af celleoverflade-proteinniveauer. Forståelse af de strukturelle træk køre sammenslutningen af bestemte sekvenser kræver avancerede biofysiske og biokemiske analyser af TM peptidkomplekser. Imidlertid den ekstreme hydrofobicitet TM-domæner gør dem meget vanskelige at håndtere under anvendelse af standard peptid-kemi teknikker, og fremstilling af egnede undersøgelse materiale viser sig ofte uoverkommeligt udfordrende. Identifikation betingelser, hvorunder peptider kan vedtage stabile spiralformede konformationer og danne komplekser spontant tilføjer en yderligere sværhedsgrad. Her præsenteres en fremgangsmåde til fremstilling af homo-eller hetero-dimere TM peptidkomplekser fra materialer, der er udtrykt i E. coli, således at inkorporering af stabile isotoper etiketter til kernemagnetisk resonans (NMR) eller ikke-naturlige aminosyrer til andre anvendelser relativt billigt. Det centrale nyskabelse i denne fremgangsmåde er, at TM-komplekser er fremstillet og oprenset som kovalent forbundet (disulfid-tværbundne) komponenter, der kan danne stabile, støkiometrisk og homogene strukturer efter rekonstitution i detergent, lipid eller andre membran-mimetiske materialer. Vi præsenterer også omhyggeligt optimerede procedurer for ekspression og oprensning, der finder anvendelse, uanset at producere en enkelt TM domæner eller tværbundne komplekser og yde rådgivning til tilpasning af disse metoder til nye TM-sekvenser.
Introduction
Denne protokol detaljer en procedure, vi har udviklet til at producere disulfid-stabiliserede komplekser af transmembrane (TM) peptider til strukturelle undersøgelser med opløsning NMR. Fremgangsmåden udnytter den robuste ekspression ydes af ΔtrpLE1413 fusionssystemet (se nedenfor) og tillader TM peptidkomplekser med defineret sammensætning, der skal genereres ved hjælp af avancerede stabil-isotop mærkningsteknikker til moderne flerdimensionale NMR-forsøg. Vi har ansat disse teknikker til at bestemme flere NMR-strukturer, der afslørede vigtig ny viden om, hvordan lymfocyt-aktiverende immunoreceptors samles fra flere membran proteinunderenheder gennem interaktion blandt deres TM domæner (for nylig revideret i 1). Disse teknikker kan anvendes på mange andre membranprotein-systemer samt en bred vifte af downstream analysemetoder foruden opløsning NMR. Mens eksemplet her anvender native cysteinresterat skabe et kompleks, der efterligner naturligt disulfidbundet protein, designet er lige velegnet til at skabe gensplejsede disulfidbindinger at stabilisere komplekser, der normalt holdes sammen af svagere, ikke-kovalente interaktioner, såsom homo-og hetero-dimere TM komplekser af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)-familie-proteiner 2-4 eller heterodimere αβ integrinreceptorer komplekser 5,6.
Ekstremt hydrofobe peptidsekvenser, såsom dem afledt af lipiddobbeltlaget-spænder over dele af TM-proteiner er overordentlig vanskelige emner for biokemiske og biofysiske undersøgelser. Ud over at være meget udfordrende at manipulere under anvendelse af standard protein og peptidkemi teknikker, er de ofte ganske toksisk for celler og er derfor svære at producere rekombinant. Vi 7,8 og andre 9-11 har haft betydelig succes udtrykker så vanskelige peptidsekvenser i bakterier som i ramme carboxyterminalefusioner til en modificeret version af ΔtrpLE1413 sekvens afledt af E. coli trp-operonen 12. De ~ 13 kDa TrpLE polypeptid, der kodes af denne sekvens kan produceres i høje niveauer under en T7-promotor og udelukkende lokaliseret til inklusionslegemer, hvor problemer i forbindelse med toksicitet og / eller ustabilitet omgås. Modifikation af sekvensen ved tilsætning af en aminoterminal 9-histidin-tag 13 og fjernelse af indre methionin og cystein rester fra TrpLE sekvens 14 tilladt TrpLE-peptidfusioner skal renses ved metal-ion-affinitetskromatografi og fordøjet med cyanogenbromid (CNBr ) for at frigøre den ønskede peptidsekvens. Vi har med succes brugt dette system til at udtrykke mere end et dusin forskellige sekvenser som TrpLE fusioner, der repræsenterer membran proteinfragmenter, der indeholder så mange som fire TM-domæner (7,8 og upublicerede resultater, se også DISKUSSION afsnit).
Dennøgle innovation i denne protokol er identificering af betingelser, hvorunder de ustrukturerede og meget dårligt opløselige TrpLE-TM fusioner kan være effektivt disulfid-tværbundet i forbindelse med et strømlinet workflow. Flere aspekter af high-yield udtryk, håndtering og rensning af peptid produkter er også blevet grundigt optimeret, og de anbefalinger, der præsenteres her, er lige så relevant for produktion af ikke-disulfid-tværbundne (monomere) TM peptid produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og Construct Design
Klon sekvenserne af interesse i pMM-peptid vektor (som kan være tilvejebragt på anmodning) under anvendelse af HindIII-og BamHI-restriktionssteder (se figur 1). Den dobbeltstrengede DNA insert bør, i følgende rækkefølge: et HindIII-sted, et enkelt methioninkodon til CNBr-spaltning; E. coli kodon-optimeret peptid-kodende sekvens, en stopkodon, et BamHI-sted. Alle andre methioniner i peptidet bør fjernes og dipeptidet sekvensen Asp-Pro bør undgås, da det også vil spaltes under sure betingelser.
En unik cysteinrest bør indføres i hver peptidsekvens ifølge den ønskede placering af disulfid-krydsbindinger i det endelige kompleks, og alle andre cysteiner bør muteret til serin. Plasmidet bærer et kanamycinresistens kassette til selektion.
2. Ekspression af TrpLE-peptide Fusion
- Der fyldes op og sterilt filter M9/Kan minimal vækst-medium (0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / l NaCl, 1 g / L NH4CI, 4 g / L glucose, 50 mg / L kanamycin sulfate). Supplér med Centrum Complete A til Zink til at give B-vitaminer og spormetaller: Opløs 1 tablet i 40 ml H 2 O med blanding i 30 min, centrifuge at fjerne uopløseligt materiale og sterilt filter den orange supernatant. Store stamopløsning ved 4 ° C i mørke i op til 2 uger og anvende 4 ml / L i M9.
BEMÆRK: 15 N-beriget NH4CI, 13C-beriget glucose eller andre stabil-isotop-mærkede precursorer kan indbefattes i M9 medium på dette tidspunkt om ønsket. - Inokulere en 100 ml starterkultur fra frisk transformerede BL21 (DE3)-stammen E. coli i M9/Kan medium. Dyrk natten over ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm.
- Den næste morgen, kontrollere OD600 af starterkulturen - dette bør være i området fra 2 eller større. Fortynd 100 ml starterkultur i 1 l samlede Centrum-suppleret M9-medium. Opdelt i to 2 L ledeplader kolber (500 ml kultur i hver kolbe) og vokse ved 37 ° C under omrystning ved 140 rpm, indtil OD600 når 0,6.
- Indstil shaker temperaturen til 18 ° C og fortsæt rystning i 1 time, så kulturer køle helt før induktion.
- Tag en præ-induktion prøve til SDS-PAGE analyse (svarende til 50 ul fra en kultur ved OD600 = 1), hvorefter der tilsættes IPTG til 0,1 mM slutkoncentration at inducere ekspression af TrpLE-peptid-fusion. Fortsætte væksten ved 18 ° C/140 rpm natten over (16-20 timer) under IPTG induktion.
3. Inklusion Krop Forberedelse og Nickel Matrix Binding
- Den endelige OD 600 af overnattende udtryk kulturer i minimalmedium er variabel og should være mellem 2,5 og 5,0. Tag en prøve til SDS-PAGE analyse (svarende til 50 ul fra en kultur ved OD600 = 1) og opsamles cellerne ved centrifugering i 20 minutter ved 5000 x g.
- Resuspender cellepellet fra 1 L kultur i 50 ml lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Cellesuspensioner kan opbevares frosset til senere behandling.
- Lysere cellerne ved sonikering på is med maksimal ydelse i 1 min og hvile på is i 5 min. Vi bruger en Misonix Sonicator 3000 (maks. effekt 600 watt) med en ½-tommer med høj intensitet udskiftelig spids. Gentag lydbehandling / køling i tre cyklusser.
- Collect uopløseligt inklusionslegeme (IB) materiale ved centrifugering i 15 minutter ved 20.000 x g og kassér supematanten. En løs, tyndt lag af lysere farvede cellerester kan være synlige på toppen af den tætte IB pellet, hvilket kan vaskes væk med vand eller buffer med forsigtig omrøring. Trin 3.3 og 3.4 kan gentages for at forbedre renheden af IB fraktion er desired. Prøver af pellet og supernatant materiale bør tages for SDS-PAGE analyse for at bekræfte TrpLE-TM fusion lokalisering til inklusionslegemer.
- Opløs IB pellets i guanidin opløsning (6 M guanidin HCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 200 mM NaCI, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME) ved anvendelse af 25-50 ml pr forarbejdet liter kultur. Dette skridt vil kræve flere timer med omrøring og lejlighedsvis mild lydbehandling.
- Rydde IB lysatet ved centrifugering i 1 time ved 75,000-100,000 x g og 20 ° C. Dekanteres og filtreres gennem et 0,2 um membran.
- Kombiner ryddet IB lysat i en 50 ml konisk rør eller et større fartøj, der kan lukkes sikkert, med nikkel affinitetsharpiks, der er blevet vasket med vand og ækvilibreret med guanidin opløsning. Brug 3-4 ml fast harpiks per liter kultur forarbejdet til fusioner, der udtrykker i samme grad som TrpLE-DAP12TM vist her (figur 3, bane 2). Batch binder ved inkubering natten over ved room t emperatur under forsigtig blanding.
4. I kolonnen Oxidativ Tværbinding
- Indlæs IB lysatet / nikkel harpiks suspension i en tom tyngdekraft flow kolonne med porøst bed support, tilføjer, indtil hele mængden strømmer igennem. Indsamle og lægge den gennemstrømning, som stadig kan indeholde ubundne fusionsprotein.
- Vask nikkel harpiksen ved tyngdestrømning med 5 søjlevolumener urinstofopløsning (8 M urinstof, 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 200 mM NaCI) indeholdende 5 mM β-ME.
- Vask nikkel harpiksen igen med 5 søjlevolumener urinstofopløsning uden β-ME.
- Vask nikkel harpiks en tredje gang med 5 søjlevolumener af urinstofopløsning, der er blevet suppleret med 20 pM CuSO4 og 2 mM oxideret glutathion. Efter denne vask, lukker søjlen udløb og inkuber 30 minutter ved stuetemperatur for at tillade maksimal dannelse af disulfidbindinger.
5. TFA Eluering og kvantificering
indhold "> FORSIGTIG: Trifluoreddikesyre (TFA) forårsager alvorlige forbrændinger ved kontakt med huden og dampe er meget irriterende Koncentreret TFA bør kun anvendes i et godkendt kemisk stinkskab med øjenbeskyttelse og ikke-latex handsker Kontrollér den kemiske kompatibilitet af alle.. materialer, der anvendes, polypropylen er kompatibel med alle trin i denne protokol.- Udvaske oxiderende urinstofopløsning med 10 lejevolumener vand og tør søjlelaget ved at anvende en vakuumledning til søjlen udløb.
- Luk søjlen udløb, og der tilsættes 1,5 lejevolumener ren (99-100%) TFA. Omrøres nikkel harpiks med en lille spatel for at sikre ensartet eksponering for syre og inkuberes i 5 min. Åbn søjlen udløb og opsamle den syre eluatet, tryksætning forsigtigt med en sprøjte eller trykluftledning om nødvendigt at skubbe al væsken.
- Gentag syre-elueringstrin med yderligere 1,5 lejevolumener ren TFA. Arbejd hurtigt på dette trin for at undgå fuldstændig opløsning af beaded agarosematrix. Proteinudbytte kan bestemmes på dette tidspunkt efter Lambert-Beers ligningen og den teoretiske molære ekstinktionskoefficient af TrpLE-peptidsekvens. Fortynd en prøve af TFA eluatet (1:20 til 01:50) i trifluorethanol (TFE) og absorbansen måles ved 280 nm under anvendelse af TFA / TFE med den samme fortynding som blindprøve.
6. CNBr Fordøjelse
FORSIGTIG: Cyanogenbromid (CNBr) er ekstremt giftigt og bør kun håndteres i et godkendt stinkskab. PV herunder sikkerhedsbriller, laboratoriekittel og ikke-latex handsker er absolut påkrævet. CNBr er reaktiv over for fugt og skal bringes til stuetemperatur før åbning. Kontakt din institutionelle sikkerhed kontor for vejledning om neutralisering / salg af CNBr-forurenede løsninger og materialer.
- Fortynd den sure eluat til 80% endelig TFA koncentration ved dråbevis tilsætning af vand under blanding forsigtigt. Dannes der bundfald, endd tilbage et lille volumen (0,5-1 ml) af ren TFA indtil opløsningen bliver klar, og derefter igen korrekt til 80% med vand. Tag en 5 pi præ-digest prøve til SDS-PAGE analyse, frysning i flydende nitrogen og lyofilisering prøven øjeblikkeligt.
- Tilføj CNBr krystaller til omkring 0,2 g / ml, idet man veje det giftige kemikalie sikkert i lukkede, forudvejet rør eller bruge en balance inde i stinkskab. Bland forsigtigt indtil helt opløst. Skylle og forsegle reaktionsbeholderen under inert gas (nitrogen eller argon stream) og inkuber 3-4 timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Tag en 5 pi post-digest prøve til SDS-PAGE analyse og fryses og lyofiliseres omgående. Overfør fordøje reaktion på en regenereret cellulose dialyse kassette eller slange (celluloseacetat vil opløses i koncentreret syre) med en molekylvægtafskæring på 3,5 kDa eller mindre, afhængigt af det forventede peptid-kompleks. Dialyseres natten over til 4 l vand istinkskab for at reducere TFA koncentration og dekomponere ethvert uomsat CNBr. Efterlad plads i dialyse kassette eller rør til en betydelig stigning i volumen (så meget som to til tre gange) under dialyse natten over.
- Fjern den dialyserede reaktionsopløsning med suspenderede præcipitat fra dialyse kassette eller rør (meste af proteinet udfældes, når TFA koncentrationen er reduceret) og overfør suspensionen til 50 ml koniske rør. Fryses og lyofiliseres til fjernelse af vand og spor af CNBr / TFA. Dette trin vil sandsynligvis kræve flere dage.
FORSIGTIG: Både dialyserede digest reaktion og dialyse vand bør fortsat behandles som giftige og håndteres / bortskaffes med passende forholdsregler. - Prøver af kulturer fra før induktion og høst faser, inklusionslegeme supernatanten og pelleten, TFA eluatet og CNBr-spaltet materiale kan analyseres ved SDS-PAGE. Fremstille prøver ved opvarmning til 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS sample puffer. TFA eluat og fordøje prøver skal fremstilles i både reducerende og ikke-reducerende betingelser for at lette produkt identifikation og evaluering af oxidativ tværbinding.
- Adskille prøverne på en 12% NuPAGE Bis-Tris pre-cast acrylamidgel anvendelse af MES-SDS løbebuffer for optimal opløsning af de mindste fordøje produkter.
7. Omvendt fase-HPLC-oprensning af disulfid-tværbundne peptidkomplekser
- Opløs op til 100 mg lyofiliserede fordøje produkter i 2-3 ml ren myresyre og belastning på en præparativ-skala (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT kolonne i opløsningsmiddel A (typisk 10-20% acetonitril eller 5 -10% isopropanol i vand med 0,1% TFA).
- Elueres fordøje produkter i en gradient af opløsningsmiddel B (acetonitril eller isopropanol med 0,1% TFA) i løbet af mindst 5 søjlevolumener. Se diskussion for forslag om valg af optimale gradient betingelserne for forskellige peptidsekvenser.
- Tag50-100 ul prøver fra hver HPLC-fraktion til SDS-PAGE analyse og fryses og lyofiliseres omgående. Fjernelse af HPLC opløsningsmidler er hurtig og skal være komplet i 1-2 timer.
- Fremstille lyofiliserede HPLC-prøver for SDS-PAGE ved opvarmning til 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS prøvebuffer uden reduktionsmiddel. Køl og opdele hver prøve jævnt i 2 mikrocentrifugerør, tilsætning af 100 mM DTT til en af dem, og genopvarmning kortvarigt.
- Adskil de reducerede og ikke-reducerede prøver HPLC på en 12% NuPAGE Bis-Tris pre-cast acrylamidgel med MES-SDS løbebuffer som ovenfor. Små, hydrofobe peptider ofte ikke tage op Coomassie pletten godt og kan ikke køre på deres forventede molekylvægte. Imidlertid bør sammenligning af reducerede og ikke-reducerede prøver lette identifikationen af de tværbundne peptidprodukter og vurdering af renheden.
- Analyser ansøgerlandene peptid-holdige fraktioner ved matrix-assisteret laser desorption ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri (se diskussionen) for at identificere de arter af interesse og bekræfte dens forventede masse.
- Kombiner, fryses og lyofiliseres HPLC-fraktioner indeholdt det rene, tværbundne TM peptid kompleks og tage en tørvægt af slutproduktet for at bestemme udbyttet. Fraktioner med højt isopropanol indhold kan ikke forblive frosne. Hvis peptidfraktioner tørre ned til en film i stedet for et fnugget lyofiliseret produkt, genopløses filmen fuldstændigt i et lille volumen af ren hexafluorisopropanol (HFIP), fryses og lyofiliseres igen. Den HFIP-behandlede produkt burde være en lille, hvid kegle, der er let vippes ud og vejet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Niveauet af ekspression opnået for TrpLE fusioner er variabel og stærkt afhængig af den aminosyresekvens i vedlagte peptid. Figur 3 viser SDS-PAGE analyse af præ-induktion (bane 1) og time-of-høst (bane 2) prøver fra en kultur, der gav cirka 120 mg ren, intakt TrpLE-DAP12TM fusion fra 1 liter kultur og 4 ml nikkelmatrixen. Alle de TrpLE-DAP12TM fusionen blev lokaliseret til inklusionslegeme pellet (bane 4) i modsætning til supernatant (bane 3).
70% af den nikkel-oprenset TrpLE-DAP12TM fusion var disulfid-tværbundet til den dimere form (fig. 3, bane 5 og 6: ikke-reducerede og reducerede prøver af TFA eluat). Dette er et typisk resultat for TrpLE-DAP12TM fusion, men tværbinding effektiviteten vil variere med placering af gensplejsede cysteiner. De DAP12TM peptid produkter er ikke let identificerbare i alt CNBr fordøje prøver (bane 7 og 8),men sammenligning af det intakte fusionsprotein og TrpLE fragment bands i den reducerede digest prøve (bane 8) viser, at spaltning af fusionsproteinet var ~ 60% komplet.
Figur 4 viser adskillelsen af fordøje produkter ved omvendt fase HPLC under anvendelse af en præparativ-skala C3-søjle (total binding kapacitet ~ 200 mg protein). Idet indholdet af aromater af fusionsproteinet er lav vi typisk overvåge absorbansen ved 214 nm i stedet for 280 nm. Til denne kørsel 90 mg oxideret, blev CNBr-spaltet TrpLE-DAP12TM fusion opløst i 3 ml ren myresyre og fyldt på søjlen i 100% opløsningsmiddel A (60% H2O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). Bundne produkter blev elueret i en totrins gradient af 0-60%, efterfulgt af 60-90% opløsningsmiddel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) ved en strømningshastighed på 10 ml / min. De vigtigste produkter indeholdt i hver fraktion efter SDS-PAGE analyse (figur 5) er angivet over kromatogrammet ved hjælp af koderne assigned i figur 2. Se Optimering af HPLC gradienteluering i diskussionen afsnit for yderligere oplysninger om optimering gradientbetingelser for forskellige peptidsekvenser.
Peptidprodukter let kan identificeres i SDS-PAGE (figur 5) og MALDI-TOF (figur 6) analyser af de største HPLC-fraktioner. DAP12TM peptider og i vores erfaring, at mange andre hydrofobe TM peptider, køre med signifikant reducerede vandringshastigheder i forhold til deres forventede molekylvægte (3366 Dalton monomer og 6730 Dalton dimer for de 15 N-mærkede arter er vist her). Denne opførsel er direkte relateret til mængden af peptid på geleen og resulterer i et kontinuum af tilsyneladende molekylvægte som det ilagte mængde varieres (data ikke vist). Imidlertid ændring i elektroforetisk mobilitet af top 5 ved reduktion med 100 mM DTT (sammenlign bane 7 og 8) identificerer dette som den krydsbundne peptidprodukt. MALDI-TOF MS analyse bekræfter identiteten af den dimere peptidet med den store top ved 6729,2 Dalton og afslører ingen andre større produkter (figur 6). Det endelige udbytte af rent disulfid-tværbundet DAP12TM peptid homodimer fra dette præparat var 7,5 mg pr liter kultur.
Figur 1. DNA-sekvensen af TrpLE-DAP12TM kodende region med aminosyretranslation. Centrale regioner i polypeptidsekvensen er fremhævet og farvekodede med etiketter til højre. De unikke interne methionin (Met) og cystein (Cys) rester for cyanogenbromid (CNBr) spaltning og oxidativ tværbinding er fremhævet med cyan og lilla hhv. HindIII-og BamHI-restriktionssteder (fed og understreget) er unikke i plasmidet og may anvendes til at erstatte den TM peptid-sekvens med en anden sekvens af interesse.
Figur 2. Skematisk diagram af proceduren. De vigtigste trin i protokollen er angivet i tekstetiketter. Vigtige dele af TrpLE-DAP12TM fusion er farvekodede som i figur 1. Større polypeptidprodukter produkter fra tværbindingen og fordøje skridt er mærket AF og er vist her med deres beskrivelse og forventede molekylvægte (15 N-mærket): [A] TrpLE fragment: 13.769 Daltons, [B] intakt TrpLE-DAP12TM Fusion: 17.118 Daltons , [C] intakt TrpLE-DAP12TM fusion dimer: 34.233 Dalton, [D] single-kløvet TrpLE-DAP12TM fusion dimer: 20.482 Dalton, [E] monomert DAP12TM peptid: 3366 Dalton, [F] dimert DAP12TM peptid: 6730 Dalton. Klik her for at se større figur .
Figur 3. SDS-PAGE-analyse af TrpLE-DAP12TM ekspression, oprensning, tværbinding og digest trin Kulturprøver (bane 1, forud for induktion, trin 2,5, bane 2, høst, trin 3.1). Og inklusionslegeme prep prøver (bane 3, supernatant; lane 4, pellet, trin 3.4) blev reduceret med 100 mM DTT. TFA eluat fra nikkel-søjle (bane 5 og 6, trin 6.1) og efter CNBr prøve (bane 7 og 8, trin 6.3) blev kørt ikke-reducerede (NR) og reduceres med 100 mM DTT (R) som anført for at bekræfte disulfid-tværbundne produkter. * Monomert og dimert peptidprodukts E og F er dårligt visualiseret ved Coomassie-farvning og derfor ikke påvises i denne gel.
Figur 4. Omvendt fase-HPLC-oprensning af DAP12TM disulfid-tværbundet dimer. Oxideret, CNBr-spaltet og lyofiliseret TrpLE-DAP12TM fusionsprodukter (90 mg) blev opløst i 3 ml myresyre (100%) og fyldt på en Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) søjle i opløsningsmiddel A (60% H2O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). En totrins gradient af 0-60%, efterfulgt af 60-90% opløsningsmiddel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) blev kørt ved en flowhastighed på 10 ml / min til eluering af bundne produkter. Fraktioner opsamles som flow-through (FT) og fire store toppe er markeret over 214 nm absorbans trace (AU: vilkårlig undens) og de vigtigste produkter indeholdt i hver fraktion er vist ved hjælp af de koder tildelt i figur 2. Det ønskede DAP12TM tværbundet produkt højdepunkt er nedtonet.
Figur 5. SDS-PAGE-analyse af omvendt fase-HPLC produkter. Flow-through (FT) og top 1 prøver blev kørt ikke-reducerede. Peak 2, 3 og 4 prøver blev kørt både ikke-reducerende (NR) og reduceres ved behandling med 100 mM DTT (R) til at verificere identiteten af disulfid tværbundne produkter. De vigtigste produkter i hver fraktion (med deres koder tildelt i figur 2) var [FT, PK1]: A, TrpLE fragment; [PK2]: B, intakte TrpLE-DAP12TM fusion monomer og C, intakte fusionsprotein dimer, [PK3]: D, single-kløvet TrpLE-DAP12TM dimer og E, monomer DAP12TM peptid; [PK4]: F, disulfid-tværbundet DAP12TM dimer. * Som beskrevet (se REPRÆSENTATIVE reults), en koncentrationsafhængig skift i mobilitet gør med lav MW produkter i PK3 (NR og R) og PK4 (R) synes at være forskellige molekylvægte, selvom begge produkter er monomere peptid.
Figur 6. MALDI-TOF massespektrometrianalyse af HPLC-oprensede DAP12TM peptid-dimer. En prøve af HPLC-fraktion 4 (1 pi) blev blandet 1:1 med en mættet opløsning af sinapininsyre (SA) matrix i acetonitril og plettet oven på et tyndt lag tørret SA matrix fra en mættet opløsning fremstilles i ethanol. MALDI-TOF analyse afslører et produkt med den forventede DAP12TM peptid tværbundet dimer masseaf 6730 dalton (6729,2098, 15 N-mærket) samt et mindre produkt på 3365,7105, mest sandsynligt den dobbelt-ioniserede arter. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekspression af TrpLE-TM fusioner. Er vores erfaring, er TrpLE-TM fusioner dårligt udtrykt i rigt kultur medium ved 37 ° C, og dyrkningsbetingelser beskrevet her, har vist sig gode til mange forskellige sekvenser, der indeholder 1-4 TM domæner med udbytter spænder 50 til 150 mg / L af ren, intakt fusionsprotein. Fusions koder for tre-eller fire-TM GPCR-fragmenter (human CCR5 TM1-TM3 og TM4-TM7, henholdsvis) eller en kerne katalytisk fragment af human signalpeptid peptidase (fire TM-domæner, se ref 15) repræsenterer de laveste i denne serie af ekspression niveauer, mens DAP12TM varianter er nært beslægtet med sekvensen anvendt her, repræsenterer den højeste ende af intervallet (upublicerede data). Den optimale IPTG koncentration bør bestemmes eksperimentelt for hver ny sekvens. Vores standard er 0,1 mM, og højere koncentrationer (op til 1 mM) sædvanligvis resultere i betydeligt reduceret udbytte som følge af både lavere ekspressionsniveauer og lavere kultur tæthed ent høst (se for eksempel figur 1A i reference 7).
Variationer på præsenterede protokol. Protokollen beskrevet her beskriver fremstillingen af et disulfid-tværbundet TM peptid-kompleks, i DAP12TM homodimer 8. Alternativt protokollen let tilpasses til at producere monomere peptider ved at udelade de to vasketrin beregnet til at fjerne reduktionsmiddel og oxidere de bundne produkter (4.3 og 4.4). Vi har tidligere anvendt en anden variation af fremgangsmåden beskrevet her til frembringelse af en kovalent stabiliseret TM peptid-kompleks, der repræsenterer det trimere DAP12-DAP12-NKG2C TM igen (se reference 8 og fremgangsmåderne beskrevet heri). I denne ansøgning, blev en 1-TM TrpLE-DAP12 fusion og en 2-TM TrpLE-DAP12-NKG2C fusion blandes i kulturen høsten fase før inklusionslegeme præparat (trin 3,1-3,2). Proceduren omfattede en ekstra HPLC trin til isolering af det heterodimere tværbundet TrpLEfusionsprodukt fra syren eluatet (trin 5.3) før CNBr digest. C3 oprensning af de peptidprodukter resulterede i udvinding af et disulfid-tværbundet DAP12TM dimer, hvor én streng bar NKG2C TM domænet som en in-frame C-terminal fusion. Opløsningen NMR struktur af dette kompleks i detergent-miceller bekræftet, at NKG2C TM domænet samlet med DAP12 i dets native, anti-parallel orientering 8. De ekstra trin i denne variation væsentligt reduceret udbyttet af det endelige produkt: et typisk præparat gav 8-10 mg peptid "trimer" fra 4L af en fusion kombineret med et overskud af den anden. Denne variation er et godt udgangspunkt protokol for forskere, der ønsker at producere disulfid-stabiliserede komplekser, der indeholder to forskellige TM sekvenser.
Noter på nikkel-affinitetsoprensning. Elueringen af proteinet fra den tørrede nikkel søjle ved anvendelse af koncentreret syre er en usædvanlig procedure, og er ikke egnet til at re-Anvendelse af nikkelmatrixen. Forsøg på at eluere særdeles hydrofobe TrpLE-TM-fusioner med imidazol eller EDTA resulterede i ufuldstændig udvinding af protein og de tværbundne arter fortrinsvis tilbageholdt på søjlen (upublicerede resultater). Den anbefalede mængde nikkel matrix og den overnight batch-bindende protokol er blevet omhyggeligt optimeret til at mætte matrixen med TrpLE-TM-protein og derved minimere co-oprensning af kontaminanter. Vi rutinemæssigt inddrive meget rene produkter med udbytter, der væsentligt overstiger den annoncerede bindingskapacitet af Sigma HIS-Select Nickel affinitetsmatrix (15-20 mg / ml harpiks). Den sure eluering eliminerer også mellemliggende skridt til at gå ind i den CNBr fordøje, og den øgede udbytte af tværbundne produkter mere end opvejer udgifterne til nikkelmatrixen, især når mærkning med dyre stabil-isotop reagenser til NMR.
Cyanogenbromid fordøje forhold. Frigivelse af dekondenserede TM peptider fra TrpLE i CNBr er almindeligvis udført under anvendelse af 70% myresyre som opløsningsmidlet, fordi både reaktionshastigheden og proteinopløselighed er meget gunstige under disse betingelser. Imidlertid skal behandlingstider holdes forholdsvis kort (under 1 time for fordøjelse) for at undgå formyl esterificering af serin-og threoninrester 16,17 og muligvis I-formylering af tryptophanrester 18, modifikationer, som kan påvises ved massespektrometri som arter, hvis observerede masse er 28 (n) Dalton i forhold til den forventede masse. Vores præference for TFA som beskrevet her undgås disse modifikationer helt. Enzymatisk spaltning af et TrpLE-TM fusion med faktor Xa protease i 1% Triton X-100 er blevet rapporteret 11, men den dårlige opløselighed af de fleste TrpLE-TM-fusioner og komplikationen med spaltningssted utilgængelighed i detergent-miceller formodentlig begrænser den generelle anvendelighed af denne fremgangsmåde.
Omvendt fase-HPLC-oprensning af peptide produkter fra CNBr digest er det mest udfordrende skridt i denne procedure, og sandsynligvis vil kræve optimering for hver ny TrpLE-TM sekvens. De følgende bemærkninger kommer fra forarbejdning af mange forskellige sekvenser og vil sandsynligvis gælde for de fleste TrpLE-TM fusioner:
Udvælgelse af stationær fase Vi finder Agilent Zorbax Stable Bond-C3-søjler (300 Å porestørrelse, 5 um partikelstørrelse). At være en overlegen stationær fase med hensyn til selektivitet, opløsningsevne og stabilitet under kraftig eksponering for koncentreret syre. Semi-præparative (9,4 mm i diameter) og præparativ-skala (21,2 mm diameter) størrelser er tilgængelige, og har klaret sig rigtig godt i vores hænder. C4, diphenyl og cyanopropyl stationære faser kan også give nyttig alternativ peptid selektivitet på lignende hydrofobicitet rækkevidde sammenlignet med C3.
Fremstilling af digest produkter til HPLC. Opløsning af frysetørrede CNBr fordøje produkter i sirlige formic syre giver de bedste resultater for HPLC separation. Præparat i TFA eller organiske opløsningsmidler, såsom acetonitril, trifluorethanol og dimethylformamid ofte resulterer i lavere opløselighed, reduceret kolonne binding og / eller eluering af produkter i brede toppe, der indeholder flere arter. Må drages omsorg for at fremstille produkter i myresyre umiddelbart før kolonnen loading fordi langvarig eksponering kan resultere i formyl modifikation af peptid-sidekæder 16-18 som beskrevet ovenfor.
Optimering af HPLC gradienteluering. Vi begynder normalt med 10-20% acetonitril eller 5-10% isopropanol i vand med 0,1% TFA som opløsningsmiddel A. TrpLE-TM-fusioner og deres fordøje stoffer opløst i myresyre vil binde C3 kolonnen som op til 40% acetonitril som vist her (fig. 4). En stor del af den frigjorte TrpLE fragmentet kan strømme igennem under disse betingelser (Bemærk, at TrpLE fragment er det eneste proteinprodukt i FTfraktion: figur 5, bane 1), og vi har draget fordel af denne observation at øge den samlede bindingskapacitet af søjlen for de ønskede produkter. Acetonitril og isopropanol er meget effektive som gradient opløsningsmidler, og vi ofte ankommer til vores endelige gradientbetingelser ved blanding af allerede eksisterende opløsningsmiddelopløsninger at ændre elueringsprofiler, hvilket resulterer i nogle ulige men effektive opskrifter såsom 75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1 % TFA-opløsning anvendes som opløsning B for DAP12TM oprensning vist her. Ekstremt hydrofobe produkter, der var problematisk er elueret med acetonitril eller isopropanol med tilsætning af op til 10% trifluorethanol (TFE) og forøgede koncentrationer af TFA (op til 0,3%) i både A og B (upublicerede resultater). Andre har rapporteret gode resultater med butanol / eddikesyre mobile faser med en C4 stationær fase 9.
Analyse af fordøje produkter. Begge de store analysetekniks bruges her, SDS-PAGE og MALDI-TOF MS, kan kompliceres af ekstremt hydrofobe natur af TrpLE-TM produkter. Lyofiliserede analyseprøver fra CNBr / TFA fordøje reaktioner og HPLC-fraktioner sommetider som høj-molekylvægt aggregater på SDS-PAGE geler. Vi finder, at behandling af lyofiliserede prøver med en lille mængde HFIP og re-lyofilisering før forberedelse til SDS-PAGE ofte afhjælper dette problem. TM peptidsekvenser også ikke umiddelbart ionisere i løbet af MALDI-TOF MS-analyse, og kan derfor give meget svage signaler. Vi har anvendt en optimeret fremgangsmåde til fremstilling af TM-peptid-prøver, hvori en mættet opløsning af sinapininsyre (SA) i ethanol først spottet på pladen og tørres for at fremstille en ensartet tyndt lag matrix. En prøve af peptid-indeholdende HPLC-fraktion blandet 1:1 med en mættet opløsning af SA i acetonitril derefter spottet på toppen af den tørrede matrixlaget. I vore hænder, sammenlign Denne metode giver mellem to og seks gange større signal-støj-d for pletter peptidet: SA blandingen direkte på en ren MALDI plade.
Downstream applikationer. Metoder til rekonstituering TM peptidkomplekser i lipid eller rengøringsmiddel systemer til løsning NMR og andre downstream-applikationer varierer meget, og skal normalt omhyggeligt skræddersyet til hver ny system og applikation. En fuldstændig beskrivelse af de involverede parametre er derfor langt uden for rammerne af denne protokol artikel. For nærmere oplysninger om prøveforberedelse fra succesfulde programmer ved hjælp af opløsning NMR, henviser vi læseren til disse seneste anmeldelser om emnet 1,19 og referencer deri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansieringen af dette arbejde er tilvejebragt af National Sundhed og Medical Research Council i Australien (NHMRC projekttilskud 1.011.352 til MEC og MJC, uafhængige forskningsinstitutter Infrastruktur Support Scheme [IRIISS] tilskud til WEHI) og den victorianske regering (Veski Innovation Fellowship til MEC; Victorian statens regering Operationel Infrastructure Support til WEHI). MEC er en dronning Elizabeth II Fellow af Australian Research Council. EFXB anerkender støtte fra Norma Hilda Schuster Scholarship Program ved University of Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
