Summary
Biofysiske og biokjemiske studier av samspill mellom membran-innebygde protein domener står overfor mange tekniske utfordringer, hvorav den første er å skaffe riktig studie materiale. Denne artikkelen beskriver en protokoll for fremstilling og rensing av disulfid-stabiliserte transmembrane peptid komplekser som er egnet for strukturell analyse av oppløsning nukleær magnetisk resonans (NMR) og andre analytiske programmer.
Abstract
Fysiske samspill mellom lipid-innebygde alpha-helical domener av membran proteiner spiller en avgjørende rolle i folding og montering av membran protein komplekser og i dynamiske prosesser som transmembrane (TM) signal og regulering av celle-overflate protein nivåer. Forstå strukturelle trekk som driver foreningen av bestemte sekvenser krever avanserte biofysiske og biokjemiske analyser av TM peptid komplekser. Imidlertid gjør den ekstreme hydrofobitet for TM domener dem svært vanskelig å manipulere med standard peptidkjemi teknikker, og produksjon av passende studie materiale ofte viser uoverkommelig utfordrende. Identifisere hvilke vilkår peptider kan vedta stabile spiralformede conformations og form komplekser legger spontant en ytterligere vanskelighetsgrad. Her presenterer vi en prosedyre for fremstilling av homo-eller hetero-dimeriske TM peptid komplekser fra materialer som er uttrykt i E. coli, således tillater inkorporering av stabile isotopen etiketter for nukleær magnetisk resonans (NMR) eller ikke-naturlige aminosyrer for andre programmer relativt billig. Nøkkelen innovasjon i denne metoden er at TM komplekser produsert og renset som kovalent assosierte (disulfid-kryssbundet) sammenstillinger som kan danne stabile, støkiometrisk og homogen strukturer når rekonstituert inn vaskemiddel, lipid eller andre membran-mimetiske materialer. Vi presenterer også nøye optimalisert prosedyrer for uttrykk og rensing som er like anvendelige enten produsere enkle TM domener eller kryssbundet komplekser og gi råd for å tilpasse disse metodene til nye TM sekvenser.
Introduction
Denne protokollen detaljer en prosedyre vi har utviklet for å produsere disulfid-stabiliserte komplekser av transmembrane (TM) peptider for strukturelle studier med løsning NMR. Prosedyren tar fordel av den robuste uttrykket som gis gjennom den ΔtrpLE1413 fusion system (se nedenfor) og tillater TM peptid komplekser av definert sammensetning som skal genereres ved hjelp av avanserte stabil-isotope merkingsteknikker for moderne multi-dimensjonale NMR eksperimenter. Vi har ansatt disse teknikkene for å bestemme flere NMR strukturer som avslørte ny og viktig informasjon om hvordan lymfocytt-aktiverende immunoreceptors er samlet fra flere membran protein subenheter gjennom samspill mellom sine TM domener (nylig gjennomgått i 1). Disse teknikkene er gjeldende for mange andre membran protein systemer samt et bredt utvalg av nedstrøms analysemetoder i tillegg til løsning NMR. Mens eksempel gitt her benytter innfødte cysteinresterå skape et komplekst som etterligner naturlig disulfid-limt protein, er utformingen like godt egnet for å skape konstruert disulfidbindinger å stabilisere komplekser som normalt holdes sammen av svakere, ikke-kovalente interaksjoner som homo-og hetero-dimeriske TM komplekser av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)-familien proteiner 2-4 eller heterodimere αβ integrin komplekser 5,6.
Ekstremt hydrofobe peptidsekvenser slik som de avledet fra lipid bilayer-spenner delene for TM proteiner er overmåte vanskelige fag for biokjemiske og biofysiske studier. I tillegg til å være svært utfordrende å manipulere ved hjelp av standard protein og peptid kjemi teknikker, er de ofte ganske giftig for celler og er derfor vanskelig å produsere rekombinant. Vi 7,8 og andre 9-11 har hatt betydelig suksess uttrykker slike vanskelige peptidsekvenser i bakterier som i-frame karboksy-terminalfusjoner til en modifisert versjon av ΔtrpLE1413 sekvensen avledet fra E. coli trp operon 12. Den ~ 13 kDa trpLE polypeptid kodet for av denne sekvensen kan produseres ved høye nivåer under en T7 promoter og er i sin helhet lokalisert til inklusjonslegemer der problemer knyttet til toksisitet og / eller ustabilitet blir omgått. Modifisering av sekvensen ved tilsetning av en amino-terminal 9-histidin tag 13 og eliminering av interne metionin og cystein rester fra trpLE sekvensen 14 medbringes trpLE-peptid fusjoner å renses ved metall-ion affinitetskromatografi og fordøyd med cyanogenbromid (CNBr ) for å frigjøre den ønskede peptidsekvens. Vi har med hell brukt dette systemet til å uttrykke mer enn et dusin forskjellige sekvenser som trpLE fusjoner representerer membran protein fragmenter som inneholder så mange som fire TM domener (7,8 og upubliserte resultater, se også DISKUSJON avsnitt).
DenNøkkelen innovasjon i denne protokollen er identifisering av forholdene som ustrukturerte og svært dårlig løselig trpLE-TM fusjoner kan være effektivt disulfid-kryssbundet i sammenheng med en strømlinjeformet arbeidsflyt. Flere aspekter av high-yield uttrykk, håndtering og rensing av peptid produkter har også blitt grundig optimalisert, og anbefalingene som presenteres her er like relevant for produksjon av ikke-disulfid-tverrbundede (monomere) TM peptid produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og Construct Design
Klone sekvenser av interesse i PMM-peptid vektor (som kan leveres på forespørsel) med Hindlll og BamHI restriksjonsseter (se figur 1). Den dobbel-strengede DNA innskuddet bør inkludere, i den følgende rekkefølge: a Hindlll sted; en enkelt metionin kodon for CNBr spalting; E. coli kodonoptimalisert peptid kodende sekvens, en stopp-kodon, et BamHI-sete. Alle andre methionines i peptidet bør elimineres og dipeptidet sekvensen asp-pro bør unngås da det vil også bli spaltet i sure betingelser.
En unik cysteinrest bør innføres i hvert peptid sekvens i henhold til ønsket plassering av disulfidet kryssbindende i den endelige komplekset, og alle andre cysteinene bør mutert til serin. Plasmidet bærer et kanamycin motstand kassett for valg.
2. Uttrykk for trpLE-peptide Fusion
- Sminke og sterilt filter M9/Kan minimal dyrkningsmedium (0,1 mM 2 CaCl, 2 mM 4 MgSO, 3 g / l KH 2 4 PO, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / L NH4Cl, 4 g / L glukose, 50 mg / L kanamycin sulfat). Supplere med Centrum Complete A til sink for å gi B-vitaminer og spormetaller: Løs opp 1 tablett i 40 ml H 2 O med å blande i 30 min, sentrifuge for å fjerne uløselig materiale og sterilt filter den oransje supernatant. Butikken lager løsning ved 4 ° C i mørke i opp til 2 uker og bruke 4 ml / L i M9.
MERK: 15 N-beriket NH4Cl, 13C-anriket glukose eller andre stabile-isotop-merkede forløpere kan bli inkludert i M9 medium ved dette stadiet hvis ønskelig. - Inokulere en 100 ml starter kultur fra ferske forvandlet BL21 (DE3) stamme E. coli i M9/Kan medium. Vokse over natten ved 37 ° C med rysting ved 200 rpm.
- Neste morgen, sjekk OD 600 av starteren kultur - dette bør være i området på 2 eller større. Fortynne 100 ml starter kultur i en L totale volumet av Centrum-supplert M9 medium. Delt i to 2 L baffled kolber (500 ml kultur i hver kolbe) og vokser ved 37 ° C risting ved 140 rpm inntil OD 600 når 0,6.
- Still shaker temperaturen til 18 ° C og fortsette risting i 1 time, slik at kulturer avkjøles helt før induksjon.
- Ta en pre-induksjon utvalget for SDS-PAGE-analyse (tilsvarende 50 pl fra en kultur på OD 600 = 1), og deretter legge IPTG til 0,1 mM endelig konsentrasjon for å indusere ekspresjon av trpLE-peptid fusion. Fortsette å vokse ved 18 ° C/140 rpm natten (16-20 timer) under IPTG induksjon.
3. Inkludering Body Forberedelse og Nickel Matrix Binding
- Den endelige OD 600 av natten uttrykk kulturer i minimal medium er variabel og should være mellom 2,5 og 5,0. Ta en prøve for SDS-PAGE-analyse (tilsvarende 50 pl fra en kultur på OD 600 = 1) og samle cellene ved sentrifugering i 20 min ved 5000 x g..
- Gjensuspender cellepellet fra 1 L kultur i 50 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Cellesuspensjoner kan lagres frosset for senere prosessering.
- Lyse cellene ved sonikering på is med maksimal ytelse i 1 min og resten på is i 5 min. Vi bruker en Misonix sonikator 3000 (maks utgang 600 watt) med en ½-tommers skjerm med høy intensitet utskiftbare tips. Gjenta sonikering / kjøling i tre sykluser.
- Utlevering uoppløselig inklusjonslegeme (IB) materiale ved sentrifugering i 15 min ved 20.000 xg og kast supernatanten. En løs, tynt lag av lysere celleavfall kan være synlig på toppen av den tette IB pellet, og dette kan bli vasket bort ved hjelp av vann eller buffer med forsiktig omrøring. Trinn 3,3 og 3,4 kan bli gjentatt for å forbedre renheten av IB fraksjonen hvis desired. Prøver av pellets og supernatant materiale bør tas for SDS-PAGE analyse for å bekrefte trpLE-TM fusion lokalisering til inkludering organer.
- Oppløs IB pellets i guanidin-løsning (6 M guanidin HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), ved hjelp av 25 til 50 ml per liter kultur behandlet. Dette trinnet vil kreve flere timer med uro og sporadiske mild sonikering.
- Tømme IB lysate ved sentrifugering i 1 time ved 75,000-100,000 xg og 20 ° C. Dekanter supernatanten og filter gjennom en 0,2 um membran.
- Kombiner den ryddede IB lysate, i en 50 ml konisk rør eller et større fartøy som kan lukkes sikkert, med nikkel affinitet harpiks som er blitt vasket med vann og ekvilibrert til guanidin løsning. Bruke 3-4 ml avgjort harpiks per liter kultur behandlet for fusjoner som uttrykker til en lignende grad som trpLE-DAP12TM vist her (Figur 3, felt 2). Batch bind ved inkubering over natten på rommet t emperature med forsiktig omrøring.
4. On-kolonne Oksidativt Crosslinking
- Laste IB lysate / nikkel resin suspensjonen i en tom gravitasjonsstrømning kolonne med porøs seng støtte, legger kontinuerlig til hele volumet renner gjennom. Samle og sette til side flowthrough, som fortsatt kan inneholde ubundne fusion protein.
- Vask nikkel harpiks ved gravitasjonsstrømning med 5 seng volumer urealøsning (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) inneholdende 5 mM β-ME.
- Vask nikkel harpiks igjen med 5 soverom mengder urea løsning uten β-ME.
- Vask nikkel harpiks en tredje gang med 5 seng mengder urealøsning som er supplert med 20 uM CuSO 4 og 2 mm oksydert glutation. Etter denne vask, lukker kolonnen uttaket og inkuber 30 min ved romtemperatur for å tillate maksimal disulfidbinding formasjon.
5. TFA Eluering og kvantifisering
innhold "> FORSIKTIG: trifluoreddiksyre (TFA) forårsaker alvorlige brannskader ved kontakt med hud og røyk er svært irriterende Konsentrert TFA bør bare brukes i et godkjent avtrekkskap med vernebriller og ikke-latex hansker Sjekk den kjemiske kompatibiliteten for alle.. materialer som brukes, polypropylen er kompatibel med alle trinnene i denne protokollen.- Vasker ut oksiderende urealøsning med 10 seng volumer vann og tørk kolonnen sengen ved påføring av et vakuum linje til søylen stikkontakt.
- Lukk kolonne uttaket og legge 1,5 bed mengder ryddig (99-100%) TFA. Omrør nikkel harpiksen med en liten spatel for å sikre jevn eksponering for syre og inkuberes i 5 min. Åpne kolonnen uttaket og samle syren eluatet, trykksetting forsiktig med en sprøyte eller trykkluft linje om nødvendig for å presse ut all væsken.
- Gjenta syre eluering steg med ytterligere 1,5 seng mengder ryddig TFA. Arbeide raskt på dette trinnet for å unngå fullstendig oppløsning av beaded agarose matrise. Proteinmengde kan bestemmes på dette punktet i henhold til Beer-Lambert ligningen og den teoretiske molare ekstinksjonskoeffisient av den trpLE-peptidsekvensen. Fortynn en prøve av TFA eluatet (1:20-1:50) i Trifluoroethanol (TFE) og måle absorbansen ved 280 nm, ved hjelp av TFA / TFE på samme fortynning som en blank.
6. CNBr Fordøyelse
FORSIKTIG: Cyanogenbromid (CNBr) er svært giftig og må håndteres bare i et godkjent avtrekkskap. PPE inkludert vernebriller, frakk og ikke-latex hansker er absolutt nødvendig. CNBr reagerer på fukt og bør bringes til romtemperatur før åpning. Kontakt din institusjonelle sikkerhet kontor for instruksjoner om nøytralisering / salg av CNBr-forurensede løsninger og materialer.
- Fortynn syre eluatet til 80% endelig konsentrasjon TFA ved dråpevis tilsetning av vann under blanding forsiktig. Hvis et bunnfall former, endd tilbake et lite volum (0,5 til 1 ml) i ryddig TFA til løsningen klargjør, deretter re-korrekte til 80% med vann. Ta en 5 pl pre-digest utvalget for SDS-PAGE-analyse, frysing i flytende nitrogen og lyofilisere prøven umiddelbart.
- Legg CNBr krystaller til ca 0,2 g / ml, ta vare å veie den giftige kjemiske trygt i lukkede, pre-veide rør eller bruke en balanse inne i avtrekkskap. Bland forsiktig til helt oppløst. Spyl og forsegle reaksjonsbeholderen under inert gass (nitrogen eller argon stream) og inkuber 3-4 timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Ta en 5 pl post-digest utvalget for SDS-PAGE analyse og fryse og lyophilize umiddelbart. Overfør fordøye reaksjon til en regenerert cellulose dialyse kassett eller produksjonsrør (celluloseacetat vil oppløses i konsentrert syre) med en molekylvekt cutoff av 3,5 kDa eller mindre, i henhold til størrelsen av den forventede peptid kompleks. Dialyser natten til 4 l vann iavtrekkskap å redusere TFA konsentrasjon og dekomponere eventuell ureagert CNBr. Forlate rommet i dialyse kassett eller slange for en betydelig økning i volum (så mye som to til tre ganger) under natten dialyse.
- Fjern dialyserte reaksjonsoppløsningen med suspendert bunnfall fra dialyse kassett eller produksjonsrør (det meste av proteinet vil bunnfelles når TFA konsentrasjonen reduseres) og overføre suspensjonen til 50 ml koniske rør. Fryse og lyophilize å fjerne vann og spor av CNBr / TFA. Dette trinnet vil sannsynligvis kreve flere dager.
FORSIKTIG: Både dialyserte fordøye reaksjon og dialyse vann bør fortsette å bli behandlet som giftig og håndteres / kastes sammen med nødvendige forholdsregler. - Prøver av kulturer fra pre-induksjon og innhøsting stadier, inklusjonslegeme supernatant og pellet, TFA eluat og CNBr-fordøyd materiale kan analyseres ved SDS-PAGE. Forbered prøver ved oppvarming til 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS sample buffer. TFA eluat og fordøye prøver bør være forberedt på både å redusere og ikke-reduserende forholdene til rette produktet identifisering og evaluering av oksidativt crosslinking.
- Skille prøvene på en 12% NuPAGE bis-tris pre-cast akrylamidgel hjelp MES-SDS kjører buffer for optimal oppløsning av de minste fordøye produkter.
7. Reversert-fase HPLC Rensing av disulfid-tverrbundne Peptid Komplekser
- Oppløse opp til 100 mg av lyofilisert sammendragsalgoritmer produkter inn 2-3 ml ryddig maursyre og lastes på en preparativ skala (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT kolonne i løsningsmiddel A (typisk 10-20% acetonitril eller 5 -10% isopropanol i vann med 0,1% TFA).
- Eluer fordøye produktene i en gradient av oppløsningsmiddel B (acetonitril eller isopropanol med 0,1% TFA) over minst 5 kolonnevolumer. Se DISKUSJON for forslag om valg av optimale gradient forhold for ulike peptidsekvenser.
- Ta50-100 ul prøver fra hver HPLC fraksjon for SDS-PAGE analyse og fryse og lyophilize umiddelbart. Fjerning av HPLC løsemidler er rask og skal være ferdig i løpet av 1-2 timer.
- Forbered lyofiliserte HPLC prøver for SDS-PAGE ved oppvarming til 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS prøvebuffer uten reduksjonsmiddel. Avkjøl og dele hver prøve jevnt i 2 mikrosentrifugerør, tilsette 100 mM DTT til en av dem og re-oppvarming kort.
- Skille de reduserte og ikke-redusert HPLC prøvene på en 12% NuPAGE bis-tris Prefabrikkerings akrylamidgel med MES-SDS rennende buffer som ovenfor. Små, hydrofobe peptider ofte ikke tar opp Coomassie flekken godt og kan ikke kjøre på deres forventede molekylvekt. Imidlertid bør sammenligning av reduserte og ikke-reduserte prøver lette identifikasjon av de tverrbundne peptid produktene og vurdering av renhet.
- Analyser kandidat peptid-holdige fraksjoner av Matrix-assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri (se DISKUSJON) for å identifisere de som er av interesse og bekrefte dets forventede masse.
- Kombiner, fryse og lyophilize HPLC fraksjoner inneholdende det rene, tverrbundet TM peptid komplekse og tar en tørrvekt av det endelige produkt for å bestemme utbyttet. Fraksjoner med høy isopropanol innhold kan ikke forbli frosset. Hvis peptid fraksjoner tørke ned til en film i stedet for en LUN lyofiliserte produktet, gjenoppløs filmen helt i et lite volum av ren hexafluoroisopropanol (HFIP), fryse og lyophilize nytt. Den HFIP-behandlet produkt skal være en liten, hvit kjegle som er lett tippet ut og veies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nivået av uttrykket oppnådd for trpLE fusjoner er variabel og sterkt avhengig aminosyre sekvensen av det vedlagte peptid. Fig. 3 viser SDS-PAGE-analyse av pre-induksjon (kolonne 1) og time-of-innhøsting (søyle 2) prøver fra en kultur som ga ca 120 mg ren, intakt trpLE-DAP12TM fusion fra 1 liter av kultur og 4 ml nikkel. Alle de trpLE-DAP12TM fusjon ble lokalisert til inklusjonslegeme pellet (felt 4), i motsetning til supernatant (felt 3).
Omtrent 70% av nikkel-renset trpLE-DAP12TM fusion var disulfid-kryssbundet til dimerglycerol skjemaet (figur 3, kolonnene 5 og 6: ikke-reduserte og redusert prøver av TFA eluatet). Dette er et typisk resultat for trpLE-DAP12TM fusion, men crosslinking effektivitet vil variere med plassering av konstruerte cysteinene. De DAP12TM peptid produkter er ikke lett identifiserbare totalt CNBr fordøye prøver (baner 7 og 8),men sammenligning av intakt fusjon og trpLE fragment band i den reduserte digest prøven (lane 8) indikerer at fordøyelsen av sammensmeltingen var ~ 60% fullført.
Figur 4 viser separasjonen av fordøye produkter ved reversfase-HPLC ved hjelp av en preparativ-skala C3 kolonne (total bindingskapasitet ~ 200 mg protein). Fordi aromatinnhold sammensmeltingen er lav vi vanligvis overvåke absorbans ved 214 nm i stedet for 280 nm. For denne kjøring 90 mg av oksidert ble CNBr-fordøyd trpLE-DAP12TM fusion oppløst i 3 ml ryddig maursyre og lastet på kolonnen i 100% oppløsningsmiddel A (60% H 2 O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). Bound produkter ble eluert i en to-trinns gradient av 0-60% etterfulgt av 60-90% oppløsningsmiddel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) ved en strømningshastighet på 10 ml / min. De store produkter som inngår i hver fraksjon ifølge SDS-PAGE-analyse (figur 5) er angitt ovenfor ved hjelp av kromatogrammet kodene assigned i figur 2.. Se Optimalisering av HPLC gradienteluering i diskusjonen delen for mer informasjon om å optimalisere gradient forhold for ulike peptidsekvenser.
Peptid produkter er lett identifiserbare i SDS-PAGE (figur 5) og MALDI-TOF (figur 6) analyser av de store HPLC fraksjoner. DAP12TM peptider og, i vår erfaring, mange andre hydrofobe TM peptider, kjøre med betydelig redusert migrasjon priser i forhold til sine forventede molekylvekt (3366 Dalton monomer og 6730 Dalton dimer for de 15 N-merkede arter vist her). Denne virkemåten er direkte relatert til mengden av peptidet lastet på gelen og resulterer i et kontinuum av tilsynelatende molekylvekter som beløpet lastet er variert (data ikke vist). Imidlertid identifiserer endring i elektroforetisk mobilitet av peak 5 etter reduksjon med 100 mM DTT (sammenlign baner 7 og 8) på dette som den tverrbundne peptidproduktet. MALDI-TOF MS analysen bekrefter identiteten til dimerglycerol peptidet med hovedtopp ved 6729,2 dalton og viser ingen andre store produkter (Figur 6). Den endelige utbytte av ren disulfid-kryssbundet DAP12TM peptid homodimer fra dette preparatet var 7,5 mg per liter kultur.
Figur 1. DNA sekvens av trpLE-DAP12TM koding regionen med sin aminosyre oversettelse. Viktige deler av polypeptidsekvensen er uthevet og fargekodet med etiketter til høyre. De unike interne metionin (Met) og cystein (Cys) rester for cyanogenbromid (CNBr) spalting og oksidativt crosslinking er uthevet i cyan og lilla, henholdsvis. Hindlll og BamHI restriksjonsseter (fet og understreket) er unike i plasmidet og may brukes til å erstatte den TM peptidsekvens med en annen sekvens av interesse.
Figur 2. Skjematisk diagram av fremgangsmåten. De viktigste trinnene i protokollen, er angitt i tekstetiketter. Viktige deler av trpLE-DAP12TM fusjon er fargekodet som i figur 1. Store polypeptid produkter fra crosslinking og fordøye trinn er merket AF og er oppført her med deres beskrivelse og forventet molekylvekt (15 N-merket): [A] trpLE fragment: 13769 Daltons; [B] intakt trpLE-DAP12TM fusion: 17118 Daltons , [C] intakt trpLE-DAP12TM fusion dimer: 34233 Daltons; [D] single-spaltet trpLE-DAP12TM fusion dimer: 20482 Daltons; [E] monomere DAP12TM peptid: 3366 Daltons; [F] dimerglycerol DAP12TM peptid: 6730 Dalton. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. SDS-PAGE analyse av trpLE-DAP12TM uttrykk, rensing, tverrbindende og fordøye trinn Kultur prøver (1 kjørefelt, pre-induksjon, steg 2,5; 2 kjørefelt, innhøsting, steg 3,1). Og inkludering kroppen prep prøver (3 kjørefelt, supernatant, felt 4, pellet, trinn 3.4) ble redusert med 100 mM DTT. TFA eluatet fra nikkel kolonnen (kolonnene 5 og 6; trinn 6.1) og post-CNBr prøven (søyle 7 og 8; trinn 6.3) ble kjørt uten redusert (NR) og redusert med 100 mM DTT (R) som er angitt for å bekrefte disulfid-tverrbundet produkt. * Monomere og dimerglycerol peptid produkts E og F er dårlig visualisert ved Coomassie flekker og derfor ikke oppdages på denne gel.
Figur 4. Reversert-fase HPLC rensing av DAP12TM disulfid-tverrbundet dimer. Oxidized, CNBr-fordøyd og lyofilisert trpLE-DAP12TM fusion produkter (90 mg) ble oppløst i 3 ml maursyre (100%) og lastet på en Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) kolonne i løsningsmiddel A (60% H 2 O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). En to-trinns gradient av 0-60% etterfulgt av 60-90% oppløsningsmiddel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) ble kjørt ved en strømningshastighet på 10 ml / min for å eluere bundet produkter. Fraksjoner samlet som gjennomstrømning (FT) og fire store topper er merket over 214 nm trace (AU: vilkårlig undens) og de store produkter som inngår i hver fraksjon er angitt ved hjelp av koder som er tilordnet i figur 2. Ønsket DAP12TM krysskoblet produkt peak er skyggelagt.
Figur 5. SDS-PAGE-analyse av reversert-fase HPLC-produkter. Gjennomstrømning (FT) og topp 1 prøver ble kjørt ikke-redusert. 2 Peak, 3 og 4 prøver ble kjørt både ikke-redusert (NR) og reduseres ved behandling med 100 mM DTT (R) for å verifisere identiteten til disulfide tverrbundne produkter. De viktigste produktene i hver fraksjon (med sine koder tilordnet i figur 2) var [FT, PK1]: A, trpLE fragment; [Pk2]: B, intakt trpLE-DAP12TM fusion monomer og C, intakt fusion dimer, [PK3]: D, single-spaltet trpLE-DAP12TM dimer og E, monomere DAP12TM peptid; [PK4]: F, disulfid-tverrbundet DAP12TM dimer. * Som diskutert (se representant reults), gjør en konsentrasjonsavhengig skifte i mobilitet lav-MW produkter i PK3 (NR og R) og PK4 (R) synes å være ulike molekylære vekter selv om begge produktene er monomerisk peptid.
Figur 6. MALDI-TOF massespektrometrisk analyse av HPLC-renset peptid DAP12TM dimer. En prøve av HPLC fraksjon 4 (1 ul) ble blandet 1:1 med en mettet løsning av sinapinic syre (SA) matrise i acetonitril og flekket på toppen av en tynt lag av tørket SA matrise fra en mettet oppløsning fremstilt i etanol. MALDI-TOF analyse avdekker et produkt på forventet DAP12TM peptid krysskoblet dimer masseav 6730 Daltons (6729,2098, 15 N-merket) samt en mindre produkt på 3365,7105, mest sannsynlig dobbel-ioniserte arter. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uttrykk for trpLE-TM fusjoner. Vår erfaring er trpLE-TM fusjoner dårlig uttrykt i rike kultur medium ved 37 ° C, og kultur forholdene beskrevet her har vist seg vellykket for mange forskjellige sekvenser som inneholder 1-4 TM domener med avkastning spenner 50-150 mg / L av ren, intakt fusion. Fusions koding tre-eller fire-TM GPCR fragmenter (human CCR5 TM1-TM3 og TM4-TM7, henholdsvis) eller en kjerne katalytisk fragment av menneskelig signal peptid peptidase (fire TM-domener, se ref 15) representerer det laveste i spekter av uttrykk nivåer, mens DAP12TM varianter nært knyttet til sekvensen brukes her representerer den høyeste enden av skalaen (upubliserte data). Den optimale IPTG konsentrasjonen bør bestemmes eksperimentelt for hver ny sekvens. Vår standard er 0,1 mm, og høyere konsentrasjoner (opp til 1 mM) vanligvis resultere i betydelig redusert avkastning på grunn av både lavere uttrykk nivåer og lavere kultur tetthet ent slakting (se for eksempel Figur 1A i referanse 7).
Variasjoner på presenterte protokollen. Protokollen skissert her beskriver fremstillingen av en disulfid-tverrbundet TM peptid kompleks, den DAP12TM homodimer 8. Alternativt, blir protokollen lett tilpasset for å frembringe monomere peptider ved å utelate de to vasketrinnet designet for å fjerne reduksjonsmiddel og oksidere de bundne produkter (4,3 og 4,4). Vi har tidligere brukt en annen variasjon av fremgangsmåten rapportert her for å produsere en kovalent stabilisert TM peptid kompleks representerer trimere DAP12-DAP12-NKG2C TM enheten (se referanse 8 og metoder beskrevet deri). I dette programmet, ble en 1-TM trpLE-DAP12 fusjon og en 2-TM trpLE-DAP12-NKG2C fusion blandet på kultur innhøstingen scenen før inkludering kroppen forberedelse (trinn 3.1 til 3.2). Prosedyren omfattet en ekstra HPLC trinn for å isolere heterodimere tverrbundet trpLEfusion produktet fra den sure eluatet (trinn 5.3) før CNBr fordøye. C3 rensing av peptid produkter resulterte i utvinning av et disulfid-tverrbundet DAP12TM dimer der en tråd gjennomførte NKG2C TM domenet som en in-rammen C-terminal fusjon. Løsningen NMR strukturen av dette kompleks i vaskemiddel miceller bekreftet at NKG2C TM domenet montert med DAP12 i det opprinnelige, anti-parallell orientering 8. De ekstra trinn i denne variasjonen betydelig redusert utbytte av det endelige produkt: et typisk preparat ga 8-10 mg peptid "trimer" fra 4L av en fusjon kombinert med et overskudd av den andre. Denne variasjonen representerer en god start protokoll for forskere som ønsker å produsere disulfide-stabilisert komplekser som inneholder to forskjellige TM sekvenser.
Merknader om nikkel-affinitetsrensing. Elueringen av protein fra det tørkede nikkel kolonnen bruker konsentrert syre er en uvanlig prosedyre og er ikke mottagelig for re-Bruk av nikkel. Forsøk på å eluere de ekstremt hydrofobe trpLE-TM fusjoner hjelp imidazol eller EDTA resulterte i ufullstendig gjenvinning av protein og de tverrbundne arter ble fortrinnsvis beholdes på kolonnen (upubliserte resultater). Den anbefalte mengde nikkel og overnatter batch-bindende protokoll er nøye optimalisert for å mette matriksen med trpLE-TM protein og derved minimere co-rensing av forurensninger. Vi rutinemessig gjenopprette veldig rene produkter med avkastning som i vesentlig grad overstiger den annonserte bindende kapasitet Sigma HIS-Select Nickel Affinity Matrix (15-20 mg / ml resin). Syren eluering eliminerer også mellomliggende trinnene som kreves for å overgang til CNBr fordøye, og den økte avkastningen av kryssbundet produkter mer enn oppveier kostnaden for nikkel, spesielt når merking med dyre stabil-isotop reagenser for NMR.
Cyanbromid fordøye forhold. Utgivelsen avsmeltet TM peptider fra trpLE i CNBr vanligvis utføres ved hjelp av 70% maursyre som oppløsningsmiddel fordi både reaksjonshastigheten og protein løselighet er meget gunstig under disse betingelser. Imidlertid, må behandlings tid holdes forholdsvis korte (under 1 hr for digest) å unngå formyl forestring av serin og threonin reststoffer 16,17 og muligens jeg-formylering av tryptofan rester 18, modifiseringer som er detekterbart ved massespektrometri som arter som observerte massen er 28 (n) Daltons mot den forventede masse. Vår preferanse for TFA som beskrevet her unngår disse endringene helt. Enzymatisk spaltning av et trpLE-TM fusjon med faktor Xa protease i 1% Triton X-100 er blitt rapportert 11, men den dårlige løseligheten av de fleste trpLE-TM fusjoner og komplikasjon av spaltningssete utilgjengelighet i vaskemiddel miceller sannsynligvis begrense den generelle anvendeligheten av denne tilnærmingen.
Reversert-fase HPLC rensing av peptide produktene fra CNBr digest er det mest utfordrende trinnet i denne prosedyren, og vil sannsynligvis kreve optimalisering for hver ny trpLE-TM sekvens. Følgende observasjoner kommer fra prosessering mange forskjellige sekvenser og vil sannsynligvis holde sant for de fleste trpLE-TM fusjoner:
Valg av stasjonær fase Vi finner Agilent Zorbax Stable-Bond C3 kolonner (300 Å porestørrelse, 5 mikrometer partikkelstørrelse). Å være en overlegen stasjonær fase i form av selektivitet, oppløsningsevne og stabilitet under tung eksponering for konsentrert syre. Semi-preparative (9,4 mm diameter) og preparativ-skala (21,2 mm diameter) størrelser er tilgjengelige og har gjort det svært bra i våre hender. C4, difenyl og cyanopropyl stasjonære faser kan også gi nyttig alternativ peptid selektivitet i en lignende hydrofobisitet spekter sammenlignet til C3.
Utarbeidelse av fordøye produkter for HPLC. Oppløsning av frysetørrede CNBr fordøye produkter i ryddig formic syre gir de beste resultatene for HPLC separasjon. Fremstilling i TFA eller organiske oppløsningsmidler, slik som acetonitril, og dimetylformamid Trifluoroethanol resulterer ofte i lavere oppløselighet, redusert kolonne binder og / eller eluering av produkter i brede topper som inneholder flere arter. Hensyn må tas til å forberede produkter i maursyre umiddelbart før kolonne lasting fordi langvarig eksponering kan resultere i modifikasjon av formyl peptid sidechains 16-18 som omtalt ovenfor.
Optimalisering av HPLC gradienteluering. Vi vanligvis begynne med 10-20% acetonitril eller 5-10% isopropanol i vann med 0,1% TFA som oppløsningsmiddel A. TrpLE-TM fusjoner og deres fordøye produkter oppløst i maursyre vil binde C3 kolonnen i som mye som 40% acetonitril som vist her (figur 4). Mye av den frigjorte trpLE fragment kan strømme gjennom under disse betingelser (Merk at trpLE fragment er det eneste proteinet produkt i FTfraksjon: Figur 5, 1 kjørefelt), og vi har tatt fordel av denne observasjonen for å øke den samlede bindingskapasitet av kolonnen for de ønskede produkter. Acetonitril og isopropanol er svært effektive som gradient løsemidler, og vi kommer ofte på våre endelige gradient betingelser ved å blande pre-eksisterende løsningsmiddel løsninger å modifisere elueringsmiddel profiler, noe som resulterer i noen ganger rart men effektive oppskrifter som 75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1 % TFA løsning brukt som oppløsning B for DAP12TM rensing vist her. Ekstremt hydrofobe produkter som var problematisk er stemt eluert ved å anvende acetonitril eller isopropanol med tilsetning av opp til 10% Trifluoroethanol (TFE) og økte konsentrasjoner av TFA (opp til 0,3%) i både A og B (upubliserte resultater). Andre har rapportert gode resultater ved hjelp butanol / eddiksyre mobile faser med en C4 stasjonær fase 9.
Analyse av fordøye-produkter. Begge de store analyseteknikkfiltre anvendes her, SDS-PAGE og MALDI-TOF MS, kan komplisert ved ekstremt hydrofobe natur trpLE-TM produkter. Lyofiliserte analyseprøver fra CNBr / TFA fordøye reaksjoner og HPLC fraksjoner noen ganger kjøre som høy-molekylær-vekt aggregater på SDS-PAGE-geler. Vi finner at behandling av lyofiliserte prøver med et lite volum av HFIP og re-lyofilisering før tilberedning for SDS-PAGE ofte remedier dette problemet. TM peptidsekvenser heller ikke lett ionisere under MALDI-TOF MS analyse, og kan derfor gi svært svake signaler. Vi har brukt en optimalisert prosedyre for fremstilling TM peptid prøvene hvor en mettet oppløsning av sinapinic syre (SA) i etanol er første flekket på plate og tørket for å lage et ensartet tynt lag i matrix. En prøve av peptid-inneholdende HPLC fraksjonen blandet 1:1 med en mettet løsning av SA i acetonitril blir deretter flekket på toppen av det tørkede matrikslaget. I våre hender, denne metoden gir mellom to-og seks-ganger større signal-til-støy sammenligned til småblødninger peptidet: SA blandingen direkte på en ren MALDI plate.
Nedstrøms applikasjoner. Metoder for rekonstituering TM peptid komplekser i lipid eller vaskemiddel systemer for løsning NMR og andre nedstrøms applikasjoner varierer mye og må vanligvis være nøye skreddersydd for hvert nytt system og program. En full diskusjon av parametrene involvert er derfor godt utenfor rammen av denne protokollen artikkelen. For detaljer om prøveopparbeidelse fra vellykkede programmer som bruker løsningen NMR, henviser vi leseren til disse siste vurderinger på temaet 1,19 og referanser deri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Midler til dette arbeidet er levert av National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC prosjektstøtte 1.011.352 til MEC og MJC, forskningsinstitutter Infrastruktur støtteordning [IRIISS] tilskudd til WEHI) og den viktorianske regjeringen (Veski Innovation Fellowship til MEC; Victorian State Government Operasjonell Infrastruktur Støtte til WEHI). MEC er en dronning Elizabeth II medlem av Australian Research Council. EFXB erkjenner støtte fra Norma Hilda Schuster Scholarship Program ved University of Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
