Summary
Biofysiska och biokemiska studier av interaktioner mellan membran-inbäddade proteindomäner inför många tekniska utmaningar, varav den första är att få lämplig studiematerial. Denna artikel beskriver ett protokoll för framställning och rening av disulfid-stabiliserade komplexen transmembrana peptid som är lämpliga för strukturell analys genom lösning kärnmagnetisk resonans (NMR) och andra analytiska tillämpningar.
Abstract
Fysiska interaktioner mellan lipid-inbäddade alfa-spiralformade domäner av membranproteiner spelar en avgörande roll för veckning och sammansättning av komplex membranprotein och dynamiska processer, såsom transmembran (TM) signalering och reglering av cellytprotein nivåer. Förstå de strukturella drag som driver sammanslutning av enskilda sekvenser kräver sofistikerade biofysiska och biokemiska analyser av TM peptidkomplex. Emellertid gör den extrema hydrofobiciteten av TM-domäner dem mycket svåra att manipulera med användning av standardtekniker peptidkemi, och produktion av lämpligt studiematerial ofta visar oöverkomligt utmanande. Identifiera vilka villkor peptider kan anta stabila spiralformade konformationer och komplex bildas spontant lägger ytterligare en svårighetsgrad. Här presenterar vi ett förfarande för framställning av homo-eller hetero-dimera TM komplex peptid från material som uttrycks i E. colI, vilket möjliggör inkorporering av stabila isotopen etiketter för kärnmagnetisk resonans (NMR) eller icke-naturliga aminosyror för andra tillämpningar relativt billigt. Nyckeln innovationen i denna metod är att TM komplex produceras och renas som kovalent associerade (disulfid-tvärbundna) anordningar som kan bilda stabila, stökiometrisk och homogena strukturer vid rekonstituering i tvättmedel, lipid eller andra membran-mimetiska material. Vi presenterar också noggrant optimerade rutiner för uttryck och rening som är lika tillämpliga om att producera enkla TM domäner eller tvärbundna komplex och ge råd för att anpassa dessa metoder till nya TM-sekvenser.
Introduction
Detta protokoll detaljer ett förfarande som vi har utvecklat för att producera disulfid-stabiliserade komplex av transmembran (TM) peptider för strukturella studier med lösning NMR. Proceduren tar fördel av den robusta uttryck som ges av ΔtrpLE1413 fusion systemet (se nedan) och låter TM peptid komplex av definierad sammansättning som skall genereras med hjälp av sofistikerade stabil-isotopmärkning tekniker för moderna flerdimensionella NMR-experiment. Vi har använt dessa tekniker för att bestämma flera NMR strukturer som avslöjade viktig ny information om hur lymfocyt-aktiverande immunoreceptors monteras från flera subenheter membran protein genom interaktioner bland sina TM domäner (nyligen granskas 1). Dessa tekniker kan tillämpas på många andra system membranprotein samt ett brett utbud av nedströms analysmetoder förutom lösning NMR. Medan exemplet som ges här utnyttjar nativa cysteinresteratt skapa en komplex som efterliknar naturligt disulfidbunden proteinet, är konstruktionen lika väl lämpad för att skapa modifierade disulfidbindningar att stabilisera komplex som normalt hålls samman av svagare, icke-kovalenta interaktioner såsom homo-och hetero-dimera TM komplex av epidermal tillväxtfaktor (EGFR)-familjen proteiner 2-4 eller heterodimera αβ integrin komplex 5,6.
Extremt hydrofoba peptidsekvenser såsom de som härrör från lipiddubbelskiktet-överbryggande delar av TM-proteiner är ytterst svåra ämnen för biokemiska och biofysiska studier. Förutom att vara mycket utmanande att manipulera med standard protein och peptid tekniker kemi, är de ofta ganska toxisk för celler och är därför svåra att framställa rekombinant. Vi 7,8 och andra 9-11 har haft betydande framgång som uttrycker sådana svåra peptidsekvenser i bakterier som i ram karboxiterminalfusioner till en modifierad version av ΔtrpLE1413 sekvens härledd från E. E. coli trp-operonet 12. Den ~ 13 kDa trpLE polypeptid som kodas av denna sekvens kan produceras på höga nivåer under en T7-promotor och är helt lokaliserad till inklusionskroppar där problem med toxicitet och / eller instabilitet kringgås. Modifiering av sekvensen genom tillsats av en aminoterminal 9-histidinmärkning 13 och eliminering av interna metionin och cystein rester från trpLE sekvensen 14 tillåts trpLE-peptid-fusioner som skall renas genom metall-jon affinitetskromatografi och digererades med cyanogenbromid (CNBr ) för att frigöra den önskade peptidsekvensen. Vi har framgångsrikt använt detta system för att uttrycka mer än ett dussin olika sekvenser som trpLE fusioner representerar fragment membranprotein som innehåller så många som fyra TM-domäner (7,8 och opublicerade resultat, se även DISKUSSION avsnitt).
Denviktig innovation i detta protokoll är identifieringen av villkoren för ostrukturerade och mycket svårlösliga trpLE-TM fusioner kan vara effektivt disulfid-tvärbunden i samband med ett strömlinjeformat arbetsflöde. Flera aspekter av högavkastande uttryck, hantering och rening av peptid produkter har också noggrant optimerats och rekommendationerna som presenteras här är lika relevanta för produktion av icke-disulfid-tvärbundna (monomer) TM peptid-produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning och konstruera design
Klona sekvenserna av intresse i PMM-peptid vektorn (som kan tillhandahållas på begäran) med användning av Hindlll och BamHI restriktionsställen (se figur 1). Den dubbelsträngade DNA-insatsen bör innehålla, i följande ordning: ett Hindlll-ställe, en enda metionin kodon för CNBr-klyvning, E. E. coli kodon-optimerad kodande sekvens, ett stoppkodon, ett BamHI-ställe. Alla andra metioniner i peptiden bör elimineras och dipeptiden sekvensen Asp-Pro bör undvikas eftersom det kommer också klyvas under sura betingelser.
En unik cysteinrest bör införas i varje peptidsekvens enligt den önskade positioneringen av disulfid tvärbindning i den slutliga komplexet, och alla andra cysteiner bör muteras till serin. Plasmiden bär en kassett kanamycinresistens för val.
2. Uttryck av trpLE-peptide Fusion
- Make up och sterilfilter M9/Kan minimalt tillväxtmedium (0,1 mM CaClz 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCI, 1 g / L NH 4 Cl, 4 g / L glukos, 50 mg / L kanamycinsulfat). Komplettera med Centrum Komplett A till zink för att ge B-vitaminer och spårmetaller: lös 1 tablett i 40 ml H 2 O med blandning i 30 min, centrifugera för att avlägsna olösligt material och sterilfilter orange supernatanten. Lagra stamlösning vid 4 ° C i mörker i upp till 2 veckor och använda 4 ml / L i M9.
OBS: 15 N-anrikade NH4CI, 13 C-berikad glukos eller andra stabila-isotop-märkta prekursorer kan ingå i M9-medium i detta skede, om så önskas. - Ympa en 100 ml startkultur från nyligen transformerade BL21 (DE3)-stammen E. coli i M9/Kan medium. Odla över natten vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- Nästa morgon, kontrollera OD 600 av startkulturen - detta bör vara i intervallet 2 eller högre. Späd 100 ml startkultur i 1 L total volym av Centrum kompletterat-M9-medium. Delas upp i två 2 avsmalnande L kolvar (500 ml kultur i varje kolv) och växa vid 37 ° C under skakning vid 140 varv per minut tills OD 600 når 0,6.
- Ställ in shakern temperaturen till 18 ° C och fortsätt skakning under 1 timme, så att kulturer svalna helt innan induktion.
- Ta en pre-induktion prov för SDS-PAGE-analys (motsvarande 50 pl från en kultur vid OD 600 = 1) och tillsätt sedan IPTG till 0,1 mM slutlig koncentration för att inducera expression av trpLE-peptid fusionen. Fortsätta växa vid 18 ° C/140 rpm över natten (16-20 timmar) under IPTG induktion.
3. Integration Body Förberedelser och nickel Matrix bindning
- Den slutliga OD 600 över natten uttryck kulturer i minimalmedium är rörlig och should vara mellan 2,5 och 5,0. Ta ett prov för SDS-PAGE-analys (motsvarande 50 pl från en kultur vid OD 600 = 1) och samla cellerna genom centrifugering under 20 minuter vid 5.000 x g..
- Återsuspendera cellpellet från 1 L kultur i 50 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Cellsuspensioner kan frysas för senare bearbetning.
- Lysera celler genom sonikering på is vid maximal effekt under 1 minut och vila på is i 5 min. Vi använder en Misonix Sonicator 3000 (max effekt 600 watt) med ett ½-tums högintensiva utbytbar spets. Upprepa ultraljudsbehandling / kyla under tre cykler.
- Samla olöslig inklusionskropp (IB) material genom centrifugering under 15 minuter vid 20.000 x g och kasta supernatanten. En lös, tunt skikt av ljusare cellrester kan vara synliga på toppen av den täta IB pelleten, vilket kan tvättas bort med vatten eller buffert med försiktig omröring. Steg 3,3 och 3,4 kan upprepas för att förbättra renheten hos IB fraktionen om desiröd. Prover av pellets och supernatanten material bör tas för SDS-PAGE analys för att bekräfta trpLE-TM fusion lokalisering till inklusionskroppar.
- Lös IB pellets i guanidin-lösning (6 M guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), med användning av 25-50 ml per liter bearbetas kultur. Detta steg kommer att ta flera timmar med omrörning och tillfällig lindrig ultraljudsbehandling.
- Rensa IB lysatet genom centrifugering i 1 timme vid 75,000-100,000 xg och 20 ° C. Dekantera supernatanten och filtrera genom ett 0,2 | im membran.
- Kombinera rensas IB lysat, i en 50 ml koniskt rör eller en större kärl som kan stängas säkert med nickel affinitetsharts som har tvättats med vatten och ekvilibrerades till guanidin lösning. Använd 3-4 ml bosatte harts per liter odling bearbetas för fusioner som uttrycker en liknande grad som trpLE-DAP12TM visas här (Figur 3, rad 2). Batch binder genom inkubering över natten vid rumstemperatur t emperatur med försiktig blandning.
4. I kolonnen oxidativ tvärbindning
- Fyll IB lysatet / nickel harts upphängning i en tom gravitationsflöde kolumn med porös bädd stöd, lägga kontinuerligt tills hela volymen flyter genom. Samla och lägg undan genomflöde, som fortfarande kan innehålla proteiner Obundet fusion.
- Tvätta nickel hartset genom gravitationsflöde med 5 bäddvolymer urealösning (8 M urea, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl) innehållande 5 mM β-ME.
- Tvätta nickel hartset igen med 5 bäddvolymer urealösning utan β-ME.
- Tvätta nickel hartset en tredje gång med 5 bäddvolymer urealösning som har kompletterats med 20 pM CuSO 4 och 2 mM oxiderad glutation. Efter denna tvättningen stängs kolonnens utlopp och inkubera 30 minuter vid rumstemperatur för att tillåta maximal bildning av disulfidbindning.
5. TFA Eluering och kvantifiering
innehåll "> VARNING: Trifluorättiksyra (TFA) orsakar allvarliga brännskador vid kontakt med huden och rök är mycket irriterande Koncentrerad TFA bör endast användas i en godkänd kemisk dragskåp med ögonskydd och icke-latexhandskar Kontrollera den kemiska kompatibiliteten av alla.. material som används, polypropylen är kompatibel med alla steg i detta protokoll.- Tvätta ur den oxiderande urealösningen med 10 bäddvolymer vatten och torka kolonnbädden genom att applicera ett vakuum linje till kolonnens utlopp.
- Stäng kolonnens utlopp och tillsätt 1,5 bäddvolymer ren (99-100%) TFA. Rör nickel hartset med en liten spatel att säkerställa jämn exponering för syra och inkubera i 5 min. Öppna kolonnens utlopp och samla den sura eluatet, trycksättning försiktigt med en spruta eller tryckluftsledning om nödvändigt för att trycka ut all vätska.
- Upprepa steg syraeluering med ytterligare 1,5 bäddvolymer ren TFA. Arbeta snabbt vid detta steg för att undvika fullständig upplösning av beaded. agarosmatris. Proteinutbytet kan bestämmas vid denna punkt enligt Beer-Lambert ekvation och den teoretiska molära extinktionskoefficienten av trpLE-peptidsekvensen. Späd ett prov av TFA eluatet (1:20 till 1:50) i trifluoretanol (TFE) och mät absorbansen vid 280 nm, med användning av TFA / TFE vid samma spädning som en blank.
6. CNBr Uppslutning
VARNING: cyanogenbromid (CNBr) är extremt giftigt och bör endast hanteras i en godkänd kemisk dragskåp. Skyddsutrustning inklusive skyddsglasögon, skyddsrock och latexfria handskar är absolut nödvändigt. CNBr är reaktiv för fukt och bör anpassas till rumstemperatur innan den öppnas. Kontakta ditt institutionella säkerhets kontor för instruktioner om neutralisering / avyttring av CNBr-förorenade lösningar och material.
- Späd den sura eluatet till 80% slutlig koncentration TFA genom droppvis tillsats av vatten under blandning försiktigt. Om en fällning bildas, endd tillbaka en liten volym (0,5 till 1 ml) av ren TFA tills lösningen har klarnat, sedan åter korrekt 80% med vatten. Ta en 5 pl före digest prov för SDS-PAGE-analys, frysning i flytande kväve och lyofilisera provet omedelbart.
- Lägg CNBr kristaller till ca 0,2 g / ml, var noga med att väga den giftiga kemikalien säkert i slutna, förvägda rör eller med hjälp av en balans inne i dragskåp. Blanda försiktigt tills helt upplöst. Spola och försegla reaktionskärlet under inert gas (kväve eller argon ström) och inkubera 3-4 timmar vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
- Ta en 5 ul efter smälta prov för SDS-PAGE analys och frys och lyofilisera omedelbart. Överför digest reaktionen till en regenererad cellulosa dialys kassett eller slang (cellulosaacetat löses i koncentrerad syra) med en molekylviktsgräns av 3,5 kDa eller mindre, beroende på storleken av den förväntade peptiden komplexet. Dialysera över natten till 4 liter vatten idragskåp för att reducera koncentrationen TFA och sönderdela eventuell oreagerad CNBr. Låt rum i dialys kassett eller rör för en betydande ökning i volym (så mycket som två till tre gånger) under natten dialys.
- Avlägsna dialyserade reaktionslösningen med upphängd fällningen från dialys kassetten eller slang (det mesta av proteinet fälls när TFA koncentrationen reduceras) och överför suspensionen till 50 ml koniska rör. Frys och lyofilisera för att avlägsna vatten och spår av CNBr / TFA. Detta steg kommer sannolikt att kräva flera dagar.
VARNING: Både dialyserade smälta reaktionen och dialys vattnet bör fortsätta att behandlas som giftiga och hanteras / avyttras med lämpliga försiktighetsåtgärder. - Prover av kulturer från före induktion och skörd stadier, inklusionskropp supernatant och pellet, TFA eluat och CNBr-digererade materialet kan analyseras genom SDS-PAGE. Förbered prover genom uppvärmning till 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS sample buffert. TFA eluat och smälta prover bör beredas i både reducerande och icke-reducerande förhållanden för att underlätta produktens identifiering och utvärdering av oxidativ tvärbindning.
- Separera proverna på en 12% NuPAGE Bis-Tris förtillverkade akrylamidgel med MES-SDS rinnande buffert för optimal upplösning av de minsta smälta produkterna.
7. Omvänd-fas HPLC-rening av disulfidkorskopplade-peptidkomplex
- Lös upp till 100 mg lyofiliserade meddelandealgoritmer produkter i 2-3 ml ren myrsyra och belastning på en preparativ skala (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT kolonn i lösningsmedel A (typiskt 10-20% acetonitril eller 5 -10% isopropanol i vatten med 0,1% TFA).
- Eluera sammandraget produkter i en gradient av lösningsmedel B (acetonitril eller isopropanol med 0,1% TFA) under minst 5 kolonnvolymer. Se diskussion för förslag på val av optimala gradientförhållandena för olika peptidsekvenser.
- Ta50-100 ul prover från varje HPLC-fraktion för SDS-PAGE-analys och frys och lyofilisera omedelbart. Borttagning av HPLC lösningsmedel är snabb och bör vara klar i 1-2 timmar.
- Bered lyofiliserade HPLC prover för SDS-PAGE genom upphettning till 95 ° C i Invitrogen NuPAGE LDS provbuffert utan reduktionsmedel. Kyl och dela varje prov jämnt i 2 mikrocentrifugrör, tillsätta 100 mM DTT till en av dem och återuppvärmning kort.
- Separera reducerade och icke-reducerade prover HPLC på en 12% NuPAGE Bis-Tris förtillverkade akrylamidgel med MES-SDS-rinnande buffert som ovan. Små, hydrofoba peptider ofta inte tar upp Coomassie färgning bra och kan inte köra på deras förväntade molekylvikter. Emellertid bör jämförelse av reducerade och icke-reducerade prover underlätta identifieringen av de tvärbundna peptidprodukter och bedömning av renhet.
- Analysera kandidat peptidinnehållande fraktioner genom matris-assisterad laser desorption jonisering time-of-flight (MALDI-TOF) masspektrometri (se diskussion) för att identifiera de arter av intresse och bekräftar den förväntade massa.
- Kombinera, frys och lyofilisera HPLC-fraktioner som innehåller den rena, tvärbundna TM peptidkomplexet och ta en torr vikt av den slutliga produkten för att bestämma utbytet. Fraktioner med hög isopropanol innehåll kan inte förbli frysta. Om peptidfraktioner torkar till en film snarare än en fluffig lyofiliserad produkt, återupplösa filmen fullständigt i en liten volym av ren hexafluorisopropanol (HFIP), frys och lyofilisera igen. Den HFIP-behandlad produkt bör vara en liten, vit kon som lätt tippas ut och vägdes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nivån av expression uppnås för trpLE fusioner är variabel och starkt beroende av den aminosyrasekvensen av den bifogade peptiden. Figur 3 visar SDS-PAGE-analys av före-induktion (spår 1) och time-of-skörd (spår 2) prov från en kultur som gav ungefär 120 mg ren, intakt trpLE-DAP12TM fusion från 1 liter kultur och 4 ml nickel matris. Alla de trpLE-DAP12TM fusion lokaliserad till inklusionskropp pelleten (spår 4) i motsats till supernatanten (fält 3).
Cirka 70% av nickel-renade trpLE-DAP12TM fusion var disulfid-tvärbunden till den dimera formen (fig. 3, spår 5 och 6: icke-reducerade och reducerade prover av TFA eluat). Detta är ett typiskt resultat för trpLE-DAP12TM fusion, men tvärbindning effektivitet varierar med placeringen av tekniska cysteiner. De DAP12TM peptid produkter är inte lätta att identifiera i totala CNBr smälta prover (spår 7 och 8),men jämförelse av den intakta fusion och trpLE band fragment i det reducerade smälta provet (spår 8) indikerar att spjälkning av fusionen var ~ 60% fullständig.
Figur 4 visar separationen av smälta produkter genom omvänd fas HPLC med användning av en preparativ skala C3 kolonn (total bindningskapacitet ~ 200 mg protein). Eftersom den aromatiska halten av fusionen är låg vi övervakar typiskt absorbansen vid 214 nm i stället för 280 nm. För denna körning 90 mg oxiderad, var CNBr-digererad trpLE-fusion DAP12TM löst i 3 ml ren myrsyra och laddades på kolonnen i 100% lösningsmedel A (60% H 2 O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). Bundna produkter eluerades i en tvåstegs gradient av 0-60%, följt av 60-90% lösningsmedel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) vid en flödeshastighet av 10 ml / min. De viktigaste produkterna som ingår i varje fraktion enligt SDS-PAGE-analys (figur 5) indikeras ovanför kromatogrammet med koderna assigned i figur 2. Se Optimering av HPLC-gradienteluering i diskussionen avsnittet för mer information om hur du optimerar gradientförhållandena för olika peptidsekvenser.
Peptid produkter är lätt identifierbara i SDS-PAGE (figur 5) och MALDI-TOF (Fig. 6) analyser av de stora fraktionerna HPLC. DAP12TM peptider och, enligt vår erfarenhet, många andra hydrofoba TM peptider, kör med betydligt lägre migration priser jämfört med de förväntade molekylvikterna (3366 Dalton monomer och 6730 Dalton dimer för 15 N-märkta arter visas här). Detta beteende är direkt relaterad till mängden av peptiden laddades på gelén och resulterar i ett kontinuum av skenbara molekylvikter när mängden laddat varieras (data ej visade). Men identifierar förändringen i elektroforetisk mobilitet av topp 5 vid reduktion med 100 mM DTT (jämför spår 7 och 8) detta som den tvärbundna peptidenprodukt. MALDI-TOF-MS-analys bekräftar identiteten hos den dimera peptiden med den huvudtopp vid 6729,2 Dalton och avslöjar inga andra stora produkter (Figur 6). Det slutliga utbytet av ren disulfid-tvärbundna DAP12TM peptid homodimeren från denna beredning var 7,5 mg per liter odling.
Figur 1. DNA-sekvensen för trpLE-DAP12TM kodande regionen med dess aminosyra översättning. Är viktiga regioner av polypeptidsekvensen markerade och färgkodade med etiketter till höger. De unika interna metionin (Met) och cystein (Cys) rester för cyanogenbromid (CNBr) klyvning och oxidativ tvärbindning markeras i cyan och lila, resp. Hindlll och BamHI restriktionsställen (fetstil och understrukna) är unika i plasmiden och may användas för att ersätta den TM-peptidsekvensen med en annan sekvens av intresse.
Figur 2. Schematisk beskrivning av förfarandet. De viktigaste stegen i protokollet anges i textetiketter. Viktiga delar av trpLE-DAP12TM fusion är färgkodade enligt figur 1. Viktiga polypeptidprodukter från tvärbindningen och smälta steg är märkta AF och listas här med sin beskrivning och förväntade molekylvikter (15 N-märkt): [A] trpLE fragment: 13.769 Dalton, [B] intakta trpLE-DAP12TM fusion: 17.118 Dalton , [C] intakta trpLE-DAP12TM fusion dimer: 34.233 Dalton, [D] en enda kluvna trpLE-DAP12TM fusion dimer: 20.482 Dalton, [E] monomer DAP12TM peptid: 3366 Dalton, [F] dimert DAP12TM peptid: 6730 Dalton. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. SDS-PAGE-analys av trpLE-DAP12TM uttryck, rening, tvärbindning och smälta steg Kultur prover (spår 1, före induktion, steg 2,5, spår 2, skörd, steg 3,1). Och inklusionskroppsproteinerna prover prep (spår 3, supematant; körfält 4, pellets, steg 3,4) reducerades med 100 mM DTT. TFA eluat från nickel kolonn (spår 5 och 6, steg 6,1) och efter CNBr prov (spår 7 och 8, steg 6,3) kördes icke-reducerad (NR) och reducerades med 100 mM DTT (R) såsom indikeras att bekräfta disulfid-tvärbundna produkter. * Monomera och dimera peptidprodukts E och F är dåligt visualiseras genom Coomassie färgning och därför inte upptäckas i denna gel.
Figur 4. Omvänd-fas HPLC-rening av DAP12TM disulfid-tvärbunden dimer. Oxiderad, CNBr-digererad och lyofiliserades trpLE-DAP12TM fusionsprodukter (90 mg) löstes i 3 ml myrsyra (100%) och laddades på en Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) kolonn i lösningsmedel A (60% H 2 O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). En två-steg gradient av 0-60%, följt av 60-90% lösningsmedel B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) kördes vid en flödeshastighet av 10 ml / min för att eluera bundna produkter. Fraktioner samlas in som genomflöde (FT) och fyra stora toppar är markerade ovanför 214 nm absorbans trace (AU: godtyckliga undess) och de stora produkter som ingår i varje fraktion anges med de koder som tilldelats i figur 2. Den önskade DAP12TM tvärbunden produkt topp är skuggad.
Figur 5. SDS-PAGE-analys av omvänd fas HPLC produkter. Genomflöde (FT) och topp 1 prover kördes icke-reducerad. Peak 2, 3 och 4 prover kördes både icke-reducerade (NR) och reduceras genom behandling med 100 mM DTT (R) för att kontrollera identiteten av disulfid tvärbundna produkter. De viktigaste produkterna i varje fraktion (med sina koder tilldelade i figur 2) var [FT, PK1]: A, trpLE fragment, [PK2]: B, intakt trpLE-DAP12TM fusion monomer och C intakt fusion dimer, [Pk3]: D, singel-kluvna trpLE-DAP12TM-dimer och E, monomer DAP12TM peptid, [PK4]: F, disulfid-tvärbunden DAP12TM dimer. * Som diskuterats (se REPRESENTATIVA REULTS), gör en koncentrationsberoende förskjutning i mobilitet med låg MW produkter Pk3 (NR och R) och PK4 (R) verkar vara olika molekylvikter även om båda produkterna är monomera peptid.
Figur 6. MALDI-TOF-masspektrometrisk analys av HPLC-renad peptid DAP12TM dimer. Ett prov av HPLC-fraktion 4 (1 pl) blandades 1:1 med en mättad lösning av sinapinsyra (SA) matris i acetonitril och spotted ovanpå ett tunt skikt av torkad SA matrisen från en mättad lösning framställdes i etanol. MALDI-TOF-analys avslöjar en produkt vid den förväntade DAP12TM peptiden tvärbunden dimer massaav 6730 Dalton (6729,2098, 15 N-märkt) samt en mindre produkt på 3365,7105, troligen de dubbla joniserade arter. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uttryck av trpLE-TM fusioner. Enligt vår erfarenhet är trpLE-TM fusioner dåligt uttryckt i rikt odlingsmedium vid 37 ° C och odlingsbetingelser som beskrivs här har visat sig vara framgångsrika för många olika sekvenser innehållande 1-4 TM domäner med avkastningen varierar 50 till 150 mg / l av ren, intakt fusion. Fusioner kodning tre-eller fyra-TM GPCR fragment (humant CCR5 TM1-TM3 och TM4-TM7, respektive) eller en kärna katalytisk fragment av humant signalpeptid peptidas (fyra TM-domäner, se ref 15) representerar den lägsta i detta område av uttryck nivåer, medan DAP12TM varianter med nära anknytning till den sekvens som används här representerar den högsta delen av intervallet (opublicerade data). Den optimala IPTG Koncentrationen bör bestämmas experimentellt för varje ny sekvens. Vår standard är 0,1 mm, och högre koncentrationer (upp till 1 mM) vanligtvis resulterar i kraftigt minskad avkastning på grund av både lägre uttrycksnivåer och lägre kultur densitet ent skörd (se till exempel Figur 1A i referens 7).
Variationer på den presenterade protokollet. Det protokoll som beskrivs här beskriver framställningen av en disulfid-tvärbunden TM peptidkomplexet, den DAP12TM homodimeren 8. Alternativt, är protokollet enkelt anpassas för att producera monomera peptider genom att utelämna de två tvättstegen för att avlägsna reduktionsmedel och oxidera de bundna produkterna (4,3 och 4,4). Vi har tidigare använt en annan variant av det förfarande som rapporterats här att producera en kovalent stabiliserad TM peptidkomplexet representerar trimera DAP12-DAP12-NKG2C TM montering (se referens 8 och metoder som beskrivs däri). I denna ansökan har en 1-TM trpLE-DAP12 fusion och en 2-TM trpLE-DAP12-NKG2C fusion blandas i kulturen skörd före inkludering kropp beredning (steg från 3,1 till 3,2). Förfarandet inkluderade en extra HPLC-steg för att isolera det heterodimera tvärbundna trpLEfusion produkten från sura eluatet (steg 5,3) före CNBr Digest. C3 rening av de peptidprodukter resulterade i utvinning av ett disulfidkorskopplade-DAP12TM dimer i vilken en sträng bar NKG2C TM-domänen som en i-ram C-terminal fusion. Lösningen NMR strukturen i denna komplex i detergentmiceller bekräftade att NKG2C TM-domänen samman med DAP12 i dess ursprungliga, anti-parallell orientering 8. De extra stegen i denna variation reducerade signifikant utbytet av den slutliga produkten: en typisk framställning gav 8-10 mg peptid "trimer" från 4L av en fusion i kombination med ett överskott av den andra. Denna variation är en bra utgångspunkt protokoll för forskare som vill producera disulfid-stabiliserade komplex innehållande två olika TM-sekvenser.
Anmärkningar om nickel-affinitetsrening. Elueringen av protein från den torkade nickel kolonnen med användning av koncentrerad syra är ett ovanligt förfarande, och är inte mottaglig för re-Användning av nickel-matrisen. Försök att eluera extremt hydrofoba trpLE-TM fusioner med imidazol eller EDTA resulterade i ofullständig återhämtning av protein och de tvärbundna species företrädesvis kvarhålles på kolonnen (opublicerade resultat). Den rekommenderade mängden nickel matris och den natten batch-bindande protokoll har noga optimerats för att mätta matrisen med trpLE-TM protein och därigenom minimera samtidig rening av föroreningar. Vi återhämta rutinmässigt mycket rena produkter med avkastning som avsevärt överstiger den annonserade bindningskapacitet av Sigma HIS-Välj Nickel affinitetsmatris (15-20 mg / ml harts). Den syraeluering eliminerar också mellanliggande steg som krävs för att övergången till CNBr smälta, och den ökade avkastningen på tvärbundna produkter mer än uppväger kostnaden för nickel matris, särskilt när märkning med dyra stabil-isotop reagenser för NMR.
Cyanogenbromid smälta förhållanden. Release avkondenserade TM peptider från trpLE i CNBr utförs vanligen med användning av 70% myrsyra som lösningsmedel eftersom både reaktionshastigheten och proteinlöslighet är mycket gynnsamma under dessa betingelser. Dock måste behandlingstider hållas relativt kort (under 1 timme för sammandrag) för att undvika formyl förestring av serin-och treoninrester 16,17 och möjligen I-formylering av tryptofanrester 18, ändringar som är detekterbara genom masspektrometri som arter vars observerade massan är 28 (n) Dalton relativt den förväntade massan. Vår preferens för TFA som beskrivs här undviker dessa modifieringar helt och hållet. Enzymatisk klyvning av en trpLE-TM sammansmältning med faktor Xa proteas i 1% Triton X-100 har rapporterats 11, men den dåliga lösligheten av de flesta trpLE-TM fusioner och komplikationen av klyvningsstället otillgänglighet i detergentmiceller förmodligen begränsa den allmänna användbarheten av detta tillvägagångssätt.
Omvänd-fas HPLC-rening av peptide produkter från CNBr Digest är den mest utmanande steg i denna procedur och kommer sannolikt att kräva optimering för varje ny trpLE-TM sekvens. Följande iakttagelser kommer från bearbetning av många olika sekvenser och kommer sannolikt att vara fallet för de flesta trpLE-TM fusioner:
Val av stationär fas finner vi Agilent Zorbax Stabil-Bond C3 kolonner (300 Å porstorlek, 5 pm partikelstorlek). Vara en överlägsen stationär fas när det gäller selektivitet, upplösning och stabilitet under tunga exponering för koncentrerad syra. Semipreparativ (9,4 mm diameter) och preparativ skala (21,2 mm i diameter) storlekar finns och har fungerat mycket bra i våra händer. C4, difenyl och cyanopropyl stationära faser kan också ge användbart alternativ peptid selektivitet i en liknande hydrofobicitet räckvidd jämfört med C3.
Beredning av smälta produkter för HPLC. Upplösning av frystorkade CNBr smälta produkter i snyggt förMIC-syra ger de bästa resultaten för HPLC-separation. Framställning i TFA eller organiska lösningsmedel, såsom acetonitril, trifluoretanol och dimetylformamid resulterar ofta i lägre löslighet, minskad kolonn bindning och / eller eluering av produkterna i breda toppar som innehåller flera arter. Försiktighet måste vidtas för att förbereda produkter i myrsyra omedelbart före kolumn lastning eftersom långvarig exponering kan leda till formyl modifiering av peptid sidokedjor 16-18 som diskuterats ovan.
Optimering av HPLC-gradienteluering. Vi brukar börja med 10-20% acetonitril eller 5-10% isopropanol i vatten med 0,1% TFA som lösningsmedel A. TrpLE-TM-fusioner och deras smälta produkter lösta i myrsyra binder C3 kolumnen som mycket som 40% acetonitril som visas här (figur 4). Mycket av den frigjorda trpLE fragmentet kan strömma igenom under dessa betingelser (Notera att trpLE fragmentet är det enda proteinet produkten i FTfraktion: Figur 5, spår 1), och vi har utnyttjat denna observation att öka den totala bindningskapaciteten hos kolonnen för de önskade produkterna. Acetonitril och isopropanol är mycket effektiva som gradient lösningsmedel, och vi ofta fram till våra slutliga gradientbetingelser genom blandning redan existerande lösningsmedelslösningar att modifiera elueringsprofiler, vilket resulterar i ibland udda men effektiva recept såsom 75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1 % TFA-lösning som används som lösning B för DAP12TM reningen visas här. Extremt hydrofoba produkter som var problematiska har eluerats med acetonitril eller isopropanol med tillsats av upp till 10% trifluoretanol (TFE) och ökade koncentrationer av TFA (upp till 0,3%) i både A och B (opublicerade resultat). Andra har rapporterat goda resultat med användning av butanol / ättiksyra mobila faser med en C4 stationär fas 9.
Analys av smälta produkter. Båda större analystekniks används här,, SDS-PAGE och MALDI-TOF MS kan kompliceras av den extremt hydrofoba naturen hos trpLE-TM produkter. Lyofiliserade analytiska prover från CNBr / TFA smälta reaktioner och HPLC-fraktioner körs ibland så hög molekylvikt aggregat på SDS-PAGE geler. Vi finner att behandling av lyofiliserade prover med en liten volym av HFIP och förnyad lyofilisering innan förberedelse för SDS-PAGE ofta rättar till detta problem. TM peptidsekvenser inte heller kan lätt joniseras under MALDI-TOF MS-analys, och kan därför ge mycket svaga signaler. Vi har använt en optimerad procedur för framställning TM peptid prover i vilka en mättad lösning av sinapinsyra (SA) i etanol först spotted på plattan och torkas för att göra ett enhetligt tunt skikt av matris. Ett prov av peptid-innehållande HPLC-fraktion blandades 1:1 med en mättad lösning av SA i acetonitril sedan spotted ovanpå det torkade matrisskiktet. I våra händer, Denna metod ger mellan två och sex gånger större signal-till-brus jämförad till spotting peptid: SA blandning direkt på en ren MALDI platta.
Downstream applikationer. Metoder för beredning TM peptidkomplex i lipid eller rengöringsmedel system för lösning NMR och andra nedströms tillämpningar varierar kraftigt och måste vanligtvis noggrant skräddarsys för varje nytt system och tillämpning. En fullständig diskussion av de inblandade parametrarna är därför väl utanför ramen för detta protokoll artikeln. För information om provberedning från framgångsrika program med lösning NMR hänvisar vi läsaren till dessa senaste omdömena om ämnet 1,19 och referenser däri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansieringen för detta arbete ges av den nationella hälso-och Medicinska forskningsrådet i Australien (NHMRC projektbidrag 1.011.352 till MEC och MJC, oberoende forskningsinstitut Infrastruktur stödsystem [IRIISS] bidrag till WEHI) och den viktorianska regeringen (Veski Innovation Fellowship till MEC; Viktorianska delstatsregeringen operativa infrastruktur Stöd till WEHI). MEC är en drottning Elizabeth II kamrat av Australian Research Council. EFXB erkänner stöd från Norma Hilda Schuster Scholarship Program vid University of Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
