Summary
Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.
Abstract
Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.
Introduction
Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immunoreceptors são montados a partir de subunidades de proteínas de membrana múltiplas através de interacções entre os seus domínios TM (recentemente revisto em 1). Estas técnicas são aplicáveis a muitos outros sistemas de membrana de proteína, bem como uma grande variedade de métodos analíticos a jusante para além RMN solução. Enquanto o exemplo dado aqui utiliza resíduos de cisteína nativospara criar um complexo que imita o naturalmente ligado por dissulfureto da proteína, a concepção é igualmente adequado para a criação de pontes de dissulfureto para estabilizar complexos de engenharia que são normalmente mantidas juntas por mais fracas, de interacções não covalentes tais como homo-e hetero-dímeros de complexos TM receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da família de proteínas ou complexos de 2-4 heterodiméricos αβ integrina 5,6.
Extremamente hidrofóbicos sequências de péptidos tais como os derivados a partir da bicamada lipídica que mede porções de proteínas TM são assuntos extremamente difíceis para estudos bioquímicos e biofísicos. Para além de ser muito difícil de manipular utilizando proteína padrão e técnicas de química de péptidos, são frequentemente muito tóxicos para as células e, portanto, são difíceis de produzir por via recombinante. Nós e outros 7,8 9-11 têm tido um sucesso significativo expressar tais sequências peptídicas difíceis em bactérias tal como no quadro-carboxi-terminalfusões com uma versão modificada da sequência ΔtrpLE1413 derivado da E. coli operão trp 12. O polipéptido ~ 13 kDa trpLE codificada por esta sequência pode ser produzido em níveis elevados no âmbito de um promotor T7 e é totalmente localizado para corpos de inclusão em que os problemas relacionados com a toxicidade e / ou de instabilidade são contornadas. Modificação da sequência, por adição de um ácido amino-terminal 9 de histidina-tag 13 e eliminação de resíduos internos de metionina e cisteína da sequência de 14 trpLE permitidos trpLE peptídicos fusões de ser purificadas por cromatografia de afinidade de metal-ião e digerido com brometo de cianogénio (CNBr ) para libertar a sequência peptídica desejada. Temos utilizado com sucesso este sistema para expressar mais de uma dúzia de diferentes seqüências como fusões trpLE representam fragmentos de proteínas de membrana que contêm até quatro domínios TM (7,8 e resultados inéditos, ver também seção de discussão).
Oinovação chave neste protocolo é a identificação das condições em que os não estruturados e muito pouco solúvel trpLE-TM fusões podem ser eficientemente dissulfureto reticulado no contexto de um fluxo de trabalho simplificado. Vários aspectos da expressão de elevado rendimento, manipulação e purificação de produtos peptídicos foram também cuidadosamente optimizadas, e as recomendações aqui apresentadas são igualmente relevantes para a produção de não-reticuladas de dissulfureto (monomérico) Produtos TM peptídicas.
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Protocol
1. Clonagem e Design Construct
Clonar as sequências de interesse no vector PMM-peptídeo (que podem ser fornecidos a pedido), utilizando os locais de restrição HindIII e BamHI (ver Figura 1). O inserto de DNA de cadeia dupla deve incorporar, na seguinte ordem: um sítio HindIII, um único codão de metionina para a clivagem com CNBr, a E. peptídeo coli codões optimizados sequência codificadora, um codão de paragem, um sítio BamHI. Todas as outras metioninas no péptido devem ser eliminados e a sequência de dipeptídeo asp-pro deve ser evitada, uma vez que vai também ser clivado em condições ácidas.
Um único resíduo de cisteína devem ser introduzidos em cada sequência de péptido de acordo com o posicionamento desejado da reticulação dissulfito no complexo final, e todas as outras cisteínas deve ser mutado para serina. O plasmídeo transporta uma cassete de resistência à canamicina para selecção.
2. Expressão de trpLE-peptiFusão de
- Faça-se e estéril filtro M9/Kan meio de crescimento mínima (0,1 mM CaCl 2, 2 mM de MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH 4 Cl, 4 g de glicose / L, 50 mg / L de sulfato de canamicina). Suplemento com Centrum Completa A a zinco para fornecer vitaminas do complexo B e metais vestigiais:. Dissolver 1 comprimido em 40 ml de H2O com agitação durante 30 min, centrifugação para remover o material insolúvel e o sobrenadante filtro estéril laranja Solução estoque armazenamento a 4 ° C no escuro durante 2 semanas, e utilizar 4 ml / L em M9.
NOTA: 15 N-NH 4 Cl enriquecido, 13 C-glucose enriquecida ou outros precursores estáveis, marcada com isótopos podem ser incluídos no meio M9, nesta fase, se desejado. - Inocular uma cultura de 100 ml de arranque a partir de recém-transformadas BL21 (DE3) estirpe E. coli em meio M9/Kan. Crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
- Na manhã seguinte, verificar a DO600 da cultura iniciadora - este deve estar na gama de 2 ou superior. Dilui-se a 100 ml da cultura de arranque em 1 l de volume total de Centrum suplementado meio M9. Dividido em dois frascos de 2 L confundidos (500 ml de cultura em cada frasco) e crescer a 37 ° C com agitação a 140 rpm até que a DO600 atinge 0,6.
- Ajuste a temperatura agitador a 18 ° C e continuar a agitar durante 1 hora, permitindo que as culturas para refrigerar completamente antes da indução.
- Tomar uma amostra de pré-indução por análise SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD = 1 600), em seguida, adicionar IPTG para 0,1 mM de concentração final para induzir a expressão da fusão do peptídeo trpLE. Continuar a crescer a 18 ° C/140 rpm durante a noite (16-20 horas) sob indução IPTG.
3. Preparação inclusão Corpo e Encadernação matriz de níquel
- A DO final 600 de culturas de expressão durante a noite em meio mínimo é variável e should estar compreendida entre 2,5 e 5,0. Tomar uma amostra para análise de SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD 600 = 1) e recolher as células por centrifugação durante 20 min a 5.000 x g.
- Ressuspender o sedimento de células a partir de 1 L de cultura em 50 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). As suspensões de células podem ser armazenadas congeladas para posterior processamento.
- Lisar as células por sonicação em gelo na saída máxima durante 1 min e repouso em gelo durante 5 min. Nós usamos um sonicador Misonix 3000 (saída máxima de 600 watts), com uma ponta de ½ polegada de alta intensidade substituível. Repita sonicação / arrefecimento por três ciclos.
- Colete insolúvel de corpos de inclusão do material (IB) por centrifugação durante 15 min a 20000 xg e desprezar o sobrenadante. Uma camada, solto fino de cor clara de detritos celulares pode ser visível na parte superior do sedimento denso IB, o que pode ser lavado com água ou tampão com agitação suave. Passos 3.3 e 3.4 podem ser repetidas para melhorar a pureza da fracção de IB se desivermelho. As amostras de pellet e sobrenadante de material deve ser tomado para análise de SDS-PAGE para confirmar a localização trpLE-TM fusão de corpos de inclusão.
- Dissolver IB pelotas em solução de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), utilizando-se 25-50 ml por litro de cultura processado. Esta etapa irá exigir várias horas com agitação e sonicação leve ocasional.
- Limpar o lisado IB por centrifugação durante 1 hora a 75,000-100,000 xg e 20 ° C. Decantar o sobrenadante e filtra-se através de uma membrana de 0,2 | iM.
- Combina-se o lisato limpo IB, num tubo cónico de 50 ml ou de um recipiente maior, que pode ser fechada de forma segura, com resina de afinidade de níquel que foi lavado com água e equilibra-se a solução de guanidina. Use resina 3-4 ml resolvido por litro de cultura processado por fusão que expressam a um grau similar como trpLE-DAP12TM aqui mostrado (Figura 3, pista 2). Ligam descontínuo, incubando durante a noite na sala de t emperatura com mistura suave.
4. Na coluna de reticulação oxidativa
- Carregar o IB suspensão resina lisado / níquel em uma coluna vazia de fluxo por gravidade com o apoio leito poroso, adicionando continuamente até que todo o volume flui. Coletar e colocar de lado o fluxo contínuo, o que ainda pode conter proteína de fusão não ligado.
- Lava-se a resina de níquel por escoamento por gravidade, com 5 volumes de leito de uma solução de ureia (ureia 8 M, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 200 mM), contendo 5 mM β-ME.
- Lava-se a resina de níquel de novo com 5 volumes de leito de uma solução de ureia sem β-ME.
- Lava-se a resina de níquel de uma terceira vez com 5 volumes de leito de uma solução de ureia que foi suplementado com 20 mM de CuSO4 e 2 mM de glutationa oxidada. Após esta lavagem, feche a saída da coluna e incuba-se 30 min à temperatura ambiente para permitir a formação de ligações dissulfureto máxima.
5. TFA eluição e Quantificação
conteúdo "> ATENÇÃO: ácido trifluoroacético (TFA) provoca queimaduras graves em contacto com a pele e os vapores são altamente irritantes TFA concentrado deve ser usado apenas em um capuz químico aprovado fumos com óculos de proteção e luvas sem látex Verifique a compatibilidade química de todos.. materiais utilizados; polipropileno é compatível com todas as etapas deste protocolo.- Lavar a solução de ureia a oxidante com 10 volumes de leito de água e secar o leito da coluna por aplicação de uma linha de vácuo para a saída da coluna.
- Fechar a saída da coluna e adicionar 1,5 volumes do leito de puro (99-100%) de TFA. Agita-se a resina de níquel com uma pequena espátula para assegurar uma exposição a ácido e incubar durante 5 min. Abrir a saída da coluna e recolher o eluato ácido, pressurizando suavemente com uma seringa ou uma linha de ar comprimido, se necessário, para empurrar para fora de todo o líquido.
- Repetir o passo de eluição do ácido com mais 1,5 volumes do leito de TFA puro. Trabalhar rapidamente nesta etapa, para evitar a dissolução completa do Beaded agarose matriz. Produção de proteína pode ser determinada, neste ponto de acordo com a equação de Beer-Lambert e o coeficiente de extinção molar teórica da sequência trpLE-péptido. Diluir a amostra do eluato de TFA (01:20 - 01:50), em trifluoroetanol (TFE) e medir a absorvência a 280 nm, utilizando-se TFA / TFE para a mesma diluição como um branco.
6. Digestão CNBr
ATENÇÃO: O brometo de Cyanogen (CNBr) é extremamente tóxico e deve ser tratado apenas em um capuz químico aprovado fumos. PPE incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas sem látex são absolutamente necessários. CNBr é reativa à umidade e deve estar à temperatura ambiente antes de abrir. Contacte o seu escritório de segurança institucional para obter instruções sobre a neutralização / eliminação de CNBr contaminados soluções e materiais.
- Dilui-se o eluato até à concentração de ácido de 80% TFA final por adição gota a gota de água enquanto se mistura com cuidado. Se se formar um precipitado, umadd volta de um pequeno volume (0,5 a 1 ml) de TFA puro, até a solução fique límpida, em seguida, re-corrigir a 80% com água. Tomar uma amostra de 5 ul de pré-digest por análise SDS-PAGE, a congelação em azoto líquido e a liofilização da amostra imediatamente.
- Adicionar cristais de CNBr de aproximadamente 0,2 g / ml, tendo o cuidado para pesar o produto químico tóxico com segurança fechados, em pré-doseados tubos ou usando uma balança no interior do exaustor de fumos química. Misture suavemente até que esteja completamente dissolvido. Lavar e selar o recipiente de reacção sob atmosfera de gás inerte (azoto ou árgon fluxo) e incubar 3-4 horas à temperatura ambiente, protegida da luz.
- Dê uma amostra de 5 pós digerir-ul de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. Transferir a reacção de digestão com uma cassete de celulose regenerada ou da tubagem de diálise (o acetato de celulose se dissolve em ácido concentrado), com um corte de peso molecular de 3,5 kDa, ou menos, de acordo com o tamanho do complexo de péptido esperado. Dializar durante a noite a 4 L de água nocoifa química para reduzir a concentração de TFA e decompor qualquer CNBr que não reagiu. Deixar espaço na cassete de diálise ou tubo de um aumento significativo no volume (tanto como duas a três vezes), durante a diálise durante a noite.
- Remover a solução de reacção com dialisado precipitado suspenso a partir da cassete de diálise ou tubo (a maior parte da proteína irá precipitar quando a concentração de TFA é reduzido), e transferir a suspensão para tubos de 50 ml cónicas. Congelar e liofilizar para remover a água e vestígios de CNBr / TFA. Este passo é provável que requerem vários dias.
ATENÇÃO: Tanto a reação digerir dialisado e da água de diálise deve continuar a ser tratada como tóxico e tratados / eliminados com as devidas precauções. - Amostras de culturas de fases de indução e de pré-colheita, de corpos de inclusão do sobrenadante e sedimento, eluído TFA e digerido CNBr-material pode ser analisada por SDS-PAGE. Preparar as amostras por meio de aquecimento a 95 ° C em Invitrogen NuPAGE LDS sampltampão e. TFA eluato e amostras digest deve ser preparada em condições tanto redutoras e não redutoras para facilitar a identificação do produto e avaliação de reticulação oxidativa.
- Separa-se as amostras sobre um gel NuPAGE 12% Bis-Tris acrilamida pré-molde com MES SDS-tampão de corrida para resolução óptima dos produtos mais pequenos de resumo.
7. De fase reversa HPLC da purificação por dissulfureto reticulados complexos de péptido
- Dissolve-se a 100 mg de produtos liofilizados digest em 2-3 ml de ácido fórmico puro e carga para uma escala preparativa (21,2 x 150 mm) da Agilent ZORBAX SB-300 C3 coluna PrepHT em solvente A (tipicamente 10-20% de acetonitrilo e 5 -10% de isopropanol em água com 0,1% de TFA).
- Eluir os produtos digest com um gradiente de solvente B (acetonitrilo ou isopropanol com 0,1% de TFA) ao longo de pelo menos 5 volumes de coluna. Veja a discussão para sugestões sobre a seleção de condições de gradiente ideais para seqüências de peptídeos diferentes.
- Tomar50-100 ul de amostras de cada fracção de HPLC para a análise de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. A remoção dos solventes de HPLC é rápido e deverá estar completo em 1-2 horas.
- Preparar as amostras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE, por aquecimento a 95 ° C em tampão de amostra Invitrogen NuPAGE LDS sem agente redutor. Arrefece-se e dividir cada amostra uniformemente em dois tubos de microcentrífuga, adicionando 100 mM de DTT para uma delas e re-aquecimento breve.
- Separa-se as amostras reduzidas e não reduzidas por HPLC sobre uma NuPAGE 12% de gel de acrilamida tris-bis pré-molde com MES SDS-tampão de corrida, como acima. Pequenas, peptídeos hidrofóbicos muitas vezes não ocupam Coomassie mancha bem e pode não funcionar em seus esperados pesos moleculares. No entanto, a comparação das amostras reduzidas e não reduzidas deve facilitar a identificação dos produtos de péptidos com ligações cruzadas e de avaliação da pureza.
- Analisar os péptidos candidatos fracções contendo por laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa (ver discussão) para identificar as espécies de interesse e confirmar a sua massa esperada.
- Combinar, congelar e liofilizar fracções de HPLC contendo o puro, complexo de péptido TM reticulado e ter um peso seco do produto final para determinar o rendimento. Frações com conteúdo isopropanol alta não podem permanecer congelados. Se as fracções peptídicas secar até uma película, em vez de um produto macio liofilizado, re-dissolve-se o filme completamente em um pequeno volume de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar e liofilizar novamente. O produto HFIP tratado deve ser um cone pequeno, branco, que é facilmente inclinada para fora e pesados.
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Representative Results
O nível de expressão obtido para fusões trpLE é variável e fortemente dependente da sequência de amino-ácido do péptido ligado. Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de pré-indução (pista 1) e de tempo de colheita (pista 2) As amostras de uma cultura que produziu aproximadamente 120 mg de puro, fusão trpLE-DAP12TM intacta a partir de 1 litro de cultura e de 4 ml de matriz de níquel. Toda a fusão trpLE-DAP12TM foi localizado para a inserção do corpo de pelotas (pista 4), em oposição ao sobrenadante (pista 3).
Aproximadamente 70% do níquel de fusão purificada trpLE-DAP12TM dissulfureto foi reticulado com a forma dimérica (Figura 3, pistas 5 e 6: As amostras não reduzidas e reduzidas de eluato de TFA). Este é um resultado típico para a fusão trpLE-DAP12TM, mas a eficiência de ligação transversal varia de acordo com a colocação de cisteínas de engenharia. Os produtos peptídicos DAP12TM não são prontamente identificáveis no total de amostras de CNBr digest (pistas 7 e 8),mas a comparação de fusão intacta e fragmentos de bandas trpLE na amostra digest reduzida (pista 8) indica que a digestão da fusão foi de ~ 60% completa.
A Figura 4 mostra a separação dos produtos de digestão por HPLC de fase inversa preparativa usando uma coluna de escala C3 (capacidade de ligação total de ~ 200 mg de proteína). Uma vez que o teor de aromáticos da fusão é baixo que tipicamente controlar a absorvância a 214 nm em vez de 280 nm. Para esta corrida mg 90 do oxidado, digerido CNBr fusão trpLE-DAP12TM foi dissolvido em 3 ml de ácido fórmico puro e carregado na coluna de 100% de solvente A (60% de H 2 O, 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Produtos ligados foram eluídos com um gradiente de duas fases de 0-60%, seguido de 60-90% do solvente B (75% de isopropanol, acetonitrilo 25%, TFA a 0,1%) a uma taxa de fluxo de 10 ml / min. Os principais produtos contidos em cada fracção de acordo com a análise de SDS-PAGE (Figura 5) são indicados acima o cromatograma utilizando o assi códigosgned na Figura 2. Veja Otimização de eluição para HPLC gradiente na seção de discussão para mais detalhes sobre como otimizar as condições de gradiente para seqüências de peptídeos diferentes.
Produtos peptídicos são facilmente identificáveis no SDS-PAGE (figura 5) e MALDI-TOF (Figura 6) as análises de HPLC das fracções principais. Peptídeos DAP12TM e, em nossa experiência, muitos outros peptídeos hidrofóbicos TM, correr com as taxas de migração significativamente reduzidos em relação aos seus pesos moleculares esperados (3366 Dalton monômero e 6730 Dalton dímero para os 15 N-rotulados espécies mostradas aqui). Este comportamento está directamente relacionada com a quantidade de péptido carregado no gel e os resultados de um continuum de pesos moleculares aparentes como a quantidade carregada é variada (dados não mostrados). No entanto, a alteração na mobilidade electroforética de pico 5 após redução com DTT 100 mM (comparar pistas 7 e 8) identifica este como o péptido de ligação cruzadaproduto. MALDI-TOF MS análise confirma a identidade do péptido dimérico com o pico principal de 6729,2 daltons e não revela outros produtos principais (Figura 6). O rendimento final de dissulfureto puro reticulado DAP12TM peptídeo homodímero desta preparação foi de 7,5 mg por litro de cultura.
Figura 1. Seqüência de DNA da região trpLE-DAP12TM codificação com sua tradução de aminoácidos. Regiões-chave da seqüência polipeptídica são destacadas e um código de cores com rótulos para a direita. As únicas internos de metionina (Met) e cisteína (Cys) para resíduos de clivagem com brometo de cianogénio (CNBr) e reticulação oxidativa são destacadas em ciano e púrpura, respectivamente. HindIII e sítios de restrição BamHI (negrito e sublinhado) são únicos no plasmídeo e may ser utilizado para substituir a sequência de péptidos TM com outra sequência de interesse.
Figura 2. Diagrama esquemático do procedimento. As principais etapas do protocolo são indicados em rótulos de texto. Segmentos-chave da fusão trpLE-DAP12TM são codificados por cores, como na Figura 1. Os principais produtos polipeptídicas da reticulação e passos digerir são rotulados AF e estão listados aqui com sua descrição e esperados pesos moleculares (15 N-identificadas): [A] fragmento trpLE: 13.769 Daltons; [B] fusão trpLE-DAP12TM intacta: 17.118 Daltons , [C] intacta trpLE-DAP12TM fusão dímero: 34.233 Daltons; [D] único clivada fusão trpLE-DAP12TM dímero: 20.482 Daltons; [E] monomérica DAP12TM peptídeo: 3366 Daltons; [F] dimérica DAP12TM peptídeo: 6730 Daltons. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. A análise de SDS-PAGE de passos trpLE-DAP12TM expressão, purificação de reticulação, e digest amostras de cultura (faixa 1, de pré-indução, passo 2.5; pista 2, da colheita, etapa 3.1.) E amostras de corpos de inclusão prep (pista 3, sobrenadante; pista 4, de pelota; passo 3.4) foram reduzidas com DTT 100 mM. TFA a partir de eluato da coluna de níquel (pistas 5 e 6; passo 6.1) e de pós-CNBr amostra (pistas 7 e 8; passo 6.3) foram executados não reduzido (NR) e reduzido com 100 mM de DTT (R), tal como indicado para confirmar a dissulfureto reticulado produtos. * Produto péptido monomérico e diméricos E e F são pobremente visualizadas por coloração com Coomassie e por isso não são detectáveis nesta gel.
Figura 4. De fase reversa de purificação por HPLC de dímero de dissulfureto de reticulado DAP12TM. Oxidado, digerido CNBr e liofilizadas produtos trpLE-DAP12TM de fusão (90 mg) foram dissolvidos em 3 ml de ácido fórmico (100%) e carregou-se uma coluna ZORBAX Agilent SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) em coluna de solvente A (60% de H 2 O, 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Um gradiente de dois estágios de 0-60%, seguido de 60-90% do solvente B (75% de isopropanol, acetonitrilo, 25%, 0,1% de TFA) foi executada a uma taxa de fluxo de 10 ml / min para eluir os produtos ligados. Frações coletadas como flow-through (FT) e quatro picos principais são marcados acima do traço absorbância 214 nm (AU: arbitrária unsua), e os produtos mais importantes contidas em cada fracção são indicadas utilizando os códigos atribuídos na Figura 2. O desejado DAP12TM pico de produto reticulado é sombreada.
Figura 5. A análise de SDS-PAGE de produtos HPLC de fase reversa. Flow-through (FT) e um pico de amostras foram corridas não reduzido. Amostras de pico 2, 3 e 4 foram executados tanto não-reduzido (NR) e reduzido por tratamento com DTT 100 mM (R) a fim de verificar a identidade dos produtos dissulfureto reticulados. Os produtos principais em cada fracção (com os seus códigos atribuídos na Figura 2) foram [FT, PK1]: Um fragmento, trpLE; [Pk2]: B, intacto trpLE-DAP12TM fusão monomérica e C, dímero de fusão intacta; [PK3]: D, single-clivada trpLE-DAP12TM dímero e E, monomérica DAP12TM péptido; [PK4]: F, dissulfureto de dímero reticulado DAP12TM. * Como discutido (ver reults representante), uma mudança dependente da concentração em mobilidade faz com que os produtos de baixo MW em PK3 (NR e R) e PK4 (R) parecem ser diferentes pesos moleculares, embora ambos os produtos são peptídeo monomérica.
Figura 6. MALDI-TOF de espectrometria de massa de análise de HPLC-purificada DAP12TM péptido dímero. Uma amostra de HPLC correspondente a 4 (1 ul) foi misturado 1:1 com uma solução saturada de ácido sinapinico (SA), em acetonitrilo e matriz visto no topo de uma camada fina de matriz SA seca a partir de uma solução saturada preparado em etanol. MALDI-TOF análise revela um produto para o péptido esperado DAP12TM dímero reticulado massade 6730 Daltons (6729,2098; 15 N-identificadas), bem como um produto menor em 3365,7105, provavelmente a espécie de duplo ionizados. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo humano (quatro domínios TM, ver ref 15) representam o mais baixo desta gama de expressão níveis, enquanto variantes DAP12TM estreitamente relacionadas com a sequência utilizada aqui representam o mais alto fim do intervalo (dados não publicados). A concentração de IPTG óptimo deve ser determinado experimentalmente para cada nova sequência. Nosso padrão é de 0,1 mM, e concentrações mais elevadas (até 1 mM), geralmente resultar em rendimento significativamente reduzida devido a ambos os níveis mais baixos de expressão e uma menor densidade de culturat colheita (ver, por exemplo, na Figura 1A de referência 7).
Variações sobre o protocolo apresentado. O protocolo aqui descritas descreve a produção de um dissulfureto reticulado TM péptido complexo, o homodímero DAP12TM 8. Em alternativa, o protocolo pode ser facilmente adaptado para a produção de péptidos monoméricos, omitindo os dois passos de lavagem concebidos para remover o agente redutor e oxidar os produtos ligados (4.3 e 4.4). Temos anteriormente utilizada uma outra variação do processo descrito aqui para produzir uma ligação covalente estável TM complexo péptido representando o trimérico DAP12-DAP12-NKG2C TM montagem (ver referência 8 e os métodos aqui descritos). Nesta aplicação, um 1-TM fusão trpLE-DAP12 e um 2-TM fusão trpLE-DAP12-NKG2C foram misturados na fase de colheita de cultura antes da preparação de corpos de inclusão (passo 3,1-3,2). O processo incluía um passo extra de HPLC para isolar o heterodimérica reticulada trpLEproduto de fusão a partir do eluato de ácido (passo 5.3) antes de CNBr digest. C3 purificação dos produtos peptídicos resultou na recuperação de um dimero dissulfureto reticulado DAP12TM em que um filamento realizado o domínio TM NKG2C como uma fusão em grelha de terminal-C. A estrutura de RMN solução deste complexo em micelas detergentes confirmou que o domínio TM NKG2C montado com a DAP12 na sua origem, a orientação anti-paralela 8. Os passos adicionais neste variação reduziu significativamente o rendimento do produto final: a preparação típica produziu 8-10 mg de peptídeo "trímero" de 4L de uma fusão combinado com um excesso do segundo. Esta variação representa um bom protocolo de partida para pesquisadores que desejam produzir dissulfeto de instabilidade complexos contendo duas sequências diferentes TM.
Notas sobre níquel afinidade purificação. A eluição da proteína da coluna de níquel seco usando ácido concentrado é um procedimento incomum e não é passível de reUtilização da matriz de níquel. Tentativas para eluir o extremamente hidrofóbicos trpLE-TM fusões utilizando imidazole ou EDTA resultou em recuperação incompleta da proteína e as espécies reticuladas foram preferencialmente retido na coluna (resultados não publicados). A quantidade recomendada de matriz de níquel e o protocolo de ligação em lotes durante a noite foram cuidadosamente optimizadas para saturar a matriz com trpLE-TM proteína e, assim, minimizar a co-purificação de contaminantes. Rotineiramente recuperar produtos muito puros com rendimentos que ultrapassam significativamente a capacidade anunciada de ligação da Sigma HIS-Select Nickel Affinity Matrix (15-20 resina mg / ml). A eluição do ácido também elimina passos intermediários necessários para a transição para a digest com CNBr, eo rendimento aumentado de produtos reticulados mais do que compensa o custo da matriz de níquel, em particular quando a marcação com isótopos estáveis caros reagentes para RMN.
Cianogênicos brometo condições digerir. Versão dofundido a partir de peptídeos de TM em trpLE CNBr é geralmente realizada usando 70% de ácido fórmico como solvente, porque tanto a taxa de reacção e a solubilidade da proteína é altamente favorável sob estas condições. No entanto, os tempos de tratamento deve ser mantida relativamente curto (menos de 1 hora para a digest) para evitar a esterificação dos grupos formilo resíduos de serina e treonina e, possivelmente, 16,17 I-formilação de resíduos de triptofano 18, modificações que são detectáveis por espectrometria de massa como espécies cuja massa observada é 28 (n) em relação ao Daltons a massa esperada. A preferência por TFA, conforme descrito aqui evita estas modificações completamente. A clivagem enzimática de uma fusão trpLE-TM utilizando factor Xa protease de 1% de Triton X-100 foi relatado 11, mas a fraca solubilidade da maioria dos trpLE-TM fusões ea complexidade da inacessibilidade local de clivagem em micelas detergentes provavelmente limitar a utilidade geral das esta abordagem.
De fase reversa de purificação por HPLC de peptiDe produtos da digestão CNBr é o passo mais desafiador neste procedimento e é provável que requerem otimização para cada seqüência trpLE-TM novo. As seguintes observações vêm de processamento muitas seqüências diferentes e provavelmente verdade para a maioria dos trpLE-TM fusões:
Selecção de fase estacionária Encontramos Agilent ZORBAX Stable colunas C3-Bond (tamanho do poro 300 Å, tamanho de partícula 5 um). Ser uma fase estacionária superiores em termos de selectividade, o poder de resolução e estabilidade sob forte exposição ao ácido concentrado. Semi-preparativa (9,4 mm de diâmetro) e preparativa escala (21,2 mm de diâmetro) tamanhos estão disponíveis e têm um desempenho muito bom em nossas mãos. C4, difenilo e cianopropilo fases estacionárias podem também proporcionar selectividade peptídeo alternativo útil em uma variedade de hidrofobicidade semelhante comparado com C3.
Preparação de digerir produtos para HPLC. Dissolução de produtos liofilizados CNBr digerir em puro paramic ácido proporciona os melhores resultados para a separação por HPLC. Preparação em TFA ou solventes orgânicos, tais como trifluoroetanol, acetonitrilo e dimetilformamida muitas vezes resulta em menor solubilidade, reduzido coluna de ligação e / ou de produtos de eluição em picos largos que contêm múltiplas espécies. Deve ser tomado cuidado para preparar produtos em ácido fórmico imediatamente antes do carregamento da coluna devido a exposição prolongada pode resultar na modificação de cadeias laterais de peptídeos formil 16-18 como discutido acima.
Optimização de HPLC gradiente de eluição. Nós normalmente começam com acetonitrilo 10-20% ou 5-10% de isopropanol em água com 0,1% de TFA como solvente A. TrpLE-TM fusões e seus produtos de digest dissolvidos em ácido fórmico irá ligar a coluna C3, em que até 40% de acetonitrilo como aqui mostrado (Figura 4). Grande parte do fragmento trpLE libertada pode fluir através sob estas condições (Note-se que fragmento trpLE é o produto de proteínas apenas no FTfracção: Figura 5, a pista 1), e que têm aproveitado esta observação para aumentar a capacidade total de ligação da coluna para os produtos desejados. Acetonitrilo e isopropanol são muito eficazes como solventes de gradiente, e que muitas vezes chegam as nossas condições de gradiente finais por mistura de soluções pré-existentes de solventes para modificar perfis de eluição, resultando por vezes em receitas estranhas, mas eficaz, tal como o isopropanol a 75%, acetonitrilo a 25%, 0,1 solução de TFA% B utilizada como solução para a purificação DAP12TM mostrado aqui. Produtos extremamente hidrofóbicos que eram problemáticas foram eluídas utilizando acetonitrilo ou isopropanol com adição de até 10% de trifluoroetanol (TFE) e concentrações crescentes de TFA (até 0,3%), em ambas, A e B (resultados não publicados). Outros relataram bons resultados utilizando fases de butanol / ácido acético móveis com uma fase estacionária C4 9.
Análise dos produtos de digestão. Tanto a técnica de análise de grandes usados aqui, SDS-PAGE e MALDI-TOF MS, pode ser complicada pela natureza extremamente hidrofóbico de trpLE-TM produtos. Liofilizados amostras para análise de reações CNBr / TFA digerir e frações de HPLC, por vezes, tão alto peso molecular agregados em SDS-PAGE géis. Descobrimos que o tratamento de amostras liofilizadas com um pequeno volume de HFIP e re-liofilização antes da preparação de soluções de SDS-PAGE, muitas vezes este problema. Sequências peptídicas TM também pode não se ionizar facilmente durante MALDI-TOF MS de análise, e podem, portanto, dar sinais muito fracos. Usámos um processo optimizado para a preparação de amostras de peptídeos de TM em que uma solução saturada de ácido sinapinico (SA) em etanol é detectado pela primeira vez sobre a placa e seca-se para fazer uma camada uniforme fina de matriz. Uma amostra de péptido contendo fracção de HPLC misturadas a 1:1 com uma solução saturada de SA em acetonitrilo é então visto em cima da camada de matriz seca. Nas nossas mãos, isto resulta de métodos entre duas e seis vezes maior de sinal-para-ruído comparard para manchar o peptídeo: mistura SA diretamente sobre uma placa de MALDI limpo.
Aplicações a jusante. Métodos para reconstituir TM complexos de peptídeos em lipídios ou detergente sistemas de RMN solução e outras aplicações a jusante variam muito e normalmente deve ser cuidadosamente adaptado para cada novo sistema e aplicação. Uma discussão completa dos parâmetros envolvidos é, portanto, muito para além do âmbito deste artigo protocolo. Para mais detalhes sobre a preparação da amostra a partir de aplicações de sucesso usando RMN solução, remeter o leitor a esses comentários recentes sobre o assunto 1,19 e suas referências.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
O financiamento para esta obra é fornecida pelo National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC projeto de subsídio para 1.011.352 MEC e MJC; institutos de pesquisa independentes Regime de Apoio Infra-estrutura [IRIISS] subvenção para WEHI) e do Governo de Victoria (VESKI Inovação Fellowship ao MEC; vitoriana do Governo do Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional à WEHI). MEC é uma rainha Elizabeth II Fellow do Conselho de Pesquisa Australiano. EFXB reconhece o apoio do Programa de Bolsas de Norma Hilda Schuster, da Universidade de Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
