Summary
膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
膜タンパク質の脂質埋αヘリックスドメイン間の物理的相互作用は、膜タンパク質複合体のフォールディングおよびアセンブリに、このような膜貫通（TM）シグナリングと細胞表面のタンパク質レベルの規制などの動的過程において重要な役割を果たしています。特定の配列の関連付けを駆動する構造的特徴を理解することは、TMのペプチド複合体の洗練された生物物理学的および生化学的解析を必要とします。しかし、TMドメインの極端な疎水性は、標準的なペプチド化学の技術を使用して操作するためにそれらを非常に困難にし、適切な勉強材料の生産は、多くの場合、法外にやりがいを証明している。ペプチドは、安定した螺旋状のコンフォメーションとフォーム複合体を採用することができる条件を特定することは、 自発的に難易度のさらなるレベルを追加します。ここで我々は、 大腸菌で発現される材料からホモまたはヘテロ二量体のTMペプチド複合体を製造するための手順を紹介鞍部私は、このように比較的安価に核磁気共鳴（NMR）やその他のアプリケーション用の非天然アミノ酸のための安定同位体標識の取り込みを可能にします。この方法で重要な技術革新は、TM複合体が生成され、洗剤、脂質又は他の膜模倣材料に再構成したとき、安定した化学量論的で均質な構造を形成することができる共有結合 （ジスルフィド架橋）アセンブリのように精製されていることである。我々はまた、単一のTMドメインまたは架橋錯体を生成するかどうかも同様に適用可能であり、新しいTMシーケンスにこれらのメソッドを適応させるためのアドバイスを提供発現および精製のために慎重に最適化された手順を紹介します。
Introduction
このプロトコルは、細部私達は溶液NMRを用いた構造研究のための膜貫通（TM）ペプチドのジスルフィド安定な錯体を生成するために開発した手順を実行します。手順は、ΔtrpLE1413融合システムによってもたらされる堅牢な表現を利用しています（下記参照）と定義された組成のTMペプチド複合体は、現代の多次元NMR実験のために洗練された安定同位体標識技術を使用して生成することができます。私たちは、リンパ球活性化免疫受容体が（最近1日）は、TMドメイン間の相互作用を介して複数の膜タンパク質サブユニットから組み立てられる方法に関する重要な新情報が明らかになったいくつかのNMR構造を決定するためにこれらの技術を採用してきた。これらの技術は、他の多くの膜タンパク質のシステムだけでなく、溶液NMRに加え下流の分析方法の広い範囲に適用されます。ここに示す例では、ネイティブのシステイン残基を利用している間自然にジスルフィド結合タンパク質を模倣する複合体を作成するために、デザインを使用しても同様に、通常、そのようなホモとのヘテロ二量体TM複合体として弱く、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されている複合体を安定化するために設計されたジスルフィド結合を作成するのに最適です上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリータンパク質2-4またはヘテロαβインテグリン錯体5,6。
そのようなTMのタンパク質の脂質二重膜貫通部分に由来するもののような非常に疎水性のペプチド配列は、生化学的および生物物理学的研究のために非常に困難な課題である。標準タンパク質およびペプチド化学技術を用いて操作することは非常に困難であることに加えて、彼らはしばしば細胞に非常に有毒であり、したがって、組換え的に生成することは困難である。我々 7,8と他人9-11カルボキシ末端フレームのような細菌で、このような困難なペプチド配列を発現させる重要な成功を収めている大腸菌由来ΔtrpLE1413シーケンスの修正版への融合大腸菌trpオペロン12。この配列によってコードされるポリペプチドtrpLE〜13 kDaのは、T7プロモーターの下で高いレベルで製造することができると完全に毒性および/または不安定性に関連する問題が回避され、封入体に局在する。 trpLE配列からアミノ末端9 -ヒスチジンタグ13と内部メチオニンおよびシステイン残基の除去14許さtrpLE-ペプチド融合体は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、臭化シアン（CNBrを使用して消化するの添加による配列の改変）は、所望のペプチド配列を解放します。我々は、正常に、最大4つのTMのドメインを（;また、ディスカッションのセクションを参照してください7,8および未発表の結果）が含まれている膜タンパク質の断片を表すtrpLE融合としてダース以上の異なる配列を発現させるためにこのシステムを使用している。
ザこのプロトコルでは鍵の技術革新は、構造化されていないと非常に難溶性trpLE-TMの融合を効率的に合理化されたワークフローのコンテキスト内でジスルフィド架橋することができる条件の同定である。高収量の発現、取扱い及びペプチド生成物の精製のいくつかの側面も徹底的に最適化されており、ここに示した推奨事項は、非ジスルフィド架橋（モノマー）TMペプチド製品の生産のために均等に関連しているされています。
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Protocol
1。クローニングおよびコンストラクトのデザイン
HindIIIとBamHI制限部位を用いて、PMM-ペプチドベクター（リクエストに応じて提供することができます）（ 図1参照）に興味のある配列をクローン。 ;のCNBr切断のための単一のメチオニンコドン、E. HindIII部位：二本鎖DNAの挿入は、次の順序で、取り入れるべきコード配列を大腸菌コドン最適化ペプチド;終止コドン、BamHI部位。ペプチド内の他のすべてのメチオニンは排除されるべきであり、それはまた、酸性条件下で切断されるように、ジペプチドシーケンスASP-PROは避けるべきである。
ユニークなシステイン残基は最終的な複合体のジスルフィド架橋の所望の位置に応じて、各ペプチド配列中に導入されるべきであり、他のすべてのシステインがセリンに変異されるべきである。プラスミドは、選択のためのカナマイシン耐性カセットを運ぶ。
2。 trpLE-peptiの発現デフュージョン
- メイクアップし、無菌フィルターM9/Kan最小成長培地（0.1 mMのCaCl 2、2mMのMgSO 4を 、3グラム/ L KH 2 PO 4、7.5グラム/ LのNa 2 HPO 4·2H 2 O、0.5グラム/ LのNaCl、 1g / LのNH 4 Clを 、4g / Lのグルコース、50mg / Lの硫酸カナマイシン）。セントラムとサプリメントはビタミンB群や微量金属を提供するために亜鉛を完了して下さい：30分間混合しながら40ミリリットルのH 2 Oに1錠を溶かし、不溶性物質及び無菌フィルターオレンジ上清を除去するために遠心分離する。 2週間までとM9で4ミリリットル/ Lを使用して、暗所で4℃で保存原液。
注：必要に応じて15 N濃縮NH 4 Clを 、13 C濃縮グルコースまたは他の安定同位体で標識された前駆体は、この段階では、M9培地に含まれるかもしれません。 - 新たに形質転換されたBL21（DE3）株Eから100ミリリットルスターター培養液を接種M9/Kan培地中で大腸菌 。 200rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖。
- 翌朝、スターター培養物のOD 600を確認-これは2以上の範囲でなければならない。セントラム-M9培地1Lの総量に100ミリリットルスターター培養液を希釈します。 2 2Lのバッフル付きフラスコ（各フラスコ内の500mlの培養）に分割して、37で成長℃のOD 600が 0.6に達するまで、140 rpmで振とう。
- ℃と文化が誘導前に完全に冷却させ、1時間振とうし続けて18にシェーカーの温度を設定します。
- （OD 600 = 1で培養液から50μlの同等品）、SDS-PAGE分析のための事前誘導サンプルを採取し、trpLE-ペプチド融合の発現を誘導し0.1mMの最終濃度になるようにIPTGを加え。 18°IPTG誘導下で一晩C/140回転（16-20時間）で成長し続けています。
3。封入体の調製およびニッケルマトリックスバインディング
- 最少培地で一晩発現培養の最終OD 600は、変数と笙です自民は2.5と5.0の間である。 SDS-PAGE分析のためのサンプルを取る（OD 600 = 1で培養液から50μlの同等品）と5000×gで20分間遠心して細胞を回収します。
- 再懸濁した細胞ペレットを50mlの溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH 7.5、20mMのβ-ME、0.2MのNaCl）で1リットルの培養液から。細胞懸濁液は、後の処理のために凍結保存することができます。
- 5分間氷上で1分間、残りの最大出力時の氷上で超音波処理により細胞を溶解する。我々は、½インチ高輝度交換可能なチップとMisonixソニケーター3000（最大出力600ワット）を使用します。 3サイクルの超音波処理/冷却を繰り返します。
- 20,000 xgで15分間遠心分離して不溶性の封入体（IB）の材料を収集し、上清を捨てる。明るい色の細胞破片の緩い、薄層は緻密IBペレットの上に表示されることがありますが、これは、穏やかに攪拌しながら水または緩衝液を用いて洗い流すことができる。ステップ3.3および3.4は、IB画分の純度を向上させるために繰り返すことができる場合デジ赤。ペレットと上清材料の試料を封入体にtrpLE-TM融合局在を確認するために、SDS-PAGE分析のために取られるべきである。
- 処理された培養液1リットル当たり25〜50ミリリットルを用いて、グアニジン溶液（6M塩酸グアニジン、50mMのトリス-HCl pH 8.0、200mMのNaCl、1％トリトンX-100、5mMのβ-ME）のIBペレットを溶解する。このステップでは、撹拌、時折穏やかな超音波処理して数時間を必要とするでしょう。
- 75,000-100,000 xgで1時間遠心分離によりIBのライセートをクリアして、20℃ 0.2μmの膜を介して上清とフィルタをデカントします。
- 50 mlコニカルチューブでクリアIBライセート、または水とグアニジン溶液に平衡で洗浄されたニッケルアフィニティー樹脂で、しっかりと閉じることができる大きな容器を兼ね備えています。 trpLE-DAP12TMます（ 図3、レーン2）ここに示されているように同程度に表現を融合に処理された培養液1リットル当たり3〜4ミリリットル沈殿した樹脂を使用しています。部屋トンで一晩インキュベートすることにより、バッチ·バインド穏やかに混合しながらemperature。
4。オンカラム酸化架橋
- ボリューム全体が流れるまで連続的に追加して、多孔質の床支持を持つ空の重力流列にIBの溶解物/ニッケル樹脂懸濁液をロードします。収集し、まだ結合していない融合タンパク質が含まれている場合があり素通りし、脇に置く。
- 5mMのβ-MEを含む尿素溶液の5ベッド容量（8M尿素、50mMのトリス-HCl pH 8.0、200mMのNaCl）で重力流によってニッケル樹脂を洗浄します。
- β-MEをせずに尿素溶液の5ベッドボリュームで再びニッケル樹脂を洗浄します。
- ニッケル樹脂の酸化グルタチオン、20μMのCuSO 4および2mMを補充された尿素溶液の5ベッドボリュームで三回目を洗ってください。この洗浄後、カラム出口を閉じて最大のジスルフィド結合の形成を可能にするために、室温で30分間インキュベートする。
5。 TFAの溶出および定量
コンテンツ"> 注意：トリフルオロ酢酸（TFA）が皮膚と接触すると、重度の火傷を引き起こし、煙は非常に刺激性がある濃縮TFAが眼の保護と非ラテックス手袋を使用して、承認され化学ドラフト内でのみ使用されるべきであるすべての化学的適合性をチェックします。材料の使用、ポリプロピレンは、このプロトコルのすべてのステップに対応しています。- 水10ベッドボリュームで酸化尿素溶液を洗い、カラム出口に真空ラインを適用することにより、カラム床を乾燥させてください。
- カラム出口を閉じて、きちんとした（99から100パーセント）TFAの1.5ベッドボリュームを追加します。酸にさえ露出を確保し、5分間インキュベートするための小さなスパチュラでニッケル樹脂をかき混ぜる。カラム出口を開き、すべての液体を押し出すために必要に応じて注射器や圧縮空気ラインで軽く圧し、酸溶出液を集める。
- きちんとしたTFAのさらに1.5ベッドボリュームと酸溶出ステップを繰り返します。 beadeの完全な溶解を回避するために、この段階で迅速に作業Dアガロースマトリックス。タンパク質収量はランバート - ベールの法則とtrpLEペプチド配列の理論モル吸光係数によれば、この時点で決定することができます。トリフルオロエタノール中のTFA溶出液（1:20〜1:50）（TFE）のサンプルを希釈し、ブランクと同じ希釈でのTFA / TFEを用いて、280nmの吸光度を測定します。
6。のCNBr消化
注意：臭化シアン（CNBr活性）は非常に有毒であり、承認された薬品はドラフト内でのみ扱われるべきである。安全メガネ、白衣、非ラテックス手袋などのPPEは絶対に必要です。 CNBrでは水分に反応性であり、開口部の前に室温に戻しておいてください。中和/ CNBrで汚染されたソリューションや物質の廃棄方法については、お使いの制度上の安全のオフィスへお問い合わせください。
- 穏やかに混合しながら水を滴下して80％のTFAの最終濃度になるように酸溶出液を希釈します。沈殿物が形成した場合は、ddは戻ってきちんとしたTFAの小さな体積（0.5〜1ml）の溶液を水で80％に再正しいその後、明確になるまで。液体窒素で凍結し、直ちに試料を凍結乾燥、SDS-PAGE分析のための5μlのプレダイジェストサンプルを取る。
- クローズド、予め秤量管で安全に有毒化学物質の重量を量るために世話をして、または化学ヒュームフード内バランスを使用して、約0.2グラム/ mlまでのCNBr結晶を追加します。完全に溶解するまで静かに混和します。洗ったあと、不活性ガス（窒素やアルゴン気流）の下で、反応容器を密封し、光から保護し、室温で3〜4時間インキュベートする。
- SDS-PAGE解析のために5μlのポストダイジェストサンプルを取るとフリーズし、直ちに凍結乾燥。予想されるペプチド複合体の大きさに応じて、3.5 10kDa以下の分子量カットオフを有する再生セルロース透析カセットやチューブ（セルロースアセテート濃酸に溶解する）にダイジェスト反応を転送します。で水4Lに一晩透析TFA濃度を減少させ、未反応のCNBr活性を分解する化学ヒュームフード。一晩透析中にボリュームが大幅に増加（同じくらい2〜3倍など）の透析カセットやチューブ内の空きスペースを残しておきます。
- 透析カセットやチューブから中断した沈殿物（TFA濃度が減少したときにタンパク質のほとんどが沈殿する）で透析した反応溶液を除去し、50 mlコニカルチューブに懸濁液を移す。凍結と水CNBR / TFAの痕跡を除去する凍結乾燥。このステップは数日を要する可能性があります。
注意：この透析ダイジェスト反応、透析水の両方が有毒で、適切な予防措置で配置/処理済みとして扱われることを継続する必要があります。 - プリ誘導や収穫の段階、封入体上清とペレット、TFA溶出液とCNBr活性消化された物質からの文化の試料をSDS-PAGEによって分析することができる。 95加熱することにより試料を調製インビトロジェンNuPAGE LDS sampl℃·電子バッファー。 TFA溶出液とダイジェストのサンプルが酸化架橋の製品識別と評価を容易にするために還元および非還元の両方の条件で準備する必要があります。
- 最小ダイジェスト製品の最適な解像度のMES-SDS泳動緩衝液を用いて12パーセントNuPAGEビス - トリスプレキャストアクリルアミドゲル上でサンプルを分離します。
7。ジスルフィド架橋ペプチド複合体の逆相HPLC精製
- 溶媒（典型的には10〜20％のアセトニトリルまたは5に分取スケール（21.2×150 mm）をAgilentのZORBAX SB-300、C3 PrepHT分カラムに2〜3ミリリットル端正なギ酸及び負荷に凍結乾燥されたダイジェストの製品の100 mgまで溶かす0.1％TFAを含む水でイソプロパノール-10％）。
- 少なくとも5カラム容量以上の溶媒Bの勾配（0.1％TFAを含むアセトニトリル又はイソプロパノール）でダイジェスト製品を溶出します。異なるペプチド配列に対する最適勾配条件の選択についての提案のための議論を参照してください。
- 取るSDS-PAGE分析及び凍結用の各HPLC画分を50から100μlのサンプルと直ちに凍結乾燥。 HPLCの溶媒の除去は急速であり、1〜2時間で完了しなければなりません。
- ノー還元剤とインビトロジェンNuPAGE LDSサンプルバッファーで95℃に加熱することにより、SDS-PAGEのために凍結乾燥のHPLCサンプルを準備します。それらのいずれかに100mMのDTTを追加し、再加熱簡潔に、クールと2マイクロ遠心チューブに均等に各サンプルを分割します。
- MES-SDSは、上記のようにバッファを実行していると12パーセントNuPAGEビス - トリスプレキャストアクリルアミドゲル上で還元および非還元HPLCのサンプルを分離します。小さな疎水性ペプチドはしばしばうまく染まるクマシーを取らないとその期待される分子量で実行されない場合があります。しかし、還元および非還元試料の比較は、架橋ペプチド製品および純度の査定の識別を容易にする必要があります。
- マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOで候補ペプチドを含有する画分を分析F）の質量分析（説明を参照）興味の種を同定し、その予想される質量を確認する。
- 組み合わせ、純粋な、架橋TMペプチド複合体を含むHPLC画分を凍結し、凍結乾燥し、収量を決定するために、最終製品の乾燥重量を取る。高いイソプロパノール含量を有する画分は、冷凍のままではないかもしれません。ペプチド画分は、純粋なヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）少量の完全に再溶解するフィルムは、フィルムではなく、ふわふわした凍結乾燥品まで凍結乾燥して、再度凍結乾燥した場合。 HFIP処理物は簡単にひっくり返して秤量する小さな白い円錐形にする必要があります。
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Representative Results
trpLE融合に達成発現のレベルは、変数および接続されたペプチドのアミノ酸配列に大きく依存しています。 図3に示すプレ誘導のSDS-PAGE分析（レーン1）とTime-of-収穫（レーン2）文化の1リットルと4ミリリットルのニッケルマトリックスからの純粋な、無傷trpLE-DAP12TM融合の約120 mgを得た培養物からのサンプル。上清（レーン3）とは対照的に、trpLE-DAP12TM融合のすべてが封入体ペレット（レーン4）に局在していた。
ニッケル精製trpLE-DAP12TM融合の約70％がダイマー（：TFA溶出液の非還元および還元サンプル図3、レーン5および6）にジスルフィド架橋であった。これはtrpLE-DAP12TM融合のための典型的な結果であるが、架橋効率は、操作されたシステインの配置によって異なります。 DAP12TMペプチド製品は、合計のCNBrダイジェストサンプル（レーン7と8）で容易に識別できませんは低下ダイジェストサンプル（レーン8）内にそのまま融合とtrpLE断片のバンドを比較すると、融合のその消化は約60％完了したことを示します。
図4は、分取スケールのC3列（全結合容量〜タンパク質の200 mg）を用いた逆相HPLCによるダイジェスト生成物の分離を示しています。融合の芳香族含有量が低いため、我々は一般的に214 nmのではなく、280 nmの吸光度をモニターします。酸化のこの実行90mgのは、たCNBr消化trpLE-DAP12TM融合は3ミリリットルニートギ酸に溶解し、溶媒100パーセントの列（60％のH 2 O、40％アセトニトリル、0.1％TFA）にロード。バインドされている製品を、10ml /分の流量で60から90パーセント溶媒B（75％イソプロパノール、25％アセトニトリル、0.1％TFA）によって続い0から60パーセントの二段階勾配で溶出した。 SDS-PAGE分析（ 図5）に記載の各画分に含まれる主要な製品はコードアッシーを使用してクロマトグラム上に示されている図2にgned。異なるペプチド配列にグラデーション条件の最適化の詳細については、ディスカッションセクションのHPLCグラジエント溶出の最適化を参照してください。
ペプチド製品は主要なHPLC画分のSDS-PAGE（ 図5）し、MALDI-TOF（ 図6）の分析で簡単に識別できます。 DAP12TMペプチドと、我々の経験では、多くの他の疎水性TMのペプチドは、その期待される分子量（ここに示されている15 N標識種について3366ダルトンモノマーおよび6730ダルトンダイマー）に比べ大幅に減少移行速度で実行されます。この動作は、量がロードとして直接見かけの分子量の連続で、その結果ゲル上にロードされたペプチドの量に関係している（データは示されていない）が変化する。しかし、100mMのDTT（レーン7と8を比較してください）を用いて還元する際にピーク5の電気泳動移動度の変化は、架橋されたペプチドであることを指定し製品。 MALDI-TOF MS分析では、6729.2ダルトンでの主要なピークを持つ二量体ペプチドの身元を確認し、他の主要な製品（ 図6）を明らかにしない。この準備から純粋なジスルフィド架橋DAP12TMペプチドホモダイマーの最終収率は培養液1リットル当たり7.5ミリグラムだった。
図1。そのアミノ酸翻訳をtrpLE-DAP12TMコード領域のDNA配列。ポリペプチド配列のキー領域が強調表示され、右側にラベルで色分け。臭化シアン（CNBr）切断および酸化架橋のためのユニークな内部メチオニン（Met）およびシステイン（Cys）残基がそれぞれ、シアン、紫色で強調表示されます。 HindIIIとBamHI制限部位（太字と下線）プラスミドとミリアンペアでユニークですyは、関心のある別のシーケンスで、TMペプチド配列を置き換えるために使用する。
図2。手順の概略図。プロトコルの主な手順は、テキストラベルに示されている。 trpLE-DAP12TM融合の重要なセグメントは、 図1のように色分けされています。架橋およびダイジェストステップからの主要なポリペプチド産物がAF標識され、それぞれの説明および予想される分子量（15 N標識）とここに記載されています：[] trpLEフラグメント：13769ダルトン、[B]はそのままtrpLE-DAP12TM融合：17118ダルトン、[C]は無傷trpLE-DAP12TM融合ダイマー：34233ダルトン、[D]は、シングル切断さtrpLE-DAP12TM融合ダイマー：20482ダルトン、[E]の単量体のDAP12TMペプチド：3366ダルトン、[F]の二量体のペプチドDAP12TM：6730ダルトン。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 trpLE-DAP12TM発現、精製、架橋およびダイジェスト手順のSDS-PAGE分析培養サンプル（レーン1、プリ誘導、ステップ2.5;レーン2、収穫、ステップ3.1）、封入体の準備サンプル（レーン3、上清、レーン4、ペレット、ステップ3.4）、100mMのDTTで還元された。ニッケルカラム（レーン5および6、ステップ6.1）からのTFA溶出液とポストのCNBrサンプル（レーン7と8、ステップ6.3）は非還元実行（NR）および100mMのDTT（R）と減少したように確認するために示されているジスルフィド架橋の製品。 *単量体と二量体のペプチド産物のEとFはクマシー染色によって可視化が不十分であり、したがって、このゲル上で検出されません。
図4。 DAP12TMジスルフィド架橋ダイマー。酸化したCNBr消化し 、凍結乾燥trpLE-DAP12TM融合産物（90 mg） の逆相HPLC精製は、C3 PrepHT分3ミリリットルギ酸（100％）に溶解し、Agilent ZORBAX SB-300にロードした溶媒中（21.2×150 mm）のカラム（60％のH 2 O、40％アセトニトリル、0.1％TFA）。 0から60までパーセントの二段勾配（75％イソプロパノール、25％アセトニトリル、0.1％TFA）を溶媒B 60から90パーセントが続くバインドされている製品を溶出するために10ml /分の流速で流した。画分は、フロースルー（FT）として収集し、4つの主要なピークは214 nmの吸光度トレース（AUの上側に記されています：任意の国連その）、各画分に含まれる主要な製品は、 図2に割り当てられたコードを使用して示されます。希望DAP12TM架橋生成物のピークは灰色になっています。
図5。逆相HPLC製品のSDS-PAGE分析。フロースルー（FT）とピーク1サンプルは、非還元を実行しました。ピーク2、3と4のサンプルは、（NR）の非還元の両方を実行して、ジスルフィド架橋物の識別情報を検証するために、100mMのDTT（R）で処理することによって減少した。 A、B、無傷trpLE-DAP12TM融合モノマーとC、無傷の融合ダイマー; [PK3]：; [PK2] trpLEフラグメント：各画分の主要な製品は、（ 図2に割り当てられたそれらのコード付）[FT、PK1]であった： D、シングル切断さtrpLE-DAP12TMのダイマーおよびEは、モノマーDAP12TMペプチド; [PK4]：F、ジスルフィド架橋ダイマーDAP12TM。 *として（代表結果予報を参照してください）説明したように、両方の製品は単量体ペプチドであっても、分子量が異なるように見える移動度の濃度依存シフトPK3（NRとR）とPK4（R）の低MWの製品になります。
図6。 HPLC精製DAP12TMペプチド二量体のMALDI-TOF質量分析。HPLC画分4の試料（1μl）をアセトニトリル中シナピン酸（SA）マトリックスの飽和溶液と1:1で混合し、薄い層の上にスポットしたエタノール中で調製飽和溶液からの乾燥されたSAの行列。 MALDI-TOF分析は、二量体の質量を架橋予想さDAP12TMペプチドで製品を明らかに6730ダルトン（6729.2098、15 N標識）のと同様3365.7105でマイナー製品、最も可能性の高い二重イオン化種。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
trpLE-TM融合の発現は我々の経験では、trpLE-TM融合が不十分37℃で豊かな培養培地中で表現され、ここに記載の培養条件は、利回りが及ぶと一から四、TMドメインを含有する多くの異なるシーケンスのために成功した証明した50〜150ミリグラム/純粋、無傷の融合のL。 3つまたは4つのTMのGPCRの断片（それぞれヒトCCR5 TM1〜TM3とTM4-TM7、）またはヒトシグナルペプチドペプチダーゼのコア触媒断片（4 TMのドメイン; refは15を参照）をコードする融合体は、式のこの範囲内の最低を表すレベルは、密接に配列に関連DAP12TM変種が範囲（未発表データ）の最高の終わりを表してここで使われている。最適なIPTG濃度は、それぞれの新しいシーケンスのために実験的に決定されるべきである。当社の標準は0.1 mmであり、高濃度（1mmまで）は通常による低い発現レベルと下位文化密度の両方に有意に減少し収量をもたらすトンの収穫（参考7の例図1Aを参照のこと）。
提示プロトコルのバリエーション。プロトコルはここで概説は、ジスルフィド架橋TMペプチド複合体、DAP12TMホモダイマー8の製造を記載している。一方、プロトコルは容易に還元剤を除去し、バインドされた製品（4.3と4.4）を酸化するために設計された2つの洗浄工程を省略することにより、単量体のペプチドを生成するように適合される。我々は以前の手順の別のバリエーションを使用していた三量体 DAP12-DAP12-NKG2C TMのアセンブリを（そこに記載されている参考文献8およびメソッドを参照してください）を表す共有結合で安定化されたTMのペプチド複合体を生成するためにここに報告した。このアプリケーションでは、1 - TM trpLE-DAP12融合と2 - TM trpLE-DAP12-NKG2C融合は、封入体の準備（ステップ3.1から3.2）に先立って文化の収穫の段階で混合した。手順は、trpLEを架橋ヘテロを単離するために余分なHPLC工程が含まれていたCNBrをダイジェスト前に酸溶出液（ステップ5.3）から融合産物。ペプチド製品のC3の精製は、一方の鎖がインフレームC-末端融合としてNKG2C TMドメインを運ばれるジスルフィド架橋DAP12TMダイマーの回復をもたらした。洗剤ミセル中でこの複合体の溶液NMR構造がNKG2C TMドメインはネイティブ、反平行の向き8 DAP12で組み立てていることを確認した。このバリエーションで追加の手順が大幅に最終生成物の収率を減少させた：典型的な製剤は、第二の過剰と組み合わせ1つの融合の4Lからペプチド "トリマー"の8-10 mgを得た。この変化は、2つの異なる TMの配列を含有ジスルフィド安定な錯体を生成するために希望する研究者のための良い出発プロトコルを表します。
ニッケルアフィニティー精製上の注意。濃酸を用いて乾燥させたニッケルカラムからのタンパク質の溶出珍しい処置であり、再検討する従順ではありませんニッケル行列の使い。イミダゾールまたはEDTAを使用して、非常に疎水性のtrpLE - TM融合を溶出する試みは、タンパク質の不完全リカバリをもたらし、架橋種が優先的に列（未発表データ）上に保持された。ニッケル行列と夜間のバッチ·プロトコルバインディングの推奨量は慎重trpLE - TMタンパク質とマトリックスを飽和させ、それによって、汚染物質の同時精製を最小化するように最適化されています。我々は日常的に有意にシグマHISセレクトニッケルアフィニティーマトリックス（15〜20 mg / mlの樹脂）の広告を出している結合容量を超える収率で非常に純粋な生成物を回収する。酸の溶出はまた、NMRのための高価な安定同位体試薬で標識する場合は特に、ニッケル行列のコストより相殺する以上のCNBrダイジェストへの移行に必要な中間ステップ、および架橋物の収量増加を排除します。
臭化シアンダイジェスト条件を発売反応速度およびタンパク質の溶解性の両方がこれらの条件の下で非常に有利であるためのCNBrでtrpLEから融合TMペプチドは、一般的に溶媒として70％ギ酸を使用して実行されます。しかし、治療時間はセリンおよびスレオニン残基16,17のホルミルエステル化を避けるために（ダイジェストで1時間未満）比較的短くしなければならないことによるとトリプトファン残基18、その観測された質量の種とし て質量分析によって検出可能である修正のI-ホルミル化予想される質量に対して28（n）をダルトンである。ここで説明するように、TFAのための私達の好みは完全にこれらの変更を回避することができます。 1％Xa因子プロテアーゼを用いtrpLE - TM融合の酵素的切断トリトンX-100は11を報告したが 、最もtrpLE-TM融合および洗剤ミセルの切断部位の到達不能の合併症の貧しい人々の溶解度は、おそらく一般的な有用性を制限されていますこのアプローチ。
peptiの逆相HPLC精製CNBrをダイジェストからデ製品は、この手順の中で最も困難なステップであり、それぞれの新しいtrpLE-TMシーケンスの最適化を必要とする可能性が高い。次の観察は、多くの異なるシーケンスを処理したから来て、最もtrpLE-TMの融合にも当てはまる可能性がある：
濃酸に重い暴露下でパワーと安定性を解決、選択性の面で優れた固定相であることが、 固定相の選択我々は、Agilent ZORBAX安定ボンドC3カラム（5μmの粒径300Åの細孔径）を見つける。セミ分取（9.4 mm径）および分取スケール（21.2ミリメートル径）のサイズが利用可能であり、我々の手で非常によく行われています。 C4、ジフェニルシアノ及び固定相はまた、C3に比べて似たような疎水性の範囲で有用な代替ペプチドの選択性を提供することがあります。
きちんとした中の凍結乾燥したCNBrダイジェスト生成物のHPLC。解散のダイジェスト製品の準備マイク酸はHPLC分離のための最良の結果を提供します。 TFAまたはアセトニトリル、トリフルオロエタノール及びジメチルホルムアミド溶解度が低いことが多い結果として、有機溶媒中での準備は、列結合および/または複数種を含む広いピークの製品の溶出を減少させた。上述のように長時間の暴露により、ペプチド側鎖16から18のホルミル変更をもたらす可能性があるため注意がカラムローディングの直前にギ酸で商品を準備するために注意しなければなりません。
HPLCグラジエント溶出の最適化。我々は通常、10〜20％のアセトニトリルまたは5〜10％ギ酸に溶解し、溶媒A TrpLE-TMの融合とそのダイジェスト製品として0.1％TFAを含む水にイソプロパノールで始まることとしてC3の列をバインドしますここに示されているように限り40％アセトニトリル（ 図4）。ずっと解放trpLEフラグメントのは（trpLEフラグメントは、FTで唯一のタンパク質産物であることに注意してください 、これらの条件下で流れることができる分数： 図5、レーン1）、我々が希望する製品の列の全体的な結合能力を高めるために、この観測を利用しています。アセトニトリルとイソプロパノールは、勾配溶媒として非常に有効である、と私たちはしばしば、例えば75％イソプロパノールとして、時には奇数だが効果的なレシピは、25％アセトニトリル、0.1で、その結果、溶出プロファイルを変更するには、既存の溶剤溶液を混合することにより、私たちの最終的なグラジエント条件に到着ここに示されているDAP12TM精製用溶液Bとして使用％TFA溶液。問題があった、非常に疎水性の製品は、10％トリフルオロエタノール（TFE）とAとBの両方のTFA濃度の増加（最大0.3％）（未発表データ）までの添加でアセトニトリルまたはイソプロパノールを用いて溶出されてきた。その他は、C4固定相9とブタノール/酢酸の移動相を用いて良好な結果を報告した。
ダイジェスト生成物の分析。主要な解析手法の両方sがここに使用され、SDS-PAGEおよびMALDI-TOF MSは、trpLE-TM製品の極めて疎水性の性質によって複雑になる場合があります。時には、SDS-PAGEゲル上で高分子量の凝集体として実行CNBR / TFAダイジェスト反応やHPLC画分から分析試料を凍結乾燥した。我々は、SDS-PAGE、しばしばこの問題を救済するための準備の前にHFIPと再凍結の小さなボリュームで凍結乾燥試料のその治療法を見つける。 TMペプチド配列はまた、容易にMALDI-TOF MS分析中にイオン化しない可能性があり、したがって、非常に微弱な信号を与えることができます。我々は、TMペプチド試料を調製するための最適化された手順を使用していたエタノール中シナピン酸（SA）の飽和溶液は、第1プレート上にスポットし、マトリックスの均一な薄層を作るために乾燥されるインチアセトニトリル中のSAの飽和溶液で1:1で混合ペプチド含有HPLC画分の試料を乾燥マトリックス層の上にスポットする。 2と6倍の信号対ノイズ比較の間に私たちの手の中には、このメソッドの利回りdは、ペプチドをスポッティングする：SAの混合物を直接、清潔MALDIプレート上に。
下流のアプリケーションに最適です。溶液NMRと他の下流のアプリケーションに脂質や中性洗剤システムに、TMペプチド複合体を再構成するための方法は大きく異なり、通常は慎重にそれぞれの新しいシステムやアプリケーションに合わせて調整する必要があります。関係するパラメータの詳細については、よくこのプロトコル記事の範囲を超えてことである。溶液NMRを用いて成功したアプリケーションからの試料調製の詳細につきましては、我々は、トピック1,19、そこを参照する上でこれらの最近の口コミを読者に参照してください。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
とビクトリア州政府（MECへVESKIイノベーションフェローシップ;、この仕事のための資金は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会（独立研究機関インフラ支援スキーム[IRIISS]助成WEHIへNHMRCプロジェクト無償1011352 MECおよびMJCの）によって提供されWEHIにビクトリア州政府インフラ運用·サポート）。 MECは、オーストラリアの研究評議会のエリザベス女王二世·フェローでもある。 EFXBは、メルボルン大学のノーマヒルダシャスター奨学金プログラムからの支援を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
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