Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Published: March 6, 2013 doi: 10.3791/50141
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

Summary

Биофизические и биохимические исследования взаимодействий между мембраной вложенных областей белка сталкиваются со многими техническими проблемами, первым из которых является получение соответствующего учебного материала. В этой статье описывается протокол для получения и очистки дисульфида стабилизированного трансмембранного пептидных комплексов, которые подходят для структурного анализа по решению ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и других аналитических приложений.

Abstract

Физическое взаимодействие между липидов встроенным альфа-спиральных областей мембранные белки играют важную роль в сворачивании и монтаж комплексов мембранных белков и в динамических процессов, таких как трансмембранный (ТМ) сигнализации и регуляции клеточной поверхности белка. Понимание особенностей вождения ассоциации определенных последовательностей требует сложных биофизических и биохимических анализов комплексов ТМ пептидов. Тем не менее, крайние гидрофобность TM области делает их очень трудно манипулировать, используя стандартные методики химии пептидов, и производство из подходящего материала исследования часто оказывается чрезмерно сложной. Определение условий, при которых пептиды могут принять стабильный винтовой конформации и образуют комплексы спонтанно добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы приводим процедуру для получения гомо-или гетеро-димерных TM пептидные комплексы из материалов, которые выражаются в E. седлоЯ, таким образом позволяя включения стабильных изотопов этикетки для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или не природные аминокислоты для других приложений относительно недорого. Основным новшеством в этом методе является то, что ТМ комплексы производят и очищают, как ковалентно связаны (дисульфид-сшитого) сборки, которые могут образовывать стабильные, стехиометрические и однородной структуры при восстановлении в моющие средства, липидов или других мембран-миметического материалов. Мы также представляем тщательно оптимизированы процедуры для экспрессии и очистки, что в равной степени применимы ли производство единичных доменов TM или сшитые комплексы и предоставлять рекомендации для адаптации этих методов к новым последовательностям TM.

Introduction

Этот протокол подробности процедуры мы разработали для получения дисульфида стабилизировалась комплексов трансмембранных (ТМ) пептиды для структурных исследований с использованием решения ЯМР. Процедура использует надежные выражения предоставляемой ΔtrpLE1413 слияние системы (см. ниже) и позволяет TM пептидных комплексов определенного состава, которые будут созданы с использованием сложных стабильных изотопных методов маркировки для современного многомерного ЯМР экспериментов. Мы использовали эти методы, чтобы определить несколько структур ЯМР, который показал новую важную информацию о том, как лимфоцит-активирующих immunoreceptors собираются из нескольких субъединиц мембранного белка через взаимодействие среди своих TM области (недавно рассмотрели в 1). Эти методы применимы ко многим другим мембранным белком систем, а также широкий спектр вниз по течению аналитических методов в дополнение к решению ЯМР. Хотя пример, приведенный здесь используется родной остатков цистеинасоздать комплекс, который имитирует естественно дисульфидными связями белка, дизайн одинаково хорошо подходит для создания инженерных дисульфидные связи для стабилизации комплексов, которые обычно удерживаются вместе слабыми, нековалентных взаимодействий, таких как гомо-и гетеро-TM димерных комплексов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR)-белков семейства 2-4 или гетеродимерные αβ интегрина комплексы 5,6.

Чрезвычайно гидрофобных пептидных последовательностей, таких как полученные из липидного бислоя, охватывающий часть белков TM чрезвычайно трудных предметов для биохимических и биофизических исследований. Кроме того, что очень сложно манипулировать с использованием стандартных белков и методы химии пептидов, они часто весьма токсичны для клеток и, следовательно, трудно производить рекомбинантно. Мы 7,8 и др. 9-11 имели значительный успех выражения таких сложных пептидных последовательностей у бактерий, как в рамке карбоксиконцевойслияния с модифицированной версией ΔtrpLE1413 последовательность, полученную из E. оперона кишечной ГТО 12. ~ 13 кДа trpLE полипептида, кодируемого этой последовательности могут быть произведены на высоком уровне под промотором Т7 и полностью локализованы тельца включения, где проблемы, связанные с токсичностью и / или нестабильности обойти. Модификация последовательности путем добавления аминоконцевой 9-гистидин тегов 13 и устранения внутренних метионина и цистеина из trpLE последовательности позволило trpLE 14-пептид слияния должна быть очищена от иона металла аффинной хроматографии и переваривается использованием цианогенбромидом (CNBr ), чтобы освободить желаемого пептидной последовательности. Мы успешно использовали эту систему, чтобы выразить более десятка различных последовательностей, как trpLE слияния представляют мембранные белки, которые содержат фрагменты целых четыре TM областях (7,8 и неопубликованные результаты, см. также раздел обсуждения).

Основным новшеством в этом протоколе является определение условий, при которых неструктурированные и очень плохо растворимы trpLE-TM слияния может быть эффективно дисульфида сшитые в контексте рационализации процессов. Некоторые аспекты высокодоходные выражения, обработки и очистки пептидов продукты также были тщательно оптимизированы, и рекомендации, представленные здесь, являются одинаково актуальными для производства не-дисульфид-сшитого (мономерные) продукции ТМ пептидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клонирование и построить Design

Клонирование последовательности интерес в ПММ-пептида вектор (которая может быть предоставлена ​​по запросу) с помощью HindIII и BamHI сайты рестрикции (см. Рисунок 1). Двухцепочечной ДНК-вставки должны включать, в следующем порядке: сайт HindIII; одного кодона метионина для расщепления CNBr; E. палочки кодон-оптимизированный пептида кодирующей последовательности; стоп-кодона; сайт BamHI. Все остальные methionines в пептидной должны быть устранены и дипептид последовательность Asp-Pro следует избегать, поскольку она также будет расщепляться в кислых условиях.

Уникальный остаток цистеина должно быть введено в каждой пептидной последовательности, в зависимости от желаемого расположения дисульфидных сшивания в конечном комплексе, и все другие цистеина должно быть мутировал в серина. Плазмида несет кассету канамицину для выбора.

2. Выражение trpLE-peptiде-Fusion

  1. Макияж и стерильный фильтр M9/Kan минимальной среде роста (0,1 мм CaCl 2, 2 мМ MgSO 4, 3 г / л KH 2 PO 4, 7,5 г / л Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 г / л NaCl, 1 г / л NH 4 Cl, 4 г / л глюкозы, 50 мг / л канамицина сульфат). Дополнение с Centrum Полный чтобы обеспечить цинка витаминов и микроэлементов: растворить 1 таблетку в 40 мл H 2 O при перемешивании в течение 30 мин, центрифугу для удаления нерастворимого материала и стерильного фильтра оранжевый супернатант. Хранить раствор при 4 ° С в темноте в течение 2 недель и использовать 4 мл / л в M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 15 N-обогащенных NH 4 Cl, 13 C-обогащенные глюкозой или других стабильных изотопов-меченых предшественников могут быть включены в среде М9 на данном этапе, если это необходимо.
  2. Инокуляции 100 мл закваски из свежего превращается BL21 (DE3) штамма E. палочки в среде M9/Kan. Расти в течение ночи при 37 ° C при встряхивании при 200 оборотов в минуту.
  3. На следующее утро, проверьте OD 600 из закваски - это должно быть в диапазоне от 2 или больше. Развести 100 мл закваски на 1 л общего объема Centrum-дополнена средой M9. Разделить на две 2 л сбит с толку колбы (500 мл культуры в каждой колбе) и растут при температуре 37 ° C встряхивании при 140 оборотов в минуту до OD 600 достигает 0,6.
  4. Установите температуру шейкере до 18 ° C и продолжают встряхивании в течение 1 часа, позволяя культурам полностью остыть, прежде чем индукция.
  5. Возьмите предварительно индукции образца для SDS-PAGE анализа (эквивалент 50 мкл от культуры в OD 600 = 1), а затем добавить IPTG до 0,1 мм конечная концентрация для индукции экспрессии trpLE-пептид слияния. Продолжать расти при температуре 18 ° C/140 оборотов в минуту в течение ночи (16-20 ч) под IPTG индукции.

3. Включение подготовка тела и связывания никеля матрицы

  1. Окончательный OD 600 овернайт культур выражение в минимальной среде является переменной и шоULD быть между 2,5 и 5,0. Возьмите образец для SDS-PAGE анализа (эквивалент 50 мкл от культуры в OD 600 = 1) и сбора клеток путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г.
  2. Ресуспендируют осадок клеток из 1 л культуры в 50 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 20 мМ β-ME, 0,2 М NaCl). Клеточные суспензии можно хранить в замороженном для последующей обработки.
  3. Lyse клетки ультразвуком на льду на максимальной мощности в течение 1 мин и отдыха на льду в течение 5 мин. Мы используем Sonicator Misonix 3000 (максимальная мощность 600 Вт) с ½-дюймовой высокой интенсивности сменным наконечником. Повторите ультразвуком / охлаждения в течение трех циклов.
  4. Сбор нерастворимые включения тела (IB) материала центрифугированием в течение 15 мин при 20000 х г и отбросить супернатант. Рыхлый, тонкий слой более светлого остатков клеток могут быть видны в верхней части плотных гранул IB, это могут быть смыты водой или буфером с нежным агитации. Шаги 3.3 и 3.4 может быть повторен для улучшения чистоты фракции IB, если Дезикрасный цвет. Образцы осадок и надосадочную жидкость материала должны быть приняты для SDS-PAGE анализа для подтверждения trpLE-TM слияния локализации телец включения.
  5. Растворите IB гранул в гуанидина решение (6 M гуанидин HCl, 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 5 мМ β-ME), используя 25-50 мл на литр культуры обработаны. Этот шаг потребует нескольких часов при перемешивании и иногда мягкий ультразвуком.
  6. Снимите IB лизата центрифугированием в течение 1 часа при 75,000-100,000 XG и 20 ° C. Слейте супернатант и фильтр через 0,2 мкм мембрану.
  7. Комбинат очищенных лизатов IB, в 50 мл коническую трубку или большего судна, которые могут быть закрыты надежно, с никель смоле, которая была промывают водой и доведены до решения гуанидина. Используйте 3-4 мл поселился смолы на литр культуры обработаны для слияний, которые выражают в такой же степени, как trpLE-DAP12TM показано здесь (рис. 3, дорожка 2). Пакетное связывание путем инкубирования в течение ночи при комнатной т emperature при осторожном перемешивании.

4. В колонке окислительного сшивания

  1. Загрузите IB лизат / никель смолы подвеской в ​​пустую колонку самотеком с пористой подложки кровати, добавив, непрерывно, пока весь объем протекающей через. Сбор и отложить в сторону расходе, которые могут по-прежнему содержат белок несвязанного слияния.
  2. Вымойте никеля смолы самотеком с 5 объемами слоя раствора мочевины (8 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl), содержащем 5 мМ β-ME.
  3. Вымойте никеля смола снова с 5 объемами слоя раствора мочевины без β-ME.
  4. Вымойте никеля смолы в третий раз, с 5 объемами слоя раствора мочевины, которая была дополнена 20 мкМ CuSO 4 и 2 мМ окисленного глутатиона. После этого мыть, закройте выход колонки и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, чтобы максимальное образование дисульфидных связей.

5. TFA элюирования и количественного

Содержание "> ВНИМАНИЕ: трифторуксусной кислоты (ТФК) вызывает сильные ожоги при контакте с кожей и паров очень раздражает Концентрированный TFA должны использоваться только в утвержденной химический вытяжной шкаф с защитой для глаз и не латексные перчатки Проверьте химическую совместимость всех.. Материалы, используемые; полипропилена является совместимым со всеми этапами этого протокола.

  1. Промыть окислительного раствора мочевины с 10 объемами слоя водой и высушить колонке кровати, применяя вакуумную линию на выходе из колонки.
  2. Закройте выход колонки и добавить 1,5 объема слоя чистого (99-100%) TFA. Размешайте смолу никеля с небольшой шпатель для равномерного воздействия кислот и инкубировать в течение 5 мин. Откройте выходе из колонки и собирать кислоты элюата, мягко давления с помощью шприца или сжатого воздуха, если это необходимо, чтобы вытеснить все жидкости.
  3. Повторите шаг кислоты элюирования еще 1,5 объемами слоя аккуратным TFA. Работают быстро на этом этапе, чтобы избежать полного растворения beadeг агарозы матрицы. Выход белка может быть определена в этой точке в соответствии с Beer-Lambert уравнения и теоретические молярный коэффициент вымирания trpLE-пептидной последовательности. Развести образца элюата TFA (1:20 до 1:50) в трифторэтанол (ТФЭ) и измеряют поглощение при 280 нм, используя TFA / ТФЭ в то же разведение, как пустой.

6. CNBr пищеварения

ВНИМАНИЕ: цианогенбромидом (CNBr) является чрезвычайно токсичным и должны быть обработаны только в утвержденных химический вытяжной шкаф. СИЗ, включая защитные очки, халат и не латексные перчатки совершенно необходимы. CNBr является реагирует на влагу и должны быть доведены до комнатной температуры перед открытием. Обратитесь к институциональным офис безопасность инструкции по нейтрализации / утилизацию CNBr-загрязненных растворов и материалов.

  1. Развести кислоты элюата до 80% конечной концентрации TFA по каплям добавляли воду при перемешивании осторожно. Если образуется осадок,дд назад небольшого объема (0,5 к 1 мл) чистого TFA, пока раствор не разъясняет, а затем вновь правильной до 80% воды. Возьмите 5 мкл предварительно дайджест образцов для SDS-PAGE анализа, замораживание в жидком азоте и лиофилизации образца немедленно.
  2. Добавить CNBr кристаллов примерно 0,2 г / мл, заботясь, чтобы взвесить все токсичные химические безопасности в закрытых, предварительно взвешенные трубы или с использованием баланса внутри химический вытяжной шкаф. Аккуратно перемешайте до полного растворения. Промойте и запечатать реактор в атмосфере инертного газа (азота или аргона поток) и инкубировать 3-4 часа при комнатной температуре, в защищенном от света.
  3. Возьмите 5 мкл сообщение-дайджест образцов для SDS-PAGE анализа и заморозить и lyophilize немедленно. Передача реакции дайджеста регенерированной целлюлозы кассеты диализа или трубки (ацетат целлюлозы растворяется в концентрированной кислоты) с молекулярной среза весом 3,5 кДа или меньше, в зависимости от размера ожидаемой комплекс пептидов. Диализировать ночи до 4 л воды вхимический вытяжной шкаф для снижения концентрации TFA и разлагаются непрореагировавшего CNBr. Оставьте место в кассете диализа или трубы для значительного увеличения объема (насколько это в два-три раза) в течение ночи диализа.
  4. Снимите диализованной решение реакцию со взвешенными осадок из кассеты диализа или трубки (большая часть белка будет выпадать в осадок, когда концентрация TFA уменьшается) и передать подвески до 50 мл конические пробирки. Замораживание и lyophilize, чтобы удалить воду и следы CNBr / TFA. Этот шаг, вероятно, потребуется несколько дней.
    ВНИМАНИЕ: Оба диализованной реакции дайджест и диализ воды должны по-прежнему рассматриваться как токсичные и обрабатываются / утилизировать вместе с соответствующими мерами предосторожности.
  5. Образцы культур из предварительно индукции и урожай этапа, включение тела супернатант и осадок, TFA элюата и CNBr-переваривается материал может быть проанализированы SDS-PAGE. Подготовка образцов при нагревании до 95 ° C в Invitrogen NuPAGE LDS SAMPLэлектронной буфера. TFA элюата и дайджест образцы должны быть подготовлены как в сокращении и невосстанавливающих условия для облегчения идентификации продукта и оценки окислительного сшивания.
  6. Отделить образцы на 12% NuPAGE бис-трис сборных акриламида гель использованием MES-SDS работает буфера для оптимального разрешения самых маленьких продукты дайджест.

7. Обращенно-фазовой ВЭЖХ очистки дисульфид-сшитого пептидные комплексы

  1. Растворить до 100 мг лиофилизированных продуктов дайджеста в 2-3 мл аккуратно муравьиной кислоты и нагрузка на препаративных масштабах (21,2 х 150 мм) Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT колонки в растворителе (как правило, 10-20% ацетонитрил или 5 -10% изопропанола в воде с 0,1% TFA).
  2. Элюируйте дайджест продуктов в градиент растворителя В (ацетонитрил или изопропанол с 0,1% TFA) в течение не менее 5 объемов колонки. См. обсуждение на предложения по выбору оптимальных условиях градиента для различных пептидных последовательностей.
  3. Принимать50-100 мкл образцов от каждой фракции ВЭЖХ для SDS-PAGE анализа и заморозить и lyophilize немедленно. Удаление растворителей HPLC является быстрым и должна быть завершена в течение 1-2 часов.
  4. Подготовка лиофилизированный HPLC образцов для SDS-PAGE при нагревании до 95 ° C в Invitrogen NuPAGE буфера для образцов LDS, не восстановитель. Охладить и разделить каждый образец равномерно на 2 трубы микроцентрифужных, добавив, 100 мМ DTT к одному из них и повторного нагрева кратко.
  5. Отделить пониженной и неприведенного ВЭЖХ проб на 12% NuPAGE бис-трис сборных акриламида гель с MES-SDS работает буфера, как указано выше. Маленький, гидрофобные пептиды часто не занимают Кумасси хорошо окрашиваются и не может работать на их ожидаемой молекулярной массой. Тем не менее, сравнение пониженной и не восстановленных образцов должна способствовать идентификации сшитых пептидов продукции и оценка чистоты.
  6. Анализ кандидата пептид-содержащих фракций матрица-активированная лазерная десорбция ионизация время пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (см. обсуждение) для идентификации видов, представляющих интерес и подтвердить свою ожидаемую массу.
  7. Комбинат, замораживания и lyophilize ВЭЖХ фракции, содержащие чистые, сшитые TM пептидный комплекс и взять сухой вес конечного продукта, чтобы определить доходность. Фракции с высоким содержанием изопропанол не могут оставаться замороженными. Если пептидных фракций высохнуть до фильма, а не пушистым лиофилизированный продукт, повторно распустить фильм полностью в небольшом объеме чистой гексафторизопропанол (HFIP), заморозить и lyophilize снова. HFIP обработанного продукта должна быть небольшой, белый конус, который легко опрокидывается, и взвешивают.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Уровень экспрессии достигается при trpLE слияния является переменной и сильно зависит от аминокислотной последовательности пептида прилагается. Рисунке 3 показан SDS-PAGE анализа предварительной индукции (полоса 1) и время-урожая (дорожка 2) образцы культуры, которые дали примерно 120 мг чистой, нетронутой trpLE-DAP12TM слияние с 1 литра культуры и 4 мл никеля матрицы. Все trpLE-DAP12TM слияния был локализован к включению тела гранул (полоса 4), в отличие от супернатанта (дорожка 3).

Около 70% никеля очищают trpLE-DAP12TM слияние было дисульфид-сшитый в форме димера (рис. 3, полосы 5 и 6: неприведенного и снижение образцы элюата TFA). Это типичный результат для trpLE-DAP12TM слияния, но эффективность сшивания будет меняться с размещением инженерных цистеина. Продукты DAP12TM пептид не легко идентифицировать в общей CNBr Образцы дайджест (дорожки 7 и 8),но сравнение нетронутыми слияния и trpLE полосы фрагмент в сокращенной пробы дайджест (полоса 8) указывает, что усвоение слияние было ~ 60% полной.

На рисунке 4 показано разделение продуктов дайджест обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием препаративных масштабах C3 столбца (общее связывание мощность ~ 200 мг белка). Поскольку содержание ароматических слияния низкая мы обычно следить за поглощение при 214 нм, а не 280 нм. Для этого пробега 90 мг окисленного, CNBr-переваривается trpLE-DAP12TM сплав растворяют в 3 мл аккуратно муравьиной кислоты и наносили на колонку в 100% растворителя (60% H 2 O, 40% ацетонитрила, 0,1% TFA). Связанные продукты элюировали в два этапа градиентом 0-60% следуют 60-90% растворителя B (75% изопропанола, 25% ацетонитрила, 0,1% TFA) при скорости потока 10 мл / мин. Основные продукты, содержащиеся в каждой фракции в соответствии с SDS-PAGE анализа (рис. 5), указанные выше хроматограммы с использованием кодов Ассиgned на рисунке 2. См. Оптимизация градиент элюирования ВЭЖХ в обсуждении раздела для более подробной информации по оптимизации градиента условий для различных пептидных последовательностей.

Пептиды продукты легко идентифицировать в SDS-PAGE (рис. 5) и MALDI-TOF (рис. 6) анализ основных фракций ВЭЖХ. DAP12TM пептидов и, по нашему опыту, многие другие гидрофобные ТМ пептидов, со значительно уменьшить уровень миграции по сравнению с их ожидаемой молекулярной массы (3366 Dalton мономера и димера 6730 Дальтон для 15 N-меченных видов показано здесь). Такое поведение напрямую связано с количеством пептида загружены на геле и результатам в континууме молекулярными весами, как количество загружен изменяется (данные не показаны). Тем не менее, изменение электрофоретической подвижности пик 5 на снижение с 100 мМ DTT (сравните дорожки 7 и 8) идентифицирует это как сшитых пептидовпродукта. MALDI-TOF MS анализ подтверждает личность димерного пептида с основной пик на 6729,2 Дальтон и раскрывает никаких других основных продуктов (рис. 6). Окончательный выход чистого дисульфида сшитого DAP12TM пептида гомодимером от этого препарата составляла 7,5 мг на литр культуры.

Рисунок 1
Рисунок 1. Последовательность ДНК trpLE-DAP12TM области кодирования с его переводом аминокислот кислоты. Основные регионы полипептидной последовательности выделены и цветовую кодировку с этикетками с правой стороны. Уникальный внутренний метионин (Met) и цистеина (Cys) остатков для цианогенбромидом (CNBr) и окислительного расщепления сшивания выделены голубым и фиолетовым, соответственно. HindIII и BamHI сайты рестрикции (жирным шрифтом и подчеркиванием) являются уникальными в плазмиды и маУ быть использован для замены TM пептидной последовательности с другой последовательностью интерес.

Рисунок 2
Рисунок 2. Принципиальная схема процедуры. Важные шаги в протоколе указаны в текстовых меток. Ключевые сегменты trpLE-DAP12TM слияния имеют цветовую кодировку, как на рисунке 1. Основные полипептидные продукты от сшивания и дайджест шаги помечены AF и здесь перечислены с их описанием и ожидаемой молекулярной массы (15 N-меченных): [A] фрагмент trpLE: 13769 дальтон; [B] нетронутыми trpLE-DAP12TM Fusion: 17118 Дальтон , [C] нетронутыми trpLE-DAP12TM слияния димер: 34233 дальтон; [D] одного скола trpLE-DAP12TM слияния димер: 20482 дальтон; [E] мономерных DAP12TM пептид: 3366 дальтон; [F] димерных DAP12TM пептид: 6730 Дальтон. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3
Рисунок 3. SDS-PAGE анализа trpLE-DAP12TM выражения, очистка, сшивание и дайджест шагов Культура образцов (полоса 1, предварительно индукции, шаг 2,5; переулок, 2, урожай, шаг 3,1)., И включение тела подготовки образцов (переулок 3, супернатант; переулок 4, гранулы, шаг 3,4) были снижены с 100 мМ DTT. TFA элюата из колонки никеля (линии 5 и 6; шаг 6,1) и после CNBr образца (дорожки 7 и 8; шаг 6,3) проводились неприведенного (NR) и уменьшается с 100 мМ DTT (R), как указано для подтверждения дисульфида сшитые продукты. * Мономерных и димерных пептидов продуктовс E и F, плохо визуализируется окрашивания Кумасси и поэтому не обнаруживаются на этом геле.

Рисунок 4
Рисунок 4. Обращенно-фазовой ВЭЖХ очистки DAP12TM дисульфид-сшитого димера. Окисляется, CNBr-перевариваются и лиофилизировали trpLE-DAP12TM продуктов Fusion (90 мг) растворяют в 3 мл муравьиной кислоты (100%) и наносили на Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT (21,2 х 150 мм) колонке в растворителе (60% H 2 O, 40% ацетонитрила, 0,1% TFA). Двухступенчатый градиент 0-60% следуют 60-90% растворителя B (75% изопропанола, 25% ацетонитрила, 0,1% TFA) был запущен при скорости потока 10 мл / мин для элюирования связанного продукции. Фракции, собранные в качестве проточного (FT) и четыре основных пика отмечено выше 214 нм поглощение след (AU: произвольное ООНее) и основные продукты, содержащиеся в каждой фракции указывается с использованием кодов, назначенных на рисунке 2. Желаемой DAP12TM сшитого продукта пик заштрихованы.

Рисунок 5
Рисунок 5. SDS-PAGE анализа обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии продуктов. Проточные (FT) и пик 1 образцов проводились неприведенного. 2 пик, 3 и 4 образцов проводились как неприведенного (NR) и уменьшается на лечение 100 мМ DTT (R) для проверки личности дисульфидных сшитых продуктов. Основные продукты в каждой фракции (с их коды, присвоенные в рис. 2) были [FT, Pk1]: A, trpLE фрагмента; [PK2]: B, нетронутыми trpLE-DAP12TM слияния мономера и С, нетронутыми димера синтеза; [Pk3]: D, одного скола trpLE-DAP12TM димера и E, мономерные DAP12TM пептида; [PK4]: F, дисульфид-сшитого DAP12TM димера. * Как уже говорилось (см. ПРЕДСТАВИТЕЛЬСТВО REULTS), зависимым от концентрации изменения в мобильности делает низкого МВт продуктов в Pk3 (NR и R) и PK4 (R) по всей видимости, различной молекулярной массой, хотя оба продукта являются мономерные пептид.

Рисунок 6
Рисунок 6. MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа ВЭЖХ очищенного пептида DAP12TM димера. Образца HPLC фракции 4 (1 мкл) смешивали 1:1 с насыщенным раствором sinapinic кислота (SA) матрицы в ацетонитриле и наносили на верхнюю часть тонкого слоя сухих матрицы SA из насыщенного раствора, приготовленного в этаноле. MALDI-TOF анализ показывает, продукт на ожидаемое пептида DAP12TM сшитого димера массыв 6730 Дальтон (6729,2098; 15 N-меченных), а также незначительные продукта в 3365,7105, скорее всего дважды ионизованного видов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выражение trpLE-TM слияния. По нашему опыту, trpLE-TM слияния слабо выражены в богатой питательной среде при температуре 37 ° C, и культура условиях, описанных здесь оказались успешными для различных последовательностей, содержащих от одного до четырех TM областях с выходами в пределах от 50 до 150 мг / л чистой, нетронутой синтеза. Слияния кодирования трех-или четырех-TM GPCR фрагментов (CCR5 человека TM1-TM3 и TM4-ТМ7, соответственно) или основной каталитический фрагмент человеческого пептидазы сигнального пептида (четыре TM областей; см. ссылку 15) представляют самые низкие в этой области выражение уровней, в то время как DAP12TM вариантов тесно связаны с последовательностью, используемой здесь, представляют собой самый высокий конце диапазона (неопубликованные данные). Оптимальная концентрация IPTG должны быть определены экспериментально для каждой новой последовательности. Наш стандартный 0,1 мм и более высоких концентрациях (до 1 мм) обычно приводит к значительному снижению доходности связано как с более низкими уровнями экспрессии и нижней плотности культурыт урожая (см., например, рис 1А в ссылку 7).

Вариации на представленный протокол. Протокол изложенные здесь описывается производства дисульфида сшитого TM пептидный комплекс, DAP12TM гомодимером 8. Кроме того, протокол можно легко адаптировать для получения мономерных пептидов, опустив два промывания предназначены для удаления восстановителем и окисляется связанных продуктов (4,3 и 4,4). Ранее мы уже использовали другой вариант процедуры сообщили здесь для получения ковалентно стабилизировалась TM пептидный комплекс представляет тримерных DAP12-DAP12-NKG2C TM сборки (см. ссылку 8 и методы, описанные в ней). В этом приложении 1-ТМ trpLE-DAP12 слияния и 2-TM trpLE-DAP12-NKG2C слияния были смешаны на этапе сбора урожая культуры до включения тела подготовки (шаг 3.1-3.2). Процедура включен дополнительный шаг ВЭЖХ, чтобы изолировать гетеродимерные сшитого trpLEFusion продукт от кислоты элюата (шаг 5,3) до CNBr дайджест. C3 очистки пептидов продуктов привело к восстановлению дисульфидных-сшитого DAP12TM димер, в котором одна прядь проводится NKG2C области ТМ, как в рамке C-терминала синтеза. В состав решения ЯМР этого комплекса в моющих мицеллы подтвердил, что домен NKG2C TM сборе с DAP12 в своей родной, анти-параллельная ориентация 8. Дополнительные шаги в этом варианте значительно снижается выход конечного продукта: типичная подготовка дала 8-10 мг пептида "тример" от 4L одной Fusion в сочетании с избытком второй. Этот вариант представляет собой хорошую отправную протокол для исследователей, желающих производить дисульфида стабилизированного комплексов, содержащих две различные последовательности TM.

Примечания о никель-аффинной очистки. Элюции белков из высушенных колонке никеля использованием концентрированных кислот необычной процедурой и не поддаются повторнойИспользования никеля матрицы. Попытки элюирования чрезвычайно гидрофобным trpLE-TM слияния использованием имидазола или ЭДТА в результате неполного восстановления белков и сшитых видов преимущественно удерживаются на колонке (неопубликованные результаты). Рекомендуемое количество матриц никеля и ночной пакетной обязывающий протокол был тщательно оптимизирован для насыщения матрицы с trpLE-TM белка и тем самым свести к минимуму совместной очистки от загрязнений. Мы регулярно восстанавливать очень чистые продукты с выходами, что существенно превышает рекламируемого связывающей способности Sigma HIS-Select никель Affinity Матрица (15-20 мг / мл смолы). Кислоты элюирования также исключает промежуточные шаги, необходимые для перехода в CNBr переварить, и увеличить выход сшитых продуктов более чем компенсирует затраты на никелевой матрицы, особенно при маркировке с дорогой стабильным изотопом реактивы для ЯМР.

Цианогенбромидом дайджест условиях. Релизплавленого ТМ пептидов из trpLE в CNBr обычно проводится с использованием 70%-ной муравьиной кислоты в качестве растворителя, так как и скорость реакции и растворимость белка, являются более привлекательными в этих условиях. Тем не менее, время лечения должна быть сравнительно коротким (менее 1 ч для сборника), чтобы избежать формил этерификации серина и треонина 16,17 и, возможно, I-формилировании остатки триптофана, 18, ​​модификации, которые можно обнаружить методом масс-спектрометрии, как вид, наблюдаемая масса это +28 (п) Дальтон по сравнению с ожидаемой массы. Наше предпочтение TFA, как описано здесь избегает этих изменений в целом. Ферментативное расщепление trpLE-TM слияния использованием фактора Ха протеазы в 1% Triton X-100 было сообщено 11, но плохой растворимости наиболее trpLE-TM слияний и усложнение сайт расщепления недоступности в моющих мицеллы, вероятно, ограничит общий полезности этот подход.

Обращенно-фазовой ВЭЖХ очистки peptiде изделий из CNBr дайджест является самым сложным шагом в этой процедуре и, вероятно, потребует оптимизации для каждой новой trpLE-TM последовательности. Следующие наблюдения исходить от обработки множества различных последовательностей и, вероятно, справедливо для большинства trpLE-TM слияния:

Выбор неподвижной фазы мы находим Agilent ZORBAX Stable-Бонд C3 столбцов (300 размер пор; 5 мкм размер частиц)., Чтобы быть превосходным стационарной фазы с точки зрения селективности, разрешающая способность и стабильность при высоких воздействия концентрированных кислот. Semi-препаративной (9,4 мм в диаметре) и препаративных масштабах (21,2 мм в диаметре) размеров доступны и провели очень хорошо в наших руках. C4, дифенил и цианопропил стационарной фазы, могут также предоставлять полезную альтернативу селективности пептида в аналогичном диапазоне гидрофобностью по сравнению с C3.

Подготовка сборника продуктов для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Расторжение лиофилизированного CNBr продуктов дайджеста в аккуратных длямикрофон кислота обеспечивает лучшие результаты для разделения ВЭЖХ. Подготовка в TFA или органические растворители, такие как ацетонитрил, диметилформамид трифторэтанол и часто приводит к низкой растворимости, снижение колонке обязательных и / или элюирования продуктов в широких пика, содержащих несколько видов. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы подготовить продукты в муравьиную кислоту непосредственно перед загрузкой колонку, потому что длительное воздействие может привести к формил модификации боковые цепи пептида 16-18, как описано выше.

Оптимизация элюирования ВЭЖХ градиент. Обычно мы начинаем с 10-20% ацетонитрил или 5-10% изопропанола в воде с 0,1% TFA в качестве растворителя А. TrpLE-TM слияний и их переварить продукты, растворенные в муравьиной кислоты связываются C3 колонку в качестве до 40% ацетонитрила, как показано на рисунке (рис. 4). Многие из освобожденных фрагмент trpLE может протекать через в этих условиях (Обратите внимание, что trpLE фрагмент является единственным продуктом белка в FTфракции: Рисунок 5, дорожка 1), и мы воспользовались этим наблюдением, чтобы увеличить общую связывающей способности колонки для желаемых продуктов. Ацетонитрила и изопропанола очень эффективны, как градиент растворителей, и мы часто приходим к нашей конечной условиях градиента путем смешивания уже существующих решений растворителя изменить профили элюирования, в результате чего иногда странным, но эффективные рецепты, такие как изопропанол 75%, 25% ацетонитрила, 0,1 Решение% TFA использоваться в качестве решения B для очистки DAP12TM показано здесь. Чрезвычайно гидрофобные продукты, которые являются проблематичными были элюировали с использованием ацетонитрила или изопропанола с добавлением до 10% трифторэтанол (ТФЭ) и повышение концентрации TFA (до 0,3%) и в А и В (неопубликованные результаты). Другие сообщают хорошие результаты, используя бутанол / уксусная кислота мобильной фазы с C4 стационарной фазы 9.

Анализ продуктов дайджест. Оба главных техники анализаы, используемые здесь, SDS-PAGE и MALDI-TOF MS, может быть осложнен чрезвычайно гидрофобным характером trpLE-TM продуктов. Лиофилизированный аналитические образцы из CNBr / TFA реакции дайджеста и ВЭЖХ фракции иногда работать как с высоким молекулярным весом агрегатов на SDS-PAGE гелей. Мы считаем, что лечение лиофилизированных образцов с малым объемом HFIP и повторного лиофилизации перед подготовкой к SDS-PAGE часто решает эту проблему. TM пептидных последовательностей, также не может легко ионизируют при MALDI-TOF MS анализа, и поэтому может давать очень слабые сигналы. Мы использовали оптимизированные процедуры подготовки образцов ТМ пептидов, в которых насыщенный раствор sinapinic кислота (SA) в этаноле впервые появился на тарелку и высушивают, чтобы равномерно тонким слоем матрицы. Образец пептидсодержащие ВЭЖХ фракции смешивают 1:1 с насыщенным раствором SA в ацетонитриле затем наносили на верхнюю часть высушенного слоя матрицы. В наших руках, этот метод дает от двух до шести раз больше, отношение сигнал-шум сравнимд до кровянистые выделения пептида: SA смесь непосредственно на чистую тарелку MALDI.

Переработка приложений. Методы для восстановления TM пептидных комплексов в липидные или моющего средства систем для ЯМР-решения и других нефтеперерабатывающих приложения различаются, и как правило, должны быть тщательно адаптированы для каждой новой системы и приложений. Подробное обсуждение параметров, входящих поэтому далеко выходит за рамки этого протокола статье. Подробности подготовки образцов из успешных приложений с помощью ЯМР решение, мы отсылаем читателя к этим последние отзывы на тему 1,19 и ссылки в них.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Финансирование этой работы осуществляется национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (NHMRC проекта грант в 1011352 MEC и MJC, независимыми исследовательскими институтами инфраструктуры поддержки схеме [IRIISS] грант WEHI) и правительство штата Виктория (ВЕСКИ инноваций стипендий для MEC; Викторианская государственного управления операционной инфраструктуры поддержки WEHI). MEC является королева Елизавета II членом Австралийского исследовательского совета. EFXB признает поддержку со стороны Norma Хильда Шустер стипендиальной программы в Университете Мельбурна.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanogen bromide ALDRICH P.No- C91492,CAS-506-68-3 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol SIGMA-ALDRICH P.No M7154, CAS Number 60-24-2 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SIGMA-ALDRICH Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid Merck KGaA K41186564 Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea UNIVAR, AJAX FINECHEM Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE Amresco P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100 SIGMA Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel SIGMA-ALDRICH Catalog Num- P6611 IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized SIGMA-ALDRICH Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator QSONICA S-3000 (discontinued) Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 Bio-Rad Laboratories Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size Agilent Product No: 895150-909 Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels Life Technologies NP0341BOX Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO Thermo Scientific Product No: 87724 Sample dialysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

Tags

Биохимия выпуск 73 структурной биологии химии химической технологии биофизики генетики молекулярной биологии мембранные белки белки молекулярная структура трансмембранный домен химии пептидов структуру мембранных белков иммунных рецепторов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ пептиды липидов белков клонирование TFA элюирования CNBr пищеварения ЯМР выражения культура клеток
Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M.,… More

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M., Krshnan, L., Byrne, E. F. X., Call, M. J., Call, M. E. Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies. J. Vis. Exp. (73), e50141, doi:10.3791/50141 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter