Summary
Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l'analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.
Abstract
Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l'associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l'idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L'innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l'espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.
Introduction
Questo protocollo dettagli una procedura che abbiamo sviluppato per la produzione di complessi disolfuro-stabilizzate di transmembrana (TM) peptidi per studi strutturali mediante NMR soluzione. La procedura si avvale dell'espressione robusta offerta dal sistema ΔtrpLE1413 fusione (vedi sotto) e permette complessi peptide TM di composizione definita da generare utilizzando sofisticate tecniche di isotopi stabili-etichettatura per i moderni multi-dimensionali esperimenti NMR. Abbiamo utilizzato queste tecniche per determinare le strutture NMR più importanti che hanno rivelato nuove informazioni su come linfociti-attivazione immunoreceptors sono assemblati da più subunità delle proteine di membrana attraverso interazioni tra i loro domini TM (recentemente rivisto in 1). Queste tecniche sono applicabili a sistemi a membrana molte altre proteine così come una vasta gamma di metodi analitici valle oltre a NMR soluzione. Mentre l'esempio qui utilizza residui di cisteina nativiper creare un complesso che imita la naturale disolfuro-legato proteina, il design è adatto sia per la creazione di legami disolfuro ingegnerizzati per stabilizzare complessi che sono normalmente tenuti insieme da deboli, interazioni non covalenti quali omo-e etero-TM complessi dimerici di recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-familiari proteine 2-4 o eterodimeri αβ complessi integrine 5,6.
Sequenze peptidiche estremamente idrofobi come quelli derivati dal doppio strato lipidico-spanning porzioni di proteine TM sono soggetti estremamente difficile per studi biochimici e biofisici. Oltre ad essere molto difficile da manipolare utilizzando proteina standard e tecniche di chimica dei peptidi, sono spesso molto tossici per le cellule e sono quindi difficili da produrre ricombinante. Noi e gli altri 7,8 9-11 hanno avuto un significativo successo esprimere tali sequenze peptidiche difficili nei batteri come in-frame carbossi-terminalefusioni di una versione modificata della sequenza ΔtrpLE1413 derivata dalla E. coli operone trp 12. Il ~ 13 kDa polipeptide codificato da trpLE questa sequenza possono essere prodotti a livelli elevati sotto un promotore T7 ed è interamente localizzato corpi di inclusione in cui sono elusione problemi di tossicità e / o instabilità. Modifica della sequenza mediante aggiunta di un amino-terminale 9-istidina 13 e eliminazione dei residui interni metionina e cisteina dalla sequenza trpLE 14 ammessi trpLE-peptide fusioni essere purificati da ioni metallo cromatografia di affinità e digerito con bromuro di cianogeno (CNBr ) per rilasciare la sequenza peptidica desiderata. Abbiamo utilizzato con successo questo sistema per esprimere più di una dozzina di sequenze differenti come fusioni trpLE che rappresentano frammenti di proteine di membrana che contengono fino a quattro domini TM (7,8 e risultati non pubblicati, vedere anche la sezione DISCUSSIONE).
Ilinnovazione chiave in questo protocollo è l'identificazione delle condizioni in cui i non strutturati e molto poco solubile trpLE-TM fusioni possono essere efficacemente disolfuro reticolato nel contesto di un flusso di lavoro ottimizzato. Diversi aspetti di alto rendimento di espressione, la manipolazione e la purificazione dei prodotti peptidici sono stati accuratamente ottimizzati, e le raccomandazioni qui presentate sono ugualmente rilevanti per la produzione di non-disolfuro-reticolati (monomerico) TM prodotti peptidici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Clonazione e Design Construct
Clonare le sequenze di interesse nella PMM-peptide vettore (che può essere fornita su richiesta) usando i siti di restrizione HindIII e BamHI (vedi Figura 1). Il doppio filamento di DNA dovrebbe includere, nel seguente ordine: un sito HindIII, un singolo codone metionina per clivaggio CNBr, la E. coli codone ottimizzato peptide sequenza codificante, un codone di stop, un sito BamHI. Tutti gli altri metionine nel peptide dovrebbe essere eliminato e la sequenza dipeptide asp-pro dovrebbe essere evitata in quanto anche essere scisso in condizioni acide.
Un residuo di cisteina unico deve essere introdotto in ciascuna sequenza peptidica secondo il posizionamento desiderato del reticolazione disolfuro nel complesso finale, e tutte le altre cisteine dovrebbero essere mutato a serina. Il plasmide porta una cassetta di resistenza alla kanamicina per la selezione.
2. L'espressione di trpLE-Peptide Fusion
- Make up e filtro sterile mezzo di crescita M9/Kan minimo (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L di NaCl, 1 g / L NH 4 Cl, 4 g / L di glucosio, 50 mg / L di kanamicina solfato). Supplemento con Centrum completa dalla A alla zinco per fornire vitamine del gruppo B e di metalli in tracce: sciogliere 1 compressa in 40 ml di H 2 O con miscelazione per 30 minuti, centrifuga per rimuovere il materiale insolubile e filtro sterile il surnatante arancione. Conservare la soluzione di archivio a 4 ° C al buio per un massimo di 2 settimane, e utilizzare 4 ml / L in M9.
NOTA: 15 N arricchita di NH 4 Cl, 13 C-arricchito glucosio o altri precursori stabili-isotopo marcato può essere incluso nel mezzo M9 a questo punto, se desiderato. - Inoculare da 100 ml di coltura starter appena trasformato BL21 (DE3) ceppo E. coli in mezzo M9/Kan. Crescere durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
- La mattina dopo, controllare il OD 600 della cultura di avviamento - questo dovrebbe essere nel range di 2 o superiore. Diluire i 100 ml di coltura starter in 1 litri di volume totale di Centrum-integrato medio M9. Suddiviso in due 2 palloni L sconcertati (500 ml cultura in ogni flacone) e crescere a 37 ° C in agitazione a 140 rpm fino a quando il OD 600 raggiunge 0.6.
- Impostare la temperatura shaker a 18 ° C e continuare ad agitare per 1 ora, permettendo culture raffreddare completamente prima dell'induzione.
- Prendere un pre-induzione campione per analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1), quindi aggiungere IPTG a concentrazione 0,1 mM finale di indurre l'espressione del trpLE-peptide di fusione. Continuare a crescere a 18 ° C/140 rpm per una notte (16-20 ore) in induzione IPTG.
3. Inclusione di preparazione del corpo e Matrix Legatura Nickel
- La finale OD 600 di culture di espressione durante la notte in terreno minimo è variabile e should essere compreso tra 2.5 e 5.0. Prelevare un campione per l'analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1) e raccogliere le cellule per centrifugazione per 20 min a 5000 x g.
- Risospendere il pellet cellulare da 1 L cultura in 50 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Sospensioni cellulari possono essere congelati per la successiva elaborazione.
- Lisare cellule mediante sonicazione in ghiaccio alla massima potenza per 1 min e riposo su ghiaccio per 5 min. Usiamo un Sonicator Misonix 3000 (max di uscita 600 watt) con un ½ pollice punta ad alta intensità sostituibile. Ripetere sonicazione / raffreddamento per tre cicli.
- Raccogliere insolubile corpi inclusi (IB) materiale per centrifugazione per 15 minuti a 20.000 xg ed eliminare il surnatante. Un sciolto, sottile strato di colore più chiaro detriti cellulari possono essere visibili in cima alla densa IB pellet, questo può essere lavato via con acqua o tampone con agitazione. Passi 3.3 e 3.4 possono essere ripetuti per migliorare la purezza della frazione IB se desirosso. I campioni di pellet e materiale surnatante deve essere dato per analisi SDS-PAGE per confermare trpLE-TM localizzazione fusione corpi di inclusione.
- Sciogliere IB pellets in soluzione di guanidina (6 M guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml per litro di coltura trasformati. Questo passaggio richiede diverse ore con agitazione e occasionali sonicazione mite.
- Azzerare il lisato IB mediante centrifugazione per 1 ora a 75.000-100.000 xg e 20 ° C. Decantare il surnatante e filtrare attraverso una membrana 0,2 micron.
- Combinare il lisato eliminato IB, in una provetta da 50 ml o una nave più grande che può essere chiuso in modo sicuro, con resina nickel affinità che è stato lavato con acqua e soluzione equilibrata per guanidina. Utilizzare resina 3-4 ml costante per litro di coltura trattati per fusioni che esprimono in misura simile a trpLE-DAP12TM mostrato qui (Figura 3, corsia 2). Bind Batch incubando durante la notte a camera t emperatura con miscelazione delicata.
4. In colonna ossidativo reticolazione
- Caricare il lisato / nichel sospensione resina IB in una colonna vuota a gravità con il supporto letto poroso, aggiungendo continuamente fino a quando l'intero volume attraversa. Raccogliere e mettere da parte l'eluato, che può ancora contenere proteina di fusione non legato.
- Lavare la resina nichel flusso di gravità con 5 volumi di letto di soluzione di urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenente 5 mM β-ME.
- Lavare la resina nichel di nuovo con 5 volumi del letto di soluzione di urea senza β-ME.
- Lavare la resina di nichel per la terza volta con 5 il volume del letto di soluzione di urea che è stato integrato con 20 mM CuSO 4 e 2 mM glutatione ossidato. Dopo tale lavaggio, chiudere l'uscita della colonna e incubare 30 minuti a temperatura ambiente per permettere la massima formazione di legame disolfuro.
5. TFA eluizione e quantificazione
contenuto "> ATTENZIONE: l'acido trifluoroacetico (TFA) provoca gravi ustioni a contatto con la pelle ed i vapori sono altamente irritanti concentrato TFA deve essere utilizzato solo in una cappa chimica approvato fumi con protezione per gli occhi e non guanti di lattice Verificare la compatibilità chimica di tutti.. materiali utilizzati, polipropilene è compatibile con tutte le fasi di questo protocollo.- Lavare la soluzione di urea ossidante con 10 volumi del letto d'acqua e asciugare il letto colonna applicando una linea di vuoto per l'uscita della colonna.
- Chiudere l'uscita della colonna e aggiungere 1,5 il volume del letto pulito (99-100%) TFA. Mescolare la resina di nichel con una spatola per assicurare un'esposizione ad acido e incubare per 5 min. Aprire l'uscita della colonna e raccogliere l'eluato acido, pressurizzazione delicatamente con una siringa o linea dell'aria compressa se necessario spingere fuori tutto il liquido.
- Ripetere la fase di eluizione acida con un altro 1,5 il volume del letto di TFA ordinata. Lavorare velocemente in questa fase per evitare la completa dissoluzione del Beaded agarosio matrice. Resa di proteine può essere determinato a questo punto, in base al Beer-Lambert equazione e il coefficiente teorico di estinzione molare del trpLE-peptide sequenza. Diluire un campione di eluato TFA (1:20 a 1:50) in trifluoroetanolo (TFE) e misurare l'assorbanza a 280 nm, usando TFA / TFE alla stessa diluizione come bianco.
6. CNBr Digestione
ATTENZIONE: il bromuro di cianogeno (CNBr) è estremamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa chimica approvato fumi. DPI compresi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e non in lattice guanti sono assolutamente necessari. CNBr è reattivo all'umidità e deve essere portato a temperatura ambiente prima dell'apertura. Contatta l'ufficio istituzionale di sicurezza per le istruzioni sulla neutralizzazione / cessione di CNBr contaminate da soluzioni e materiali.
- Diluire l'eluato acido al 80% di concentrazione finale TFA per aggiunta goccia a goccia di acqua mescolando delicatamente. Se si forma un precipitato, undd indietro un piccolo volume (0,5 a 1 ml) di TFA ordinata finché la soluzione chiarisce, poi ri-corretta al 80% con acqua. Prendete un 5 microlitri di pre-digerire campione per analisi SDS-PAGE, il congelamento in azoto liquido e liofilizzazione il campione immediatamente.
- Aggiungi cristalli CNBr a circa 0,2 g / ml, avendo cura di pesare il prodotto chimico tossico in sicurezza in ambienti chiusi, pre-pesati tubi o utilizzando un equilibrio all'interno della cappa. Mescolare delicatamente fino a completa dissoluzione. Lavare e sigillare il recipiente di reazione sotto gas inerte (azoto o argon flusso) e incubare 3-4 ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
- Prendete un 5 microlitri post-digest campione per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. Trasferire la reazione digest di una cassetta di cellulosa rigenerata dialisi o tubo (acetato di cellulosa si scioglie in acido concentrato) con un taglio di peso molecolare di 3,5 kDa o meno, a seconda delle dimensioni del complesso peptide atteso. Dializza overnight a 4 L di acqua nellacappa per ridurre la concentrazione di TFA e decomporre ogni CNBr che non ha reagito. Lasciare spazio nel cassetto dialisi o tubi per un significativo aumento del volume (fino a due-tre volte) durante la dialisi notturna.
- Rimuovere la soluzione dializzata reazione con precipitato sospeso dalla cassetta dialisi o tubo (la maggior parte della proteina precipitare quando la concentrazione è ridotta TFA) e trasferire la sospensione per 50 ml provette coniche. Congelare e liofilizzare per rimuovere l'acqua e tracce di CNBr / TFA. Questo passaggio può richiedere alcuni giorni.
ATTENZIONE: Sia la reazione dializzato digest e l'acqua di dialisi dovrebbe continuare ad essere trattati come tossici e trattati / smaltiti con le dovute precauzioni. - I campioni di colture di pre-induzione e raccolta fasi, l'inclusione del corpo surnatante e pellet, eluato TFA e CNBr-digerito materiale può essere analizzati mediante SDS-PAGE. Preparare i campioni da riscaldamento a 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample buffer. Eluato TFA e digerire campioni devono essere preparati sia in condizioni riducenti e non riducenti per facilitare l'identificazione del prodotto e la valutazione di reticolazione ossidativa.
- Separare i campioni su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS tampone di corsa per la risoluzione ottimale dei più piccoli prodotti digest.
7. A fase inversa Purificazione HPLC di disolfuro-reticolati peptide
- Sciogliere fino a 100 mg di prodotti liofilizzati digest in 2-3 ml di acido formico pulito e carico su una scala preparativa (21.2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 colonna PrepHT nel solvente A (in genere 10-20% acetonitrile o 5 -10% di isopropanolo in acqua con 0,1% di TFA).
- Eluire i prodotti digest in un gradiente di solvente B (acetonitrile o isopropanolo con 0,1% TFA) per almeno 5 volumi di colonna. Si veda la discussione per suggerimenti sulla selezione di condizioni di gradiente ottimali per sequenze peptidiche diverse.
- Prendere50-100 campioni microlitri da ogni frazione HPLC per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. La rimozione di solventi HPLC è rapido e deve essere completa in 1-2 ore.
- Preparare campioni liofilizzati HPLC per SDS-PAGE per riscaldamento a 95 ° C in tampone campione Invitrogen NuPAGE LDS senza agente riducente. Raffreddare e dividere ogni campione equamente in 2 provette da microcentrifuga, l'aggiunta di 100 mM DTT a uno di loro e ri-riscaldamento brevemente.
- Separare i campioni ridotti e non ridotta HPLC su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS buffer di corsa come sopra. Piccoli, peptidi idrofobici spesso non occupano Coomassie macchia bene e non può funzionare a loro peso molecolare atteso. Tuttavia, il confronto di campioni ridotti e non ridotta deve facilitare l'identificazione dei prodotti peptidici reticolati e la valutazione della purezza.
- Analizzare i peptidi contenenti frazioni candidati da matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (vedi la discussione) per identificare le specie di interesse e confermare la sua massa prevista.
- Combina, congelare e liofilizzare frazioni HPLC contenenti il puro, reticolato TM complesso peptidico e prendere un peso a secco del prodotto finale per determinare i consumi. Le frazioni ad alto contenuto di isopropanolo non può rimanere congelato. Se frazioni peptidiche asciugare fino ad un film piuttosto che un prodotto liofilizzato birichino, nuovamente sciogliere completamente la pellicola in un piccolo volume di pura esafluoroisopropanolo (HFIP), congelare e liofilizzare nuovamente. Il HFIP trattato prodotto deve essere un piccolo cono bianco che può essere facilmente ribaltato e pesato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il livello di espressione ottenuto per fusioni trpLE è variabile e dipende fortemente dalla sequenza di aminoacidi del peptide allegata. Figura 3 mostra l'analisi SDS-PAGE di pre-induzione (corsia 1) e il tempo di raccolta (corsia 2) campioni provenienti da una cultura che ha prodotto circa 120 mg di pura, intatta trpLE-DAP12TM fusione da 1 litro di coltura e 4 matrice di nichel ml. Tutto il trpLE-DAP12TM fusione era localizzata all'inclusione corpo pellet (corsia 4) rispetto al supernatante (corsia 3).
Circa il 70% del nichel purificata trpLE-DAP12TM fusione era disolfuro reticolato alla forma dimerica (Figura 3, corsie 5 e 6: campioni non ridotti e ridotte di eluato TFA). Questo è un risultato tipico per la trpLE-DAP12TM fusione, ma l'efficienza di reticolazione varia con il posizionamento di cisteine ingegnerizzati. I prodotti peptidici DAP12TM non sono facilmente identificabili in totale CNBr campioni digest (corsie 7 e 8),ma il confronto della fusione intatta e bande frammento trpLE nel campione ridotto digest (corsia 8) indica che la digestione della fusione era ~ 60%.
La figura 4 mostra la separazione dei prodotti digest da HPLC in fase inversa utilizzando una colonna preparativa scala C3 (legame totale capacità ~ 200 mg di proteina). Poiché il contenuto aromatico della fusione è basso che di solito monitorare l'assorbanza a 214 nm, piuttosto che 280 nm. Per questa corsa 90 mg di ossidato, CNBr-digerito trpLE-DAP12TM fusione è stato sciolto in 3 ml di acido formico e ordinata caricato sulla colonna in 100% di solvente A (60% H 2 O, 40% acetonitrile, 0,1% di TFA). Prodotti legati sono stati eluiti in due fasi del gradiente 0-60% seguito da 60-90% di solvente B (75% di isopropanolo, 25% di acetonitrile, 0,1% TFA) ad una velocità di flusso di 10 ml / min. I principali prodotti contenuti in ogni frazione secondo analisi SDS-PAGE (Figura 5) sono indicate sul cromatogramma utilizzando l'assi codicidimensionati in Figura 2. Vedere Ottimizzazione del gradiente di eluizione HPLC nella sezione DISCUSSIONE per maggiori dettagli sull'ottimizzazione di pendenza per sequenze peptidiche diverse.
Prodotti peptidici sono facilmente identificabili in SDS-PAGE (Figura 5) e MALDI-TOF (Figura 6) analisi delle frazioni principali HPLC. Peptidi DAP12TM e, nella nostra esperienza, molti altri peptidi idrofobici TM, correre con tassi di migrazione notevolmente ridotto rispetto al loro peso molecolare atteso (3366 Dalton monomero e dimero 6730 Dalton per i 15 N-marcati specie mostrato qui). Questo comportamento è direttamente correlato alla quantità di peptide caricato sul gel e risultati in un continuum di pesi molecolari apparenti come la quantità caricata viene variata (dati non mostrati). Tuttavia, l'alterazione della mobilità elettroforetica di picco 5 dopo riduzione con DTT 100 mM (confronta corsie 7 e 8) identifica questo come il peptide reticolatoprodotto. MALDI-TOF MS analisi conferma l'identità del peptide dimerico con il picco principale a 6729,2 Daltons e non rivela altri prodotti principali (Figura 6). La resa finale di pura disolfuro reticolata DAP12TM peptide omodimero da questa preparazione era 7,5 mg per litro di coltura.
Figura 1. Sequenza del DNA del trpLE-DAP12TM regione codificante con la sua traduzione in amminoacidi. Regioni chiave della sequenza polipeptidica sono evidenziati da colori diversi e con le etichette a destra. Gli esclusivi interni metionina (Met) e cisteina (Cys) residui di bromuro di cianogeno (CNBr) scissione e reticolazione ossidativa sono evidenziati in azzurro e viola, rispettivamente. HindIII e siti di restrizione BamHI (grassetto e sottolineato) sono unici nel plasmide e may essere utilizzato per sostituire la sequenza peptidica TM con un'altra sequenza di interesse.
Figura 2. Schema della procedura. Le fasi principali del protocollo sono indicati nelle etichette di testo. Segmenti chiave del trpLE-DAP12TM fusione sono colorati come in Figura 1. I principali prodotti polipeptide dalla reticolazione e gradini digest sono etichettati AF e sono elencate qui con la loro descrizione e le attese pesi molecolari (15 N-etichetta): [A] frammento trpLE: 13.769 Dalton; [B] intatta trpLE-DAP12TM fusione: 17.118 Dalton , [C] intatta trpLE-DAP12TM fusione dimero: 34.233 Dalton; [D] single-spaccati trpLE-DAP12TM fusione dimero: 20.482 Dalton, [E] monomerico DAP12TM peptide: 3366 Dalton, [F] dimerica DAP12TM peptide: 6730 Dalton. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. SDS-PAGE analisi trpLE-DAP12TM passi l'espressione, la purificazione, di reticolazione e digerire campioni Cultura (corsia 1, pre-induzione, passo 2,5; corsia 2, raccolto, passo 3.1). Campioni e l'inclusione di preparazione del corpo (corsia 3, surnatante; corsia 4, pellet, punto 3.4) sono state ridotte con 100 mM DTT. TFA eluato dalla colonna in nichel (corsie 5 e 6; passo 6.1) e post-CNBr campione (corsie 7 e 8; passo 6.3) sono stati eseguiti non ridotta (NR) e ridotto con 100 mM DTT (R) come indicato per confermare l' disolfuro reticolato prodotti. * Prodotto peptide monomerico e dimericas E e F sono scarsamente visualizzate mediante colorazione con Coomassie e pertanto non sono rilevabili sul gel.
Figura 4. Fase inversa purificazione HPLC di DAP12TM dimero disolfuro-reticolato. Ossidato, CNBr-digerito e liofilizzata trpLE-DAP12TM prodotti di fusione (90 mg) sono stati sciolti in 3 ml di acido formico (100%) e caricato su una colonna ZORBAX Agilent SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) in colonna solvente A (60% H 2 O, 40% acetonitrile, 0,1% di TFA). A due stadi gradiente 0-60% seguito da 60-90% di solvente B (75% di isopropanolo, 25% di acetonitrile, 0,1% TFA) è stato eseguito ad una velocità di flusso di 10 ml / min per eluire prodotti rilegati. Le frazioni raccolte come flusso continuo (FT) e quattro picchi principali sono indicati sopra la traccia di assorbanza 214 nm (AU: arbitraria delle Nazioni Unitesua) ed i prodotti principali contenute in ogni frazione sono indicati con i codici assegnati in Figura 2. Il prodotto desiderato picco DAP12TM reticolato è ombreggiato.
Figura 5. SDS-PAGE analisi di fase inversa prodotti HPLC. Deflusso (FT) e picco 1 campioni sono stati analizzati non ridotta. Campioni di punta 2, 3 e 4 sono stati analizzati sia non ridotta (NR) e ridotta mediante trattamento con 100 mM DTT (R) per verificare l'identità dei prodotti reticolati disolfuro. I prodotti principali di ogni frazione (con i loro codici assegnati in figura 2) erano [FT, PK1]: A, frammento trpLE; [PK2]: B, intatta trpLE-DAP12TM fusione monomero e C, dimero fusione intatta; [Pk3]: D, single-spaccati trpLE-DAP12TM dimero ed E, monomerico DAP12TM peptide; [PK4]: F, disolfuro-dimero DAP12TM reticolato. * Come discusso (vedi reults rappresentante), una concentrazione-dipendente spostamento della mobilità rende a basso MW prodotti Pk3 (NR e R) e PK4 (R) sembrano essere differenti pesi molecolari, anche se entrambi i prodotti sono peptide monomerico.
Figura 6. MALDI-TOF analisi di spettrometria di massa HPLC-purificato DAP12TM peptide dimero. Un campione della frazione HPLC 4 (1 pl) è stato miscelato 1:1 con una soluzione satura di acido sinapinic (SA) in acetonitrile matrice e macchiato su un sottile strato della matrice essiccata SA da una soluzione satura preparata in etanolo. MALDI-TOF analisi rivela un prodotto al peptide DAP12TM atteso reticolato dimero massadi 6730 dalton (6729,2098; 15 N-etichetta), così come un prodotto minore a 3365,7105, molto probabilmente le due specie ionizzate. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Espressione di trpLE-TM fusioni. Nella nostra esperienza, trpLE-TM fusioni sono scarsamente espresse in mezzo di coltura ricca a 37 ° C, e le condizioni di coltura qui descritti sono dimostrate efficaci per molte differenti sequenze contenenti 1-4 domini TM con rese variabili 50-150 mg / L di puro, fusione intatta. Codifica Fusions tre o quattro frammenti TM GPCR (umano CCR5 TM1-TM3 e TM4-TM7, rispettivamente) o un frammento di nucleo catalitico umana peptidasi peptide di segnale (quattro domini TM; vedi rif 15) rappresentano il più basso in questa gamma di espressione livelli, mentre le varianti DAP12TM strettamente legati alla sequenza usata qui rappresentano il più alto fine del campo (dati non pubblicati). La concentrazione di IPTG ottimale deve essere determinata sperimentalmente per ogni nuova sequenza. Il nostro standard è 0,1 mM, e concentrazioni più elevate (fino a 1 mM) norma il rendimento significativamente ridotti a causa sia i livelli di espressione e densità inferiori cultura inferiore at raccolto (cfr. ad esempio in figura 1A riferimento 7).
Variazioni sul protocollo presentato. Il protocollo descritto qui descrive la produzione di un disolfuro reticolata TM peptide complesso, l'omodimero DAP12TM 8. In alternativa, il protocollo è facilmente adattato per produrre peptidi monomerici omettendo i due risciacqui progettati per rimuovere agente riducente e ossidare i prodotti associati (4.3 e 4.4). Abbiamo precedentemente utilizzata un'altra variante della procedura qui riportata per produrre un covalentemente stabilizzato TM rappresenta il complesso peptide trimerica DAP12-DAP12 NKG2C TM-assemblaggio (vedi riferimento 8 e metodi ivi descritti). In questa applicazione, un 1-TM-trpLE DAP12 fusione e un 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C fusione sono stati miscelati in fase di raccolta coltura prima della preparazione inclusione corpo (passo 3.1-3.2). La procedura ha incluso un ulteriore passaggio HPLC per isolare il eterodimerica reticolato trpLEprodotto di fusione dal eluato acido (punto 5.3) prima di CNBr digest. C3 purificazione dei prodotti peptidici comportato il recupero di un disolfuro reticolata dimero DAP12TM in cui un filamento effettuato il dominio NKG2C TM come in-frame C-terminale di fusione. La struttura NMR soluzione di questo complesso in micelle detergenti confermato che il dominio NKG2C TM assemblato con DAP12 nel suo nativo, anti-parallelo orientamento 8. Gli ulteriori passaggi in questa variazione ridotto significativamente la resa del prodotto finale: una preparazione tipica prodotto 8-10 mg di peptide "trimero" da 4L di una fusione combinata con un eccesso del secondo. Questa variazione rappresenta un protocollo di buona base di partenza per i ricercatori che intendono produrre il disolfuro-stabilizzati complessi contenenti due diverse sequenze TM.
Note sul nichel-affinità purificazione. L'eluizione di proteina dalla colonna di nichel secca utilizzando acido concentrato è una procedura inusuale e non è suscettibile di ri-Utilizzo della matrice di nickel. Tentativi per eluire il estremamente idrofobiche trpLE-TM fusioni con imidazolo o EDTA portato recupero incompleto di proteine e le specie sono stati reticolati preferenzialmente trattenuti sulla colonna (risultati non pubblicati). La quantità consigliata di matrice di nichel e il pernottamento batch-binding protocollo sono stati accuratamente ottimizzati per saturare la matrice con trpLE TM-proteina e quindi limitare la co-purificazione di contaminanti. Abbiamo regolarmente recuperare prodotti molto puri, con rendimenti che superano in modo significativo la capacità pubblicizzata legame del Sigma HIS-Select Nickel Affinity Matrix (15-20 mg / ml resina). L'eluizione acido elimina anche i passaggi intermedi necessari per la transizione nel riassunto CNBr, e la resa maggiore di prodotti reticolati più che compensa il costo della matrice di nichel, in particolare per l'etichettatura con costosi stabile-isotopi reagenti per NMR.
Cyanogen bromuro condizioni digerire. Rilascio delfusi peptidi TM da trpLE in CNBr è comunemente eseguita utilizzando 70% di acido formico come solvente perché sia la velocità di reazione e la solubilità delle proteine sono molto favorevoli in queste condizioni. Tuttavia, i tempi di trattamento devono essere mantenuti relativamente breve (meno di 1 ora per il digest) per evitare esterificazione formile di residui di serina e treonina 16,17 e, eventualmente, I-formilazione dei residui di triptofano 18, modifiche che sono rilevabili mediante spettrometria di massa come specie la cui massa osservata è 28 (n) Dalton rispetto alla massa prevista. La nostra preferenza per TFA come descritto di seguito consente di evitare queste modifiche del tutto. Clivaggio enzimatico di una trpLE-TM fusione usando fattore Xa proteasi in 1% Triton X-100 è stato riportato 11, ma la scarsa solubilità della maggior trpLE-TM fusioni e la complicazione di inaccessibilità sito di clivaggio in micelle detergenti probabilmente limitare l'utilità generale questo approccio.
Inversa-fase di purificazione HPLC di Peptiprodotti de dal digest CNBr è il passo più difficile in questa procedura ed è probabile che richiedono l'ottimizzazione per ogni nuovo trpLE-TM sequenza. Le osservazioni che seguono provengono dalla lavorazione di molte sequenze diverse e possono valere per la maggior parte dei trpLE-TM fusioni:
Selezione di fase stazionaria Troviamo Agilent ZORBAX Stable-Bond colonne C3 (300 dimensione pori Å; granulometria 5 micron). Essere una fase stazionaria superiore in termini di selettività, potere di risoluzione e stabilità sotto forte esposizione acido concentrato. Semi-preparative (9,4 mm di diametro) e preparative scala (21,2 mm di diametro), i formati sono disponibili e hanno suonato molto bene nelle nostre mani. C4, difenile e cianopropile fasi stazionarie può anche fornire utili selettività alternativa peptide in una vasta idrofobicità simile rispetto al C3.
Preparazione di prodotti digest per HPLC. Scioglimento dei prodotti liofilizzati CNBr digest in pulito permic acido fornisce i migliori risultati per la separazione HPLC. Preparato in TFA o solventi organici come acetonitrile, dimetilformammide trifluoroetanolo e spesso determina solubilità inferiore, ridotto colonna legame e / o prodotti di eluizione in picchi di massima contenenti specie multiple. Si deve prestare attenzione per preparare prodotti in acido formico immediatamente prima del carico sulla colonna per esposizione prolungata può causare modificazioni delle catene laterali formil peptide 16-18 come discusso sopra.
Ottimizzazione di eluizione HPLC gradiente. Di solito iniziano con il 10-20% acetonitrile o isopropanolo 5-10% in acqua con 0.1% TFA come solvente A. TrpLE-TM fusioni e dei loro prodotti digest disciolti in acido formico si legherà la colonna C3 come il 40% acetonitrile come qui mostrato (Figura 4). Gran parte del frammento trpLE liberato può fluire attraverso in queste condizioni (frammento trpLE noti che è il prodotto proteico solo nel FTFrazione: Figura 5, corsia 1), e abbiamo approfittato di questa osservazione per aumentare la capacità complessiva legame della colonna per i prodotti desiderati. Acetonitrile e isopropanolo sono molto efficaci come solventi gradiente, e spesso arriva alle nostre condizioni di gradiente finali miscelando soluzioni solvente pre-esistenti per modificare profili di eluizione, con conseguente ricette a volte strane, ma efficace, come il 75% di isopropanolo, 25% acetonitrile, 0,1 TFA soluzione% utilizzato come soluzione B per la purificazione DAP12TM qui mostrato. Prodotti estremamente idrofobiche che erano problematici sono stati eluiti con acetonitrile o con aggiunta di isopropanolo fino al 10% trifluoroetanolo (TFE) e concentrazioni di TFA (fino al 0,3%) in entrambi A e B (risultati non pubblicati). Altri hanno riportato buoni risultati con butanolo / acido acetico fasi mobili con una fase stazionaria C4 9.
Analisi dei prodotti digest. Entrambi la tecnica di analisi principalis qui utilizzato, SDS-PAGE e MALDI-TOF MS, può essere complicata dalla natura estremamente idrofobica di trpLE-TM prodotti. Liofilizzati campioni da analizzare da CNBr / TFA reazioni digerire e frazioni HPLC volte correre ad alto peso molecolare aggregati su gel SDS-PAGE. Abbiamo trovato che il trattamento di campioni liofilizzati con un piccolo volume di HFIP e ri-liofilizzazione prima della preparazione per SDS-PAGE spesso rimedi questo problema. TM sequenze peptidiche inoltre non può facilmente ionizzare durante MALDI-TOF MS, e possono quindi dare segnali molto deboli. Abbiamo utilizzato una procedura ottimizzata per la preparazione di campioni peptidici TM in cui una soluzione satura di acido sinapinic (SA) in etanolo viene avvistato sulla piastra ed essiccato per fare uno strato uniforme sottile di matrice. Un campione di peptide-HPLC frazione contenente miscelato 1:1 con una soluzione satura di SA in acetonitrile viene poi notato sopra dello strato di matrice essiccata. Nelle nostre mani, che si ottiene è di metodo tra due e sei volte maggiore rapporto segnale-rumore di confrontared per avvistare il peptide: miscela SA direttamente su un piatto pulito MALDI.
Applicazioni a valle. Metodi per la ricostituzione TM complessi peptide in sistemi lipidici o detergente per NMR soluzione e altre applicazioni a valle variano ampiamente e di solito devono essere attentamente su misura per ogni nuovo sistema e applicazione. Una discussione completa dei parametri coinvolti è quindi ben oltre lo scopo di questo articolo protocollo. Per i dettagli della preparazione del campione da applicazioni di successo che utilizzano NMR soluzione, rimandiamo il lettore a questi recenti sul tema 1,19 e riferimenti ivi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto NHMRC 1.011.352 di MEC e MJC, Independent Research Infrastructure Istituti Support Scheme [IRIISS] sovvenzione WEHI) e il Governo del Victoria (Veski Innovazione Fellowship per MEC; Victorian State Government Supporto Operativo Infrastrutture per WEHI). MEC è una Regina Elisabetta II del Fellow Research Council australiano. EFXB riconosce il sostegno del programma di borse di studio Norma Hilda Schuster presso l'Università di Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
