Här beskriver vi en mikrodissektion teknik följt av fluorescerande färg injektion i den akustiska ganglion tidiga kycklingembryon för selektiv spårning av auditiva axon fibrer i nerv och bakhjäman.
Den embryonala chick är en allmänt använd modell för att studera perifera och centrala projektioner gangliecell. I hörselsystemet, skulle selektiv märkning av auditiva axoner inom den VIII kranialnerven förbättra studiet av centrala auditiva kretsens utveckling. Detta tillvägagångssätt är en utmaning eftersom flera sinnesorgan i innerörat bidra till VIII nerven 1. Dessutom markörer som tillförlitligt särskiljer hörsel kontra vestibulära grupper av axoner i aviär VIII nerven har ännu inte identifierats. Hörsel och vestibulär vägar kan inte skiljas funktionellt i tidiga embryon, som sensoriska-evoked potential finns inte innan kretsarna bildas. Centralt utskjutande VIII axoner har spårats i några studier, men auditiv axon märkning åtföljdes av märkning av andra VIII nerv komponenter 2,3. Här beskriver vi en metod för anterograd spårning från den akustiska ganglion att selektivt Label auditiva axoner inom utvecklingsländerna VIII nerven. Först, efter partiell dissektion av främre cefaliska regionen av en 8-dagars kycklingembryo nedsänkt i syresatt artificiell cerebrospinalvätska, den kokleära kanalen identifieras genom anatomiska landmärken. Därefter är ett fint dras glasmikropipett positionerad att injicera en liten mängd rodamin dextran amin in i kanalen och angränsande djup region där de akustiska ganglieceller finns. Inom 30 minuter efter injektionen, är auditiva axoner spåras centralt i bakhjäman och kan senare visualiseras efter histologisk beredning. Denna metod ger ett användbart verktyg för utvecklingsstudier av perifer till centrala auditiva kretsen bildas.
Studier av tidiga utvecklingen av VIII nerven har begränsats delvis på grund av svårigheten att identifiera embryonala axoner som härrör från flera distinkt ganglierna. Flera studier har undersökt de molekylära signaler som styr hörsel och vestibulär sensorisk cell-och ganglion öden cell under tidig utveckling, 5,11,12, men de processer som reglerar centrala innervation har ännu inte fastställts. Rapporter om akustiska prognoser gangliecell beskriver vanligen perifera processer sensoriska epitel …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Candace Hsieh för förslag och hjälp med avbildningstekniker och Dr Doris Wu för expertis kyckling innerörat anatomi under tidig fosterutveckling. Detta arbete stöddes av NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 och DOE GAANN P200A120165.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |