여기 우리는 신경과 hindbrain의 청각 축삭 섬유의 추적 선택을위한 초기 여자의 태아의 청각 신경에 형광 염료를 주입 한 다음 microdissection 기술을 설명합니다.
배아 여자가 주변 및 중앙 신경 세포 투영의 연구 널리 사용되는 모델입니다. 청각 시스템에서 VIIIth 뇌신경에서 청각 axons의 선택적 라벨 중앙의 청각 회로 개발 연구를 강화합니다. 내이 (内耳)의 여러 감각 기관에 VIIIth 신경 하나에 기여하기 때문에이 방법은 도전입니다. 또한, 안정적으로 조류 VIIIth 신경 내 axons의 vestibular 그룹 비해 청각을 구분 마커 식별 할하지 못하고있다. 회로가 형성되기 전에 감각 – evoked 응답이 표시되지로 청각 및 vestibular 경로는 초기 배아에서 기능적으로 구별 할 수는 없습니다. 중앙 돌출 VIIIth 신경 axons는 일부 연구에서 추적 된 있지만, 청각 축삭 라벨은 다른 VIIIth 신경 구성 요소 2,3에서 라벨을 동반되었다. 여기, 우리는 선택적으로 labe로 음향 신경절에서 anterograde 추적하는 방법을 설명개발 VIIIth 신경에서 난 청각 axons. 첫째, 산소 인공 뇌척수에 몰두 8 일 여자는 배의 앞쪽 두부 지역의 부분 절개 한 후, 달팽이 덕트는 해부학 적 랜드 마크 식별 할 수 있습니다. 다음, 고급 당겨 유리 micropipette은 음향 신경절 세포이있는 덕트와 인접 깊은 영역으로 rhodamine dextran 아민의 작은 양을 주입하는 위치입니다. 주사 후 30 분 내에, 청각 axons은 hindbrain에 중앙 추적하고 나중에 histologic 준비에 따라 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 중앙 청각 회로 형성에 주변의 개발 연구를위한 유용한 도구를 제공합니다.
VIIIth 신경의 초기 개발 연구로 인해 여러 별개의 신경절에서 발생하는 배아 axons을 식별하는 어려움의 일부에 제한되어 있습니다. 몇몇 연구는 초기 개발 기간 동안 청각 및 vestibular 감각 세포와 신경 세포의 운명을지도 분자 신호, 5,11,12을 탐험했지만 중앙 innervation을 규제 프로세스는 결정하지 못하고있다. 이하는 주요 핵에 투영 중심 프로세스에 대해 알려진 반면, 음향 신경절 세포 계?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 초기 embryogenesis 동안 여자는 귀에 해부학 적 구조에 대한 전문 지식을위한 이미징 기술과 박사 도리스 우와 제안과 도움을 박사 캔디스 Hsieh 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 및 DOE GAANN P200A120165에 의해 지원되었다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |