Summary

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

Published: March 18, 2013
doi:

Summary

Burada sinir ve arka beyin işitsel akson liflerinin izleme seçici için erken civciv embriyo akustik ganglion içine floresan boya enjeksiyonu takiben mikrodiseksiyon tekniği tarif.

Abstract

Embriyonik civciv periferik ve santral gangliyon hücre projeksiyonlar çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Işitsel sisteminde, sekizinci kranial sinir olan işitsel akson seçici etiketleme merkezi işitme devre geliştirme çalışması artıracaktır. Iç kulakta birden duyu organları VIII.yy. sinirin 1. katkıda çünkü bu yaklaşım zordur. Ayrıca, güvenilir bir kuş VIII.yy. sinir içinde akson vestibüler gruplar karşısında işitsel ayırt işaretleyicileri tespit edilmesi henüz. Devreler oluşur önce duyu-uyarılmış yanıtlar mevcut değil gibi işitsel ve vestibüler yolları, erken embriyo işlevsel olarak ayırt edilemez. Merkezi projelendirme VIII.yy. sinir aksonlar bazı çalışmalar takip edilmiştir, ama işitsel akson etiketleme diğer VIII.yy. sinir bileşenler 2,3 dan etiketleme eşlik etti. Burada, seçici labe için akustik gangliyondan anterograd izleme için bir yöntem açıklanmaktadırGelişmekte VIII.yy. sinir içinde l işitsel aksonlar. İlk olarak, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış bir 8 günlük civciv embriyo ön sefalik bölgede kısmi diseksiyon sonrası, koklear kanal anatomik işaretlemeler ile tanımlanır. Daha sonra, bir ince çekilmiş cam mikropipet akustik ganglion hücreleri bulunan kanal ve komşu bölge içine derin rodamin dekstran amin küçük bir miktar enjekte etmek için konumlandırılmıştır. Enjeksiyonu takiben otuz dakika içinde, işitsel aksonlar arka beyin içine merkezi izlenir ve daha sonra histolojik hazırlanmasını takiben canlandırılabilir. Bu yöntem, merkezi işitsel devre oluşumu periferik gelişimsel çalışmalar için kullanışlı bir araç sağlar.

Protocol

1. Aşağıdaki Diseksiyon araçları ve Reaktifler hazırlayın Yapay serebrospinal akışkan (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM glikoz, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4) sürekli olarak% 95 O ile aşılanmış Oda sıcaklığında 2 /% 5 CO2. Infüzyon için 2/3 kapağı açılmış bir delik olan bir 500 ml geniş ağızlı Nalgene kavanoza doldurun. Tank kavanoz kapağı delikten aCSF nüfuz …

Representative Results

VIII.yy. sinir ve sinir kendisi anatomisi bileşenleri (Şekil 1, 3), karmaşık ve karışık vardır. Seçici olarak akustik ganglion hücre kaynaklanan lifler izleme tarafından VIII sinir hem de beyin sapı içindeki birincil işitsel afferent kesimleri temiz bir şekilde takip edilebilir ve bunların muadilleri vestibüler (Şekil 2, 3) ayırt edilir. Aynı şekilde, bu tekniğin akustik ganglion hücrelerinin periferik projeksiyonları (Şekil 3G) incelemek için …

Discussion

VIII.yy. sinirin erken geliştirme çalışmaları nedeniyle birden çok farklı gangliyon kaynaklanan embriyonik aksonlar tanımada zorluk kısmen sınırlı kalmıştır. Çeşitli çalışmalar erken gelişimi sırasında işitsel ve vestibüler duyu hücre ve ganglion hücre kaderi rehberlik moleküler sinyaller, 5,11,12 araştırdı fakat merkezi innervasyon düzenleyen süreçler belirlenecek henüz. Az ilköğretim çekirdekler için projelendirme merkezi süreçleri hakkında bilinenler ise akustik ga…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar erken embriyonik dönemde piliç iç kulak anatomisi üzerine uzmanlık için görüntüleme teknikleri ve Dr Doris Wu ile öneri ve yardım için Dr Candace Hsieh teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 ve DOE GAANN P200A120165 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Polystyrene Weigh Dish Fisher Scientific 02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm Fisher Scientific 50820644 Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit World Precision Instruments SYLG184 Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins Various Holds embryo in place during dissection
NaCL Various part of aCSF recipe
KCl Various part of aCSF recipe
KH2PO4 Various part of aCSF recipe
NaHCO3 Various part of aCSF recipe
Glucose Various part of aCSF recipe
CaCl2 Various part of aCSF recipe
MgSO4 Various part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. CPLabSafety QP-PLC-03717 Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial American Pharmaceutical Partners, Inc 6332300105 Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler Various Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler Various To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps World Precision Instruments 501008 To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps World Precision Instruments 501985 For micro-dissection
50 ml Beaker various
Rhodamine Dextran Amine (RDA) Invitrogen various Fluorescent axon tracer
Triton X-100 ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) Various Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length World Precision Instruments TW120F-4 Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer Parker Instrumentation various Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator Narishige various
Dissection microscope with fluorescence Various
4% Paraformaldehyde Various Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional Millipore AB1991 Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning Leica various
Epifluorescent microscope for imaging Zeiss, various

References

  1. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
  2. Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
  3. Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
  4. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
  5. Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
  6. Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
  7. Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
  8. Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
  9. Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
  10. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  11. Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
  12. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
  13. Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
  14. Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
  15. Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
  16. Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
  17. Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
  18. Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
  19. Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
  20. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
  21. Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
  22. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
  23. Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).

Play Video

Cite This Article
Allen-Sharpley, M. R., Tjia, M., Cramer, K. S. Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve. J. Vis. Exp. (73), e50305, doi:10.3791/50305 (2013).

View Video