I denne video, vil vi vise, hvordan man optager elektriske aktivitet fra identificerede enkeltstoffer neuroner i en hel hjerne forberedelse, som bevarer komplekse neurale kredsløb. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med et fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne forberedelse.
Forstå cellens fysiologi af neurale kredsløb, der regulerer kompleks adfærd er stærkt forbedret ved hjælp af modelsystemer, hvor dette arbejde kan udføres i en intakt hjerne forberedelse, hvor neurale kredsløb af CNS forbliver intakt. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med grønt fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne. Fisk har flere populationer af GnRH neuroner og deres funktioner er afhængige af deres placering i hjernen og GnRH gen, de udtrykker 1.. Vi har fokuseret vores demonstration den GnRH3 neuroner beliggende i de terminale nerver (TN) er forbundet med de olfaktoriske pærer med den intakte hjerne transgene Medaka fisk (figur 1B og C). Undersøgelser tyder på, at Medaka TN-GnRH3 neuroner er neuromodulatory, der handler som en transmitter af oplysninger fra det ydre miljø til det centrale nervesystem; they ikke spille en direkte rolle i reguleringen af hypofyse-gonade-funktioner, som gør den velkendte hypothalamus GnRH1 neuroner 2, 3. Den tonic mønster af spontan handling potentiale affyring af TN-GnRH3 neuroner er en iboende egenskab 4-6, hyppigheden hvoraf moduleres af visuelle referencer fra artsfæller 2 samt neuropeptidet kisspeptin 1 5. I denne video, bruger vi en stabil linje af transgen Medaka hvor TN-GnRH3 neuroner udtrykker et transgen indeholdende promoter region Gnrh3 knyttet til øget grønt fluorescerende protein 7 for at vise dig, hvordan du identificerer neuroner og overvåge deres elektriske aktivitet i hele hjernen forberedelse 6..
GnRH 3: GFP transgene fisk giver unikke modeller til at studere neurofysiologiske mekanismer bag neuronal integration og regulering i central kontrol af adfærd, der både direkte og indirekte involveret i reproduktion 3, 8-10. En af de betydelige fordele ved denne model er, at mange GnRH3 neuroner udtrykker GFP er tæt på den ventrale overflade af hjernen, der giver mulighed for forholdsvis let adgang til de neuroner elektrofysiologiske optagelse uden at forstyrre neurale kredsløb 6, 9, 11, 1…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Meng-Chin Lin og Ms Yuan Dong til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health HD053767 (underleverance til NLW) og af midler fra Institut for Fysiologi og kontor vicekansler for forskning, University of California-Los Angeles (NLW).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
GFP filter set | Chroma Technologies | ||
Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Microelectrode for recording |
Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |