Summary
यहाँ हम प्रतिदीप्ति intravital माइक्रोस्कोपी का एक प्रयोगात्मक तकनीक संवहनी सूजन और जीवित चूहों में thrombus गठन के दौरान सक्रिय endothelium पर heterotypic प्लेटलेट न्युट्रोफिल बातचीत कल्पना की रिपोर्ट. इस सूक्ष्म प्रौद्योगिकी रोग के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए और pathophysiological शर्तों के तहत pharmacologic एजेंटों का परीक्षण करने के लिए मूल्यवान होगा.
Abstract
पर arteriolar चोट के स्थल पर thrombus गठन के दौरान सक्रिय endothelium mediates घनास्त्रता और संवहनी सूजन पर सक्रिय और प्लेटलेट्स (मुख्य रूप से neutrophils) leukocytes की सहभागिता. 1,2, सक्रिय endothelium और subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन अनुयायी प्लेटलेट्स न्युट्रोफिल रोलिंग और आसंजन का समर्थन 3. इसके विपरीत, venular भड़काऊ शर्तों के तहत, सक्रिय endothelium अनुयायी neutrophils आसंजन और प्लेटलेट्स परिसंचारी के संचय का समर्थन कर सकते हैं. Heterotypic एकत्रीकरण प्लेटलेट न्युट्रोफिल विशिष्ट रिसेप्टर काउंटर कोशिकाओं के बीच रिसेप्टर बातचीत द्वारा अनुक्रमिक प्रक्रियाओं की आवश्यकता है 4. यह ज्ञात है कि वॉन Willebrand कारक के रूप में सक्रिय endothelial कोशिकाओं आसंजन अणुओं जारी है, जिससे उच्च कतरनी शर्तों के तहत प्लेटलेट आसंजन और संचय की शुरुआत. इसके अलावा 5, सक्रिय endothelial कोशिकाओं न्युट्रोफिल रोलिंग और व्यक्त selectins द्वारा आसंजन एक का समर्थनघ कहनेवाला आसंजन अणु 1 (ICAM-1), क्रमशः कम कतरनी की शर्तों के तहत, 4 पी selectin प्लेटलेट. के माध्यम से neutrophils के साथ सूचना का आदान प्रदान पी selectin ligand एक glycoprotein (PSGL-1), जिससे न्युट्रोफिल β2 integrins और फर्म की सक्रियता उत्प्रेरण दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच आसंजन. इन विट्रो प्रयोगों में प्रगति है जिसमें heterotypic प्लेटलेट न्युट्रोफिल बातचीत पूरे रक्त या अलग कक्षों, 6,7 में निर्धारित कर रहे हैं के बावजूद उन अध्ययनों oxidant तनाव की स्थिति रोग के दौरान हेरफेर नहीं कर सकते. इस रिपोर्ट में, एक प्लेटलेट और न्युट्रोफिल मार्कर माउस के खिलाफ fluorescently लेबल, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हम एक विस्तृत intravital सूक्ष्म प्लेटलेट्स और neutrophils की TNF-α प्रेरित सूजन या लेजर प्रेरित के बाद के दौरान सक्रिय endothelium पर heterotypic बातचीत की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन जीवित चूहों cremaster मांसपेशी microvessels में चोट.
Protocol
1. Intravital माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ए) की तैयारी
- (125 मिमी NaCl, 4.5 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 CACL, 1 मिमी MgCl 2, और 17 मिमी NaHCO 3, पीएच 7.4) superfusion बफर तैयार.
- एक संचार पानी के स्नान पर चालू करने के लिए 37 पर बफर का तापमान बनाए रखने और एक कंबल thermo नियंत्रित डिग्री सेल्सियस नाइट्रोजन गैस (5% सीओ 2 नाइट्रोजन के साथ संतुलित) के साथ बफर Aerate.
- खुर्दबीन प्रणाली पर बारी (Sutter Lambda महानिदेशक-4 उच्च गति तरंगदैर्ध्य परिवर्तक, कार्य केंद्र कंप्यूटर, ओलिंप BX61W माइक्रोस्कोप, MPC-200 बहु - मैनिप्युलेटर, मछली-200 मंच नियंत्रक, उच्च गति कैमरा, और intensifier).
- संवहनी सूजन मॉडल के लिए, एक 100% dichroic दर्पण का उपयोग करें. लेजर की चोट से thrombus गठन को प्रेरित करने के लिए, एक 50/50% दर्पण के साथ एक 100% दर्पण की जगह और एक micropoint लेजर पृथक प्रणाली पर बारी.
2. Intravital माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार cremaster स्नायु (चित्रा 1B)
- एक anesthetize(125 शरीर मिलीग्राम / किलो वजन (BW)) ketamine और xylazine आईपी इंजेक्शन (BW 12.5 मिलीग्राम / किग्रा) पुरुष माउस (6-8 सप्ताह पुरानी है, C57BL / 6). इलिनोइस संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय के सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी है. एक संवहनी सूजन मॉडल के लिए, एक माउस 3 घंटा में intrascrotally murine TNF-α (250 μl खारा में 0.5 ग्राम) इमेजिंग के लिए पहले इंजेक्षन (2-2.5 सर्जरी से पहले घंटा).
- Thermo नियंत्रित एक कंबल पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक intravital खुर्दबीन ट्रे पर माउस रखें.
- संदंश का उपयोग कर गर्दन की सतह पर त्वचा खींचो और क्षैतिज कैंची से 1 सेमी गर्दन की त्वचा के midline काटकर अलग कर देना.
- धीरे गर्भाशय ग्रीवा कुंद कैंची का उपयोग मांसपेशियों को खोलने और ट्रेकिआ आसपास के मांसपेशियों को दूर.
- श्वासनली में एक ट्यूब PE90 साँस लेने में कठिनाई को खत्म करने Cannulate.
- धीरे ग्रीवा की मांसपेशी के बाईं ओर हटाने और आसपास के ऊतकों से गले नस को अलग.
- सी सालानादेर एंटीबॉडी और अतिरिक्त anesthetics के अर्क के लिए छोड़ दिया गले नस में एक PE10 ट्यूब.
- धीरे बाहर खींच और scrotal त्वचा क्षैतिज काटकर अलग कर देना. प्रयोग के दौरान ऊतक अखंडता को बनाए रखने के, prewarmed बफर शल्य चिकित्सा क्षेत्र से अधिक superfused किया गया था.
- एक forcep साथ पेट के निचले हिस्से पर प्रेस और ध्यान से बाहर अन्य forcep साथ एक अंडकोष पुल.
- वृषण के आसपास के आसपास संयोजी ऊतकों निकालें.
- Cremaster मांसपेशी खड़ी काटकर अलग कर देना और एक intravital खुर्दबीन ट्रे पर एक परिधि लगाए द्वारा कांच coverslip पर मांसपेशियों समतल.
- मांसपेशी डेटा संग्रह से पहले को स्थिर करने के लिए 10-20 मिनट की अनुमति दें. Cremaster मांसपेशियों (thrombus गठन के लिए) और 30-45 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के साथ arterioles venules (संवहनी सूजन के लिए) हमारे अध्ययन के लिए चुना गया था.
- चतनाशून्य करनेवाली औषधि की स्थिति बनाए रखने के लिए, चतनाशून्य करनेवाली औषधि ही लगभग कंठ का cannulus माध्यम से हर 30 मिनट की 30-50 मिलीलीटर दिखे.
- Intravital माइक्रोस्कोप, खुला SlideBook 5.0 सॉफ्टवेयर पर माउस की नियुक्ति के बाद और मेनू पट्टी पर फोकस विंडो "पर क्लिक करने के लिए उपयुक्त और प्रकाशिकी उद्देश्य (60x) सेट.
- Dylight दिखे 488 संयुग्मित विरोधी माउस चूहा (0.1 / 100 μl खारा में छ छ BW) CD42c और Alexa 647-संयुग्मित विरोधी माउस चूहा जीआर एक एंटीबॉडी (0.05 / 100 μl खारा में छ छ BW) एक कंठ का cannulus के माध्यम से Fluor .
- मेनू पट्टी के पास जाओ, और टूलबार में "छवि कैद" पर क्लिक करें.
- एक नया मेनू ऊपर पॉप जाएगा, "छवि", "बिन फैक्टर" का चयन करें और 1x1 के रूप में चुनें "640" चौड़ाई पर और ऊंचाई पर "460".
- "फिल्टर सेट", चैनल है कि आप को बेनकाब करने के लिए और प्रत्येक के लिए जोखिम समय निर्धारित करने के लिए करना चाहते हैं के लिए चेकबॉक्स निशान. उदाहरण के लिए, खुली चैनल: 10 मिसे, FITC चैनल: 50 मिसे, और Cy5 चैनल: 50 मिसे.
- "समय चूक कब्जा" अंक और समय अंतराल की संख्या को समायोजित करने के लिए चुनें. के लिएसूजन मॉडल r, समय बिंदुओं की संख्या 200 मिसे के अंतराल (: 5 मिनट कुल गुजरे समय) के साथ 1,000-1,500 के लिए सेट कर दिया जाता है.
- "टेस्ट" उस चैनल के लिए निर्दिष्ट जोखिम समय में एक एकल विमान छवि को देखने के लिए क्लिक करें. समायोजित जोखिम समय और / या प्रकाश माइक्रोस्कोप तक हिस्टोग्राम एक पर्याप्त तीव्रता वितरण (मल्टी चैनल पर कब्जा करने के लिए, प्रत्येक चैनल के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने) से पता चलता है.
- एक बार मानकों के सभी (चैनल, जोखिम बार, और इतने पर) "छवि कैद में स्थापित कर रहे हैं," प्रारंभ "पर कब्जा करने के लिए शुरू करने का चयन करें.
- रोलिंग और पक्षपाती संवहनी सूजन मॉडल में एक सूजन cremaster venule के शीर्ष आधा में 5 मिनट के लिए प्लेटलेट्स और neutrophils मॉनिटर. आठ से दस अलग venules एक माउस में दर्ज कर रहे हैं.
- छवियाँ 60x के एक कुल बढ़ाई (1.0 NA पानी विसर्जन उद्देश्य) 157 x 118 सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी की एक खिड़की के आकार देने का उपयोग कर लिया गया है.
- प्रयोग के पूरा होने पर, चूहों के माध्यम से ग्रीवा dislocatio euthanized थेn.
4. Venular सूजन मॉडल के लिए डेटा विश्लेषण
- SlideBook 5.0 सॉफ्टवेयर खोलें और एक फ़ाइल खोलने के लिए "फ़ोल्डर" मेनू पट्टी पर क्लिक करें.
- चैनल ड्रॉप - डाउन मेनू पर क्लिक करें और चुनें "खोलें, FITC, Cy5, आदि."
- "(लाल और हरे रंग की सलाखों) Renormalize" और चैनल का चयन करें क्लिक करें. छोड़ दिया है या सही करने के लिए लाल और हरे रंग की सलाखों खींचें करने के लिए मोटे तौर पर अनुकूलन प्रतिदीप्ति संकेत.
- "लागू करें" और "ठीक है" छवि को अद्यतन करने के लिए क्लिक करें.
- डिफ़ॉल्ट के रूप में वर्तमान प्रदर्शन का चयन करने के लिए "थंबनेल" बटन पर क्लिक करें.
- चलायें timelapse छवि पर कब्जा कर लिया, और 5 मिनट की अवधि के दौरान रोलिंग और पक्षपाती neutrophils गिनती.
- प्लेटलेट thrombus गठन का विश्लेषण करने के लिए, "मास्क" जाओ और चुनें "बनाएँ".
- एक मुखौटा और नाम "वर्तमान छवि में" निशान.
- मुख्य दृश्य में "एक प्रकार का बड़ा खेमा उपकरण" में "बड़े पेंसिल आइकन पर क्लिक करें."
- मुख्य करने के लिए एक पृष्ठभूमि मुखौटा सेट में पोत के बाहर एक क्षेत्र रंग.
- टी जाओओ "मास्क" क्लिक करें, "इस विमान को कॉपी" "वर्तमान Timepoint में प्रतिलिपि मुखौटा" पर क्लिक करें और "सभी timepoints" का चयन करें, और "ठीक है" पर क्लिक करें.
- पृष्ठभूमि संकेत की गणना करने के लिए, "सांख्यिकी" जाओ और "मास्क सांख्यिकी" क्लिक करें.
- "वर्तमान 2D समय चूक या 4D छवि (ओं)" छवि स्कोप में क्लिक करें, और मास्क स्कोप में पूरे मुखौटा "का चयन करें. सुविधाओं में चयन करने के लिए, "बीता हुआ समय (hh: mm: ms)" कब्जा की तारीख के तहत, चुनें "क्षेत्र (पिक्सेल)" Morphometry तहत, तीव्रता के तहत अधिकतम तीव्रता "का चयन करें, और क्लिक करें" निर्यात "(इससे पता चलता है विधि हमें करने की अनुमति देता है ऑटो प्रतिदीप्ति (पृष्ठभूमि संकेत) तीव्रता) की गणना.
- एमएस Office Excel में पाठ फ़ाइल खोलें और रिकॉर्डिंग की अवधि भर पृष्ठभूमि संकेत के औसत मूल्य की गणना. इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता है.
- Thrombus तीव्रता का निर्धारण करने के लिए, "बड़े पेंसिल आइकन" फिर "मुख्य दृश्य में एक प्रकार का बड़ा खेमा उपकरण" में क्लिक करें.
- मुख्य प्लेटलेट संकेत सेट में पोत के अंदर रंग.
- "मास्क" जाएँ क्लिक करें, "इस विमान को कॉपी" "वर्तमान Timepoint में प्रतिलिपि मुखौटा" पर क्लिक करें, "सभी timepoints" का चयन करें, और "ठीक" क्लिक करें.
- "आँकड़े" के पास जाओ और "मास्क सांख्यिकी" क्लिक करें.
- "वर्तमान 2D समय चूक या 4D छवि (ओं)" छवि स्कोप में क्लिक करें, और मास्क स्कोप में पूरे मुखौटा "का चयन करें. सुविधाओं में चयन करने के लिए, "बीता हुआ समय (hh: mm: ms)" कब्जा की तारीख के तहत, "क्षेत्र (पिक्सेल)" Morphometry के तहत, "Sum तीव्रता" का चयन तीव्रता के तहत, और क्लिक करें "निर्यात" (इससे पता चलता है विधि का चयन हमें करने की अनुमति पोत के अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना).
- एमएस Office Excel में पाठ फ़ाइल खोलें. प्लेटलेट्स प्रतिदीप्ति संकेत पोत के अंदर की राशि तीव्रता से पृष्ठभूमि तीव्रता x क्षेत्र के औसत मूल्य (पिक्सेल) subtracting द्वारा गणना की है. यह प्लेटलेट thrombus प्रतिदीप्ति तीव्रता है.
- 3-5 अलग चूहों में 30 विभिन्न venules में इस दोहराएँ. फिर, प्लेटलेट्स की प्रतिदीप्ति तीव्रता के औसत मूल्य की गणना.
- सेन्युट्रोफिल रोलिंग और आसंजन का विश्लेषण करने के लिए, neutrophils के रोलिंग बाढ़ प्रत्येक venule में 5 मिनट से अधिक निर्धारित किया गया था और प्रति मिनट सेल नंबर के रूप में प्रस्तुत किया. पक्षपाती neutrophils कि> 30 सेकंड के लिए स्थिर थे और धीरे धीरे (<10 सुक्ष्ममापी सेकंड 30 से अधिक) क्रॉल, लेकिन रोल पर नहीं की संख्या गिना रहे थे और 5 मिनट प्रति सेल नंबर के रूप में प्रस्तुत किया.
5. लेजर प्रेरित Arteriolar घनास्त्रता के लिए intravital माइक्रोस्कोपी
पृथक लेजर के 5-1 अंशांकन
- खुर्दबीन मंच पर मिरर स्लाइड प्लेस, आसुत जल के एक छोटे से स्लाइड के शीर्ष पर ड्रॉप लागू, और तीव्रता को समायोजित करने और ऐपिस का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित.
- "फोकस खिड़की खोलें और SlideBook 5.0 सॉफ्टवेयर में" FRAP "टैब का चयन करें.
- 40-50 में लेजर की सत्ता स्थापित करने के लिए, और दोनों "डबल क्लिक करें repetitions" और "डबल क्लिक करें आकार" 8 सेट करें. "गाइड" बॉक्स पर मार्क क्रॉसहेयर का एक सेट लाने के लिए.
- कार्यपट्टी ओ से "तीर" आइकन का चयन करेंn स्क्रीन के शीर्ष.
- "FRAP संरेखण" टैब के तहत, "अगले फायर" पर क्लिक करें. एक छोटी सी जगह कम मॉनिटर पर बाएं कोने के पास दिखाई देनी चाहिए. एक बार जगह दिखाई देता है, यह के केंद्र पर डबल क्लिक करें. बार क्लिक करने पर एक अन्य स्थान के ऊपर दिखाई देगा और पहले स्थान की सही करने के लिए करना चाहिए, उस पर डबल क्लिक करें. 16 अंक (16 वें स्थान निचले सही कोने में दिखाई देगा.) "सहेजें" क्लिक करें जब पूरा अंशांकन मानकों को अद्यतन करने के लिए के लिए इस दोहराएँ.
- अंशांकन की सटीकता का परीक्षण, "केन्द्र" बटन एक छोटी सी जगह पर क्लिक करें स्क्रीन के केंद्र में दिखाई देनी चाहिए. यदि नहीं, तो अंशांकन दोहराने जब तक वांछित सटीकता हासिल की है.
5-2 लेजर प्रेरित arteriolar thrombus गठन
- एक anesthetized माउस (2-2 करने के लिए 2-12 की प्रक्रिया देखें) खुर्दबीन मंच पर रखें.
- "कब्जा" खिड़की के तहत, एक प्रोटोकॉल का चयन करें या एक नया एक बना. सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: Cy5 (70 मिसे जोखिम), ओपन (10 mseग), जोखिम और FITC (50 मिसे जोखिम). छवि 20 मिनट (लगभग 2,400 500 मिसे के अंतराल समय के साथ समय अंक) पर कब्जा कर लिया है.
- 488 संयुग्मित विरोधी माउस CD42c और Alexa Fluor 647-संयुग्मित विरोधी माउस जीआर-1 के रूप में ऊपर वर्णित एंटीबॉडी Dylight दिखे.
- माइक्रोस्कोप सहित प्रतिदीप्ति तीव्रता और उज्ज्वल क्षेत्र छवि के रूप में 3-3 में 3-7 वर्णित मापदंडों का अनुकूलन.
- उचित brightfield तीव्रता या एंटीबॉडी संकेत, धमनिका प्लेसमेंट और ध्यान को सुनिश्चित करने के लिए 'टेस्ट मैच' बटन पर क्लिक करें.
- "आरंभ" छवि पर कब्जा करने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए क्लिक करें.
- पृथक लेजर फायरिंग से पहले यह सुनिश्चित करें कि माउस सूचक चिह्न का चयन किया गया है और पोत दीवार स्पष्ट ध्यान में है कि कर सकते हैं.
- लेजर आग, 2-3 सुक्ष्ममापी आंतरिक पोत दीवार से एक स्थान पर डबल क्लिक करें. Arteriolar endothelial कोशिकाओं की चोट कि brightfield छवि में स्पष्ट होना चाहिए एक दृश्य आकार परिवर्तन का कारण बनता है, प्लेटलेट संचय के द्वारा पीछा किया. मॉनिटर thrombusलेजर चोट के बाद 5 मिनट के लिए गठन.
- लेजर की चोट के बाद पांच मिनट (thrombus आकार अब स्थिर होना चाहिए) ठहराव और कब्जा रद्द. बाद में, 2400 एक 500 मिसे अंतराल के साथ 20 मिनट के लिए पक्षपाती प्लेटलेट्स और रोलिंग / पक्षपाती neutrophils रिकॉर्ड समय अंक के साथ एक पर कब्जा शुरू. तीन से पांच arterioles एक माउस में दर्ज कर रहे हैं.
- प्रयोग के पूरा होने पर, चूहों ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से euthanized थे.
6. Arteriolar घनास्त्रता मॉडल के लिए डेटा विश्लेषण
- 4.5 के माध्यम से 4.1 कदम पर जाओ.
- प्लेटलेट thrombus गठन के दौरान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए, चरण 4.14 के माध्यम से 4.7 जाओ.
- "मास्क" जाओ, "सेगमेंट", चैनल में चयन FITC क्लिक करें, और कम पर पृष्ठभूमि संकेत के औसत मूल्य डालें. क्लिक करें "लागू करें" और "ठीक है".
- प्लेटलेट thrombus प्रतिदीप्ति तीव्रता (Dylight 488 संयुग्मित एंटीबॉडी विरोधी CD42c) का विश्लेषण करने के लिए,
- रोलिंग और पक्षपाती neutrophils यों, Timelapse खेलते हैं और कोशिकाओं है कि जाहिरा तौर पर 20 मिनट से अधिक प्लेटलेट thrombus पर रोल की संख्या गिनती. रोलिंग न्युट्रोफिल गति में कमी के रूप में परिभाषित किया गया है, जबकि कम से कम 2 सेकंड के लिए प्लेटलेट thrombus के साथ बातचीत. पक्षपाती neutrophils किसी भी neutrophils है कि कम से कम 2 मिनट के लिए प्लेटलेट thrombus से जुड़े रहते हैं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. रोलिंग और पक्षपाती neutrophils की संख्या 20 प्रति मिनट सेल नंबर के रूप में प्रस्तुत किया गया था. रोलिंग वेग एक कण ट्रैकिंग प्रणाली का उपयोग कर की गणना की थी.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक विस्तृत intravital माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का प्रयोग, सक्रिय endothelium पर heterotypic प्लेटलेट न्युट्रोफिल बातचीत एक (CD42c) प्लेटलेट या जीवित चूहों में न्युट्रोफिल मार्कर (जीआर-1) के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी के अर्क से देखे थे.
TNF-α प्रेरित venular सूजन के एक मॉडल में, सबसे रोलिंग neutrophils stably endothelium करने के लिए गए थे संभवतः सक्रिय β2 integrins की बातचीत से रिकॉर्डिंग अवधि (3-4.5 घंटा TNF-α के इंजेक्शन के बाद, चित्रा 2A के दौरान पालन ICAM-1 के साथ ) 8 रोलिंग और पक्षपाती neutrophils पहले से ही उपस्थित थे पहले वीडियो पर कब्जा TNF-α प्रेरित endothelial सेल सक्रियण के कारण शुरू हुआ. सूजन endothelial कोशिकाओं पर रोलिंग और पक्षपाती neutrophils की संख्या 0.25 थी? 0.05 प्रति मिनट और 18.5 कोशिकाओं ± 5 मिनट, क्रमशः (आंकड़े 2B और 2C) प्रति 0.7 कोशिकाओं. अधिकांश neutrophils टी का पालन कर रहे थेवह वीडियो पर कब्जा (1-1.5 घंटा) की अवधि के लिए endothelium सक्रिय है, और वहाँ केवल रोलिंग कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा) में कम से कम वृद्धि के साथ साथ एक पक्षपाती कोशिकाओं में न्यूनतम कमी थी. हमने पाया है कि ज्यादातर प्लेटलेट्स पक्षपाती और रेंगने बजाय neutrophils सूजन पोत दीवार (चित्रा 2A, वीडियो 1) का पालन करने के हैं. प्लेटलेट थ्रोम्बी संचित और वीडियो पर कब्जा की अवधि के लिए बार - बार embolized. एकीकृत प्रतिदीप्ति पक्षपाती प्लेटलेट्स के साथ जुड़े संकेत चित्र 2 डी में दिखाया गया था.
लेजर प्रेरित arteriolar घनास्त्रता मॉडल का उपयोग, हम प्लेटलेट्स और neutrophils की साइट पर arteriolar दीवार चोट की heterotypic बातचीत के लिए जांच और विशेषताएँ करने में सक्षम थे. इस मॉडल में, thrombus आकार लेजर चोट के बाद 100 सेकंड के आसपास नुकीला, अगले 2-3 मिनट (नहीं दिखाया डेटा) के लिए तेजी से छोटे embolization की एक श्रृंखला के द्वारा पीछा 9,10 लेजर चोट के बाद पांच मिनट के, प्लेटलेट टी के आकार.hrombus इमेजिंग (लेजर चोट के बाद 5-25 मिनट, आंकड़े 3A -3 सी) और लुढ़का neutrophils दौरान अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई और प्लेटलेट thrombus (आंकड़े 3A-3B, वीडियो 2) का पालन. घूम प्लेटलेट्स से प्रतिदीप्ति संकेत कि प्लेटलेट thrombus से साथ तुलना में नगण्य था. रोलिंग और पक्षपाती neutrophils की संख्या 21.5 ± 20 मिनट, क्रमशः आंकड़े (3D-3E) पर 3.0 और 1.6 ± 0.4 कोशिकाओं. Neutrophils के प्रारंभिक तेजी से रोलिंग endothelial कोशिकाओं पर हुई. एक बार neutrophils प्लेटलेट thrombus से संपर्क किया, एक प्लेटलेट thrombus पर neutrophils के रोलिंग वेग 8.2 की एक सीमा ± प्रति सेकंड 1.1 सुक्ष्ममापी (3F चित्रा), जो पी selectin और PSGL-1 के बातचीत के द्वारा मध्यस्थता है के साथ बदल गया था 11.
चित्रा 1.Intravital खुर्दबीन प्रणाली (ए) और cremaster मांसपेशी microvessel (बी) की तैयारी के योजनाबद्ध.
चित्रा 2. प्लेटलेट्स और neutrophils की TNF-α प्रेरित जीवित चूहों में venular सूजन के दौरान heterotypic बातचीत प्लेटलेट्स और neutrophils 488 संयुग्मित CD42c विरोधी माउस Dylight और 647-संयुग्मित विरोधी माउस जीआर 1-एंटीबॉडी Fluor Alexa पाया गया है, क्रमशः. ( ए) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति neutrophils (लाल) और 180 सेकंड से अधिक प्लेटलेट्स (हरा) के साथ जुड़े संकेतों की उपस्थिति की छवियों binarized. तीर रक्त के प्रवाह की दिशा से पता चलता है. = बार 10 सुक्ष्ममापी (BC) रोलिंग की संख्या (कोशिकाओं / मिनट) और सूजन endothelial कोशिकाओं (कोशिकाओं / 5 मिनट) पर पक्षपाती neutrophils दिखाया गया है. डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं मतलब ± 30 di के SEM4 प्रकार के जंगली चूहों में fferent venules. (डी) माध्य प्लेटलेट्स (प्लेटलेट एफ) के एकीकृत प्रतिदीप्ति संकेत समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची है. कोई संकेत Dylight 488 संयुग्मित नियंत्रण चूहा आईजीजी (नहीं दिखाया डेटा) के साथ पाया गया.
चित्रा 3. लेजर प्रेरित जीवित चूहों में arteriolar चोट के स्थल पर एक प्लेटलेट thrombus साथ neutrophils की heterotypic बातचीत प्लेटलेट्स और neutrophils. चित्रा 2 में वर्णित के रूप में पाया गया. (ए) एक एकल न्युट्रोफिल (लाल, पीले तीर) प्लेटलेट thrombus रोल (हरा) जबकि एक दूसरे न्युट्रोफिल (लाल, सफेद तीर) तेजी से arteriolar endothelial कोशिकाओं, 5 सेकंड पर दिखाया रोल. (बी) एक एकल न्युट्रोफिल (लाल) पर रोलिंग और एक प्लेटलेट (हरा) thrombus 15 सेकंड पर दिखाया पालन . arrowhead रोलिंग और पक्षपाती पूर्वोत्तर से पता चलता हैutrophils. बार = 10 सुक्ष्ममापी. मोटी, ग्रे तीर रक्त के प्रवाह की दिशा से पता चलता है. (सी) माध्य प्लेटलेट्स (प्लेटलेट एफ) के एकीकृत प्रतिदीप्ति संकेत समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट (डे) प्लेटलेट thrombus पर रोलिंग और पक्षपाती neutrophils की संख्या (cells/20 मिनट) दिखाया गया है. (एफ) रोलिंग वेग प्लेटलेट thrombus पर neutrophils. डेटा मतलब ± 5 प्रकार के जंगली चूहों में 14 थ्रोम्बी के SEM प्रतिनिधित्व करते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ हम वास्तविक समय प्रतिदीप्ति intravital संवहनी सूजन और घनास्त्रता के दौरान सक्रिय endothelium पर heterotypic प्लेटलेट न्युट्रोफिल बातचीत कल्पना माइक्रोस्कोपी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. पहले, thrombus गठन और संवहनी सूजन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इसी तरह की प्रतिदीप्ति सूक्ष्म दृष्टिकोण सूचित किया गया 8,12 से heterotypic सेल सेल बातचीत साइट पर चोट vaso-रोड़ा के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, इस तकनीक के लिए एक कीमती उपकरण होगा रोग के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन. वास्तविक समय इमेजिंग तकनीक का लाभ भड़काऊ और thrombotic परिस्थितियों के तहत सक्रिय / क्षतिग्रस्त endothelium पर intravascular कोशिकाओं के तत्काल और बाद में बातचीत की निगरानी है. इसके अलावा, हमारे सूक्ष्म प्रणाली परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं और endothelial या रक्त कोशिकाओं के बीच heterotypic बातचीत fluo का उपयोग का अध्ययन करने में उपयोग किया जा सकता हैट्यूमर कोशिकाओं या मानव उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) के रूप में इस तरह के ट्यूमर सेल मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी rescently लेबल fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करने के बजाय 13,14, इस माइक्रोस्कोपी भी ट्रांसजेनिक एक विशेष सेल प्रकार में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त चूहों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है इस तरह के रूप में CD41 EYFP + megakaryocytes. 15
Fluorescently लेबल एंटीबॉडी की तीव्रता का उपयोग करना, हम प्लेटलेट thrombus गठन और पोत की चोट के बाद सक्रिय intravascular कोशिकाओं पर आणविक अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स का निर्धारण कर सकता है. हालांकि, ज्यादातर इस उद्देश्य में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी प्रतिजन समारोह है जो अप्रत्याशित परिणामों में परिणाम हो सकता है को बाधित. इसलिए, विशेष देखभाल के साथ प्रयोग किया जा बाहर किया जाना चाहिए अनुकूलन एकाग्रता, जिस पर अपने बाध्यकारी एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन समारोह को प्रभावित किए बिना पर्याप्त प्रतिदीप्ति संकेत प्रतिजन के लिए देता है. इसके अलावा, एंटीबॉडी विशिष्टता एक और आईएसएस हैue. यह ज्ञात है कि वृक्ष के समान कोशिकाओं और monocytes की subpopulations जीआर-1 के निम्न स्तर व्यक्त 16.
फिर भी, हमने पाया है कि monocytes तीव्र सूजन और thrombus गठन के दौरान रोलिंग leukocytes के केवल 3-5% है, के रूप में F4/80 माउस के खिलाफ एक fluorescently लेबल एंटीबॉडी कि विशेष रूप से monocytes और वृक्ष के समान कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा) में व्यक्त किया जाता है के द्वारा निर्धारित है. TNF-α प्रेरित venular सूजन और लेजर प्रेरित arteriolar घनास्त्रता के दौरान इसलिए, अधिकांश रोलिंग और पक्षपाती leukocytes neutrophils होगा.
इस रिपोर्ट में, हम दो संवहनी रोग के माउस मॉडल का इस्तेमाल किया. हालांकि हम समझते हैं कि कोई पशु मॉडल मानव रोग की स्थिति की पुनरावृत्ति कर सकते हैं, काम जीना इस तकनीक का प्रयोग चूहों के microvessels में बाहर किए गए मानव रोग के लिए एक प्रत्यक्ष प्रासंगिकता होगा और आसानी से thrombo भड़काऊ रोगों के बेहतर इलाज के अनुवाद करने के लिए किया जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान (HL101302 P30 और RO1 जे.सी. HL109439) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (जे.सी. 5270005 SDG) द्वारा समर्थित किया गया. ए Barazia T32HL007829 NIH प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
