Summary
Her rapporterer vi en eksperimentel teknik til fluorescens intravital mikroskopi at visualisere heterotypiske blodplade-neutrophile interaktioner på aktiveret endotel under vaskulær inflammation og thrombedannelse i levende mus. Denne mikroskopisk teknologi vil være værdifuldt at undersøge den molekylære mekanisme af vaskulær sygdom og afprøve farmakologiske midler under patofysiologiske betingelser.
Abstract
Interaktion af aktiverede blodplader og leukocytter (primært neutrofiler) på det aktiverede endotel medierer thrombose og vaskulære inflammation. 1,2 I trombedannelse på stedet for arteriolær skade, blodplader adhærente til aktiveret endotel og subendotheliale matrixproteiner understøtter neutrofil rulning og adhæsion. Tre Omvendt under venular inflammatoriske tilstande, kan neutrofiler adhærente til aktiveret endotel understøtte adhæsion og akkumulering af cirkulerende blodplader. Heterotypisk blodplade-neutrofil aggregering kræver sekventielle processer af den særlige receptor-modreceptor interaktioner mellem celler. 4. Det er kendt, at aktiverede endotelceller frigiver adhæsionsmolekyler, såsom von Willebrand-faktor, og indledte blodpladeadhæsion og akkumulering under høje forskydningsbetingelser. 5. Også, aktiverede endotelceller støtte neutrophil rullende og vedhæftning ved at udtrykke selectiner end intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), henholdsvis under betingelser med lav forskydning. fire Platelet P-selectin interagerer med neutrofiler til P-selectin glycoproteinligand-1 (PSGL-1), hvorved der induceres aktivering af neutrofile β2-integriner og faste adhæsion mellem to celletyper. På trods af de fremskridt inden for in vitro-forsøg, hvor heterotypiske blodplade-neutrofile interaktioner bestemt i fuldblod eller isolerede celler, 6,7 disse undersøgelser kan ikke manipulere oxidant stress forhold under vaskulær sygdom. I denne rapport, ved hjælp af fluorescens-mærkede, specifikke antistoffer mod et muse-blodplade-og neutrofil markør beskrives en detaljeret intravital mikroskopisk protokol til overvågning heterotypiske interaktioner mellem blodplader og neutrofiler til det aktiverede endotel under TNF-α-induceret inflammation eller efter laserinduceret skade i cremaster muskel mikrokar af levende mus.
Protocol
1. Fremstilling af intravital Microscope (figur 1A)
- Forbered superfusionssystem puffer (125 mM NaCI, 4,5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, og 17 mM NaHCO3, pH 7,4).
- Tænde en cirkulerende vandbad for at opretholde temperaturen af puffer og thermo-styret tæppe ved 37 ° C. Beluftes puffer med nitrogengas (5% CO2 afbalanceret med nitrogen).
- Tænd mikroskopet system (Sutter Lambda DG-4 high speed bølgelængde changer, arbejdsstation computer, Olympus BX61W mikroskop, MPC-200 multi-manipulator, ROE-200 trin controller, high speed kamera, og intensifier).
- For vaskulær inflammation model, anvende en 100% dichroisk spejl. For at inducere trombedannelse ved laser-skade, erstatter en 100% spejl med en 50/50% spejl og tænd en micropoint laser ablation system.
2. Fremstilling af cremaster Muscle for intravital mikroskopi (figur 1 B)
- Bedøver enhanmus (6-8 uger gamle, C57BL / 6) ved IP-injektion af ketamin (125 mg / kg legemsvægt (BW)) og xylazin (12,5 mg / kg legemsvægt). The University of Illinois Institutional Animal Care og brug udvalget godkendte alle animalske pleje og eksperimentelle procedurer. En vaskulær inflammation model, injicere murin TNF-α (0,5 ug i 250 pi saltvand) intrascrotally i en mus 3 timer forud for billeddannelse (2-2,5 timer før kirurgi).
- Placere musen på et termo-styret tæppe ved 37 ° C på en intravital mikroskop bakke.
- Træk huden på overfladen af halsen ved hjælp af en pincet og incise vandret midterlinjen af halsskindet op til 1 cm med en saks.
- Åbn forsigtigt den cervikale muskler ved hjælp af stumpt saks og fjern musklen omkring luftrøret.
- Kanyle en PE90 rør i luftrøret for at eliminere åndedrætsbesvær.
- Forsigtigt fjerne den venstre side af cervikal muskel og isolere halsvenen fra det omgivende væv.
- C årligtsen en PE10 slange i venstre halsvene til infusion af antistoffer og yderligere anæstetika.
- Træk forsigtigt ud og incise den scrotalt huden vandret. For at opretholde vævet integritet under hele eksperimentet, blev forvarmet puffer superfusioneret i det kirurgiske område.
- Tryk på den nederste del af maven med en forcep og forsigtigt trække en testikel med den anden forcep.
- Fjerne de omgivende bindevæv i testiklerne.
- Incise den cremaster musklen lodret og flade muskler over et dækglas på en intravital mikroskop bakke ved at fastgøre periferien.
- Tillad 10-20 min for musklen til at stabilisere sig før dataindsamling. Cremaster muskel arterioler (for thrombedannelse) og venuler (for vaskulær inflammation) med en diameter på 30-45 um blev valgt til vores undersøgelse.
- For at opretholde anæstesi, tilføre 30-50 ml af den samme anæstetiske cirka hver 30 min gennem jugularis cannulus.
- Efter anbringelse af musen på den intravital mikroskop, åben SlideBook 5,0 softwaren og klikke på "Fokus Window" på menubjælken at fastsætte de passende optik og objektive (60X).
- Infusere Dylight 488-konjugeret rotte-anti-muse-CD42c (0,1 ug / g BW i 100 pi saltvand) og Alexa Fluor 647-konjugeret rotte anti-mus Gr-1-antistoffer (0,05 ug / g BW i 100 pi saltvand) via en jugularis cannulus .
- Gå til menulinjen, og klik på "Image Capture" i værktøjslinjen.
- En ny menu vil poppe op, I "Image", vælg "Bin Factor" som 1x1 og vælg "640" på bredden og "460" på højden.
- I "Filter Set", markere afkrydsningsfeltet for de kanaler, som du gerne vil eksponere og indstille eksponeringen tid til hver. For eksempel kanal åben: 10 msek, FITC kanal: 50 msek, og Cy5 kanal: 50 msek.
- Vælg "Time-Lapse Capture" for at justere antallet af tidspunkter og interval. For inflammation model er antallet af tidspunkter indstillet til 1.000-1.500 med et interval på 200 ms (Total forløbet tid: 5 min).
- Klik på "Test" for at se en enkelt-plane billede på det angivne eksponeringstid for den kanal. Juster eksponeringstid og / eller mikroskop lys indtil histogrammet viser en tilstrækkelig intensitet fordeling (For multi-kanal capture, gentage denne proces for hver kanal).
- Når alle parametre er indstillet (kanaler, eksponering gange, og så videre) i "Image Capture", vælg "Start" for at starte capture.
- Overvåge valsning og adhærerende blodplader og neutrofiler i 5 minutter i den øverste halvdel af en betændt cremaster vener i vaskulær inflammation model. Otte til ti forskellige venuler optages i en mus.
- Billeder blev taget med en samlet forstørrelse på 60X (1,0 NA nedsænkning i vand mål) giver et vindue størrelse på 157 um x 118 um.
- Efter afslutning af forsøget blev musene eutaniseret via cervikal dislocation.
4. Dataanalyse for Venular Inflammation Model
- Åbn SlideBook 5,0 software og klik på "Folder" på menulinjen for at åbne en fil.
- Klik på drop-down kanal menuen og vælge "Åbn, FITC, Cy5, osv."
- Klik på "Renormalize (røde og grønne søjler)" og vælg den kanal. Træk den røde og grønne bjælker til venstre eller højre for at groft optimere fluorescenssignalet.
- Klik på "Anvend" og "OK" for at opdatere billedet.
- Klik på "Thumbnail Button" for at vælge aktuelle visning som standard.
- Afspille fanget timelapse billede, og tæller valsning og adhærerende neutrofiler i 5 minutter.
- At analysere blodplade thrombusdannelse, gå til "Mask" og vælg "Opret".
- Navngiv en maske og mærke "I den nuværende billede".
- Klik på "Large blyant ikon" i "Marquee Tool" i hovedvisningen.
- Farve en region uden for fartøjet i hovedvisningen for at indstille en baggrund maske.
- Go to "Mask", klik på "Kopier dette fly", klik på "Copy maske i den nuværende tidspunkterne" og vælg "Alle tidspunkter", og klik på "OK".
- For at beregne baggrund signal, skal du gå til "Statistik" og klik på "Mask Statistics".
- Klik på "Current 2D Time Lapse eller 4D Image (s)" i Billede Scope, og vælg "Hele Mask" i Mask Scope. I Funktioner, vælg "Forløbet tid (hh: mm: ms)" under Dato for Capture, skal du vælge "Area (pixels)" under morfometri, skal du vælge "Maximum Intensity" under Intensitet, og klik på "Export" (Denne statistik metode gør det muligt for os at beregne auto-fluorescensintensitet (baggrund signal)).
- Åbn tekstfilen i MS Office Excel og beregne den gennemsnitlige værdi af baggrunden signal hele optageperioden. Dette er baggrunden fluorescensintensitet.
- For at bestemme trombe intensitet, klik på "Large blyantikon" igen i "Marquee Tool" i hovedvisningen.
- Color inde i beholderen i hovedvisningen for at indstille blodplade signal.
- Gå til "Mask", klik på "Kopier dette fly", klik på "Copy maske i den nuværende tidspunkterne", vælg "Alle tidspunkter", og klik på "OK".
- Gå til "Statistics" og klik på "Mask Statistics".
- Klik på "Current 2D Time Lapse eller 4D Image (s)" i Billede Scope, og vælg "Hele Mask" i Mask Scope. I Funktioner, vælg "Forløbet tid (hh: mm: ms)" under Dato for Capture, skal du vælge "Area (pixels)" under morfometri, vælg "Sum Intensity" under Intensitet, og klik på "Export" (Denne statistik metode giver os mulighed for beregne fluorescensintensiteten inden i beholderen).
- Åbn tekstfilen i MS Office Excel. Fluorescens-signalet af blodplader beregnes ved at trække den gennemsnitlige værdi af baggrundsintensiteten x areal (pixel) fra summen intensiteten af kogekarret. Dette er fluorescensintensiteten af de blodplade-trombe.
- Gentag dette i 30 forskellige venuler 3-5 forskellige mus. Derefter beregner middelværdien af fluorescensintensiteten af blodplader.
- Tilanalysere neutrofil rullende og adhæsion blev rullende tilstrømning af neutrofile bestemt over 5 min i hver vener og præsenteres som celletallet i minuttet. Antallet af adhærente neutrofile celler, der var stationære i> 30 sek og langsomt gennemgået (<10 um over 30 sec), men ikke rulle over, blev talt og præsenteres som celleantal pr 5 min.
5. Intravital mikroskopi af Laser-induceret arteriolær Trombose
5-1 Kalibrering af ablation laser
- Placer en spejlet slide på mikroskop scenen, anvende en lille dråbe destilleret vand til toppen af slæden, og justere intensiteten og fokusere ved hjælp okularet.
- Åbn "Focus Window" og vælg "FRAP" fanen i SlideBook 5,0 software.
- Indstil laser magt ved 40-50, og indstille både "Dobbeltklik på gentagelser" og "Dobbeltklik på størrelse" til 8. Mærk på "Guide"-boksen for at få et sæt af trådkors.
- Vælg "Arrow"-ikonet fra proceslinjen on øverst på skærmbilledet.
- Under "FRAP Justering" fanen, klik på "Fire næste". En lille plet bør figurere i nærheden af nederste venstre hjørne på skærmen. Når stedet vises, skal du dobbeltklikke på midten af det. Når du har klikket, skal et andet sted vises over og til højre for den første plet, dobbeltklik på den. Gentag dette for 16 point (16 th spot vises i nederste højre hjørne.) Klik på "Gem", når du er færdig for at opdatere kalibreringsparametre.
- For at teste nøjagtigheden af kalibreringen, skal du klikke på "Center" knap-en lille plet skal vises i midten af skærmen. Hvis ikke, gentages kalibreringen indtil den ønskede nøjagtighed er opnået.
5-2 laserinduceret arteriolær thrombedannelse
- Placer en anæstetiseret mus (se fremgangsmåden i 2-2 til 2-12) på objektbordet.
- Under "Capture"-vinduet, skal du vælge en protokol eller oprette en ny. Indstillingerne er som følger: CY5 (70 msek eksponering), Open (10 MSEc eksponering), og FITC (50 msek eksponering). Billedet er taget i løbet af 20 min (cirka 2.400 tidspunkter med et interval på 500 ms).
- Infusere Dylight 488-konjugerede anti-muse-CD42c og Alexa Fluor 647-konjugeret anti-mus Gr-1-antistoffer som beskrevet ovenfor.
- Optimere mikroskop parametre, herunder fluorescensintensitet og lyse field billede som beskrevet i 3-3 til 3-7.
- Klik på knappen "Test" for at sikre korrekt brightfield intensitet eller antistof signal, arteriole placering og fokus.
- Klik på "Start" for at starte billedoptagelse processen.
- Før udløsningen af ablation laser, sørg for, at musemarkøren ikonet er blevet valgt, og at karvæggen er i klar fokus.
- Til at fyre laser, dobbeltklikke på en plet 2-3 um internt fra karvæggen. Skade af arteriolære endotelceller bevirker en visuel formændring, der bør være indlysende i brightfield billedet, efterfulgt af blodpladeakkumulering. Monitor trombeformation i 5 min efter laser skade.
- Fem minutter efter laser skade (tromben størrelse bør nu være stabil) pause og annullere capture. Efterfølgende starte en opsamling med 2400 tidspunkter med et 500 ms interval at optage adhærente blodplader og rullende / adhærente neutrofiler i 20 min. Tre til fem arterioler optages i en mus.
- Efter afslutning af forsøget blev musene eutaniseret via cervikal dislokation.
6. Dataanalyse for arteriolær trombosemodel
- Gå over trin 4,1 gennem 4,5.
- For at opnå den baggrundsfluorescens intensitet under blodplade trombedannelse, gå over trin 4,7 gennem 4,14.
- Gå til "Mask", klik på "Segment", vælg FITC i kanalen, og indsæt den gennemsnitlige værdi af baggrunden signal på Lav. Klik på "Anvend" og "OK".
- For at analysere fluorescensintensiteten af blodplade-thrombe (Dylight 488-konjugeret anti-CD42c-antistof),
- For at kvantificere de rullende og vedhængende neutrofiler, spille timelapse og tælle antallet af celler, der synligt rulle over pladeform trombe over 20 min. Rullende defineres som et fald i neutrofil hastighed under betjening af blodplade-thrombe i mindst 2 sekunder. Adhærente neutrofiler defineres som enhver neutrofiler, der fortsat er knyttet til blodplade trombe i mindst 2 min. Antallet af rullende og vedhængende neutrofiler blev præsenteret som celleantal pr 20 min. Rolling hastighed blev beregnet ved hjælp af en partikel tracking system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en detaljeret intravital mikroskopi-analyse, heterotypiske blodplade-neutrophile interaktioner på det aktiverede endotel blev visualiseret ved infusion af fluorescens-mærkede antistoffer mod en blodplade (CD42c) eller neutrofil markør (Gr-1) i levende mus.
I en model af TNF-α-induceret venular inflammation, var de fleste rullende neutrofiler stabilt klæbet til endotelet formodentlig ved interaktion af aktiverede β2-integriner med ICAM-1 under registreringen periode (3-4,5 timer efter injektion af TNF-α, Figur 2A ). 8 Rulning og adhærente neutrofiler var allerede inden videooptagelse begyndte på grund af TNF-α-induceret endotelcelle aktivering. Antallet af valsning og adhærerende neutrofiler på de betændte endotelceller var 0,25 ± 0,05 celler pr minut og 18,5 ± 0,7 celler pr 5 min, henholdsvis (figur 2B og 2C). De fleste neutrofiler blev overholdt tHan aktiveret endotel, så længe video capture (1-1,5 timer), og der var kun en minimal nedsættelse af adhærente celler sammen med en minimal stigning i rullende celler (data ikke vist). Vi fandt, at de fleste blodplader adhærerer til adhærente og gennemsøgning neutrofiler i stedet for det betændte karvæg (figur 2A, Video 1). Blodpladetromber akkumuleret og emboliseres gentagne gange for varigheden af den video capture. Den integrerede fluorescenssignal forbundet med adhærente blodplader blev vist i figur 2D.
Udnytte laserinduceret arteriolær trombose model, vi var i stand til at undersøge og karakterisere den heterotypisk interaktion af blodplader og neutrofiler på stedet for arteriolær væg skade. I denne model toppede størrelsen af trombosen omkring 100 sek efter laser skade, efterfulgt af en række af hurtig lille embolisering for den næste 2-3 min (data ikke vist). 9,10 Fem minutter efter laser skade, størrelsen af blodplade thrombus været forholdsvis konstant i løbet af imaging (5-25 minutter efter laser skade, 3A-3C) og neutrofiler valset på og klæbet til de blodplade trombe (figur 3A-3B, Video 2). Fluorescenssignalet fra de cirkulerende blodplader var ubetydelig i sammenligning med den fra blodplader thrombus. Antallet af rullende og vedhængende neutrofiler var 21,5 ± 3,0 og 1,6 ± 0,4 celler over 20 min, henholdsvis (figur 3D-3E). Initial hurtig rulning af neutrofiler opstod på endotelcellerne. Når neutrofiler kontakt til de blodplade-trombe blev den rullende hastighed af neutrofiler på en blodplade-thrombe ændret med et interval på 8,2 ± 1,1 um per sekund (figur 3F), som er medieret af interaktionen af P-selectin og PSGL-1. 11
Figur 1.Skematisk af det intravital mikroskop system (A) og forberedelse af cremaster musklen mikrokardannelse (B).
Figur 2. Heterotypisk vekselvirkninger mellem blodplader og neutrofiler i løbet af TNF-α-induceret venular inflammation i levende mus. Blodplader og neutrofiler blev påvist ved Dylight 488-konjugeret anti-muse CD42c og Alexa Fluor 647-konjugeret anti-mus Gr-1 antistoffer. ( A) repræsentant binariseres billeder af forekomsten af fluorescenssignaler forbundet med neutrofiler (rød) og blodplader (grønne) i løbet af 180 sek. Pil viser retningen af blodstrømmen. Bar = 10 um. (BC) Antallet af ruller (celler / minut) og adhærente neutrofile celler (celler / 5 min) på betændte endotelceller er vist. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM for 30 different venuler i 4 vildtypemus. (D) Median integreret fluorescenssignal af blodplader (F blodplade) er afbildet som funktion af tiden. Intet signal blev påvist med Dylight 488-konjugeret kontrol-rotte-IgG (data ikke vist).
Figur 3. Heterotypisk interaktion af neutrofiler med et blodplade-trombe ved stedet for laserinduceret arteriolær skade i levende mus. Blodplader og neutrofiler blev påvist som beskrevet i figur 2. (A) En enkelt neutrofil (rød, gul pil) ruller over de blodplade-trombe (grøn) medens en anden neutrofil (rød, hvid pil) hurtigt ruller over arteriolære endotelceller, der er vist over 5 sek. (B) En enkelt neutrofil (rød) rulle over og klæber til en blodplade-thrombe (grøn) er vist over 15 sec . Pilespidsen viser rullende og vedhængende neutrophils. Bar = 10 um. Den tykke, grå pil viser retningen af blodstrømmen. (C) Median integreret fluorescenssignal af blodplader (F blodplade) er afbildet som funktion af tiden. (DE) Antallet af valsning og adhærerende neutrofiler på blodplade-thrombe er vist (cells/20 min). (F) Det rullende hastighed af neutrofiler i de blodplade-trombe. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM for 14 thromber i 5 vildtypemus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol for real-time fluorescens intravital mikroskopi at visualisere heterotypiske blodplade-neutrofile interaktioner på aktiveret endotel under vaskulær inflammation og trombose. Tidligere blev lignende fluorescens mikroskopiske metoder rapporteret at undersøge den molekylære mekanisme for trombedannelse og vaskulær inflammation. 8,12 Da den heterotypisk celle-celle interaktion kunne være vigtigt for karokklusion på skadestedet, vil denne teknologi være et værdifuldt værktøj til studere de cellulære og molekylære mekanismer af vaskulær sygdom. Fordelen ved real-time imaging-teknologi er at overvåge umiddelbare og efterfølgende interaktioner af intravaskulære celler på aktiveres / beskadigede endotel under inflammatoriske og trombotiske tilstande. Endvidere kan vores mikroskopiske systemet anvendes til undersøgelse heterotypiske interaktioner mellem cirkulerende tumorceller og endoteliale eller blodceller med fluorescently-mærkede tumorceller eller antistoffer mod tumor-cellemarkører, såsom human epithelial cell adhesion molecule (EpCAM). 13,14 stedet for at bruge fluorescens-mærkede antistoffer, kan dette mikroskopi også udføres med transgene mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i en specifik celletype såsom CD41-EYFP + megakaryocytter. 15
Ved hjælp af intensiteten af fluorescens-mærkede antistoffer, kunne vi bestemme kinetikken af blodplade-trombedannelse og molekylære ekspression på aktiverede intravaskulære celler efter karlæsion. Men de fleste antistoffer, der anvendes i dette formål inhiberer antigen funktion som kan resultere i uventede resultater. Derfor bør forsøget udføres med særlig omhu for at optimere den koncentration, hvor antistoffet giver tilstrækkelig fluorescenssignal ved dets binding til antigenet uden at påvirke antigen funktion. Desuden er antistofspecificitet anden issue. Det er kendt, subpopulationer af dendritiske celler og monocytter udtrykker lave niveauer af Gr-1. 16
Ikke desto mindre fandt vi, at monocytter er kun 3-5% af rullende leukocytter under akut inflammation og thrombedannelse, som bestemt ved en fluorescens-mærket antistof mod muse F4/80, som udelukkende udtrykkes i monocytter og dendritiske celler (data ikke vist). Derfor er de fleste valsning og adhærerende leukocytter i TNF-α-induceret venular inflammation og laserinduceret arteriole trombose ville være neutrofiler.
I denne rapport, brugte vi to musemodeller for vaskulær sygdom. Selvom vi forstår, at intet dyr model kan sammenfatte menneskelige sygdomstilstande, det udførte arbejde i mikrokar af levende mus anvender denne teknologi vil have en direkte relevans for sygdomme hos mennesker og vil være umiddelbart overføres til en bedre behandling af trombo-inflammatoriske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra National Institutes of Health (P30 HL101302 og RO1 HL109439 til JC) og American Heart Association (SDG 5.270.005 til JC). A. Barazia blev understøttet af en T32HL007829 NIH træning tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
