Summary
Her rapporterer vi en eksperimentell teknikk av fluorescens intravital mikroskop for å visualisere heterotypic blodplatelignende nøytrofile interaksjoner på aktivert endotel under vaskulær inflammasjon og trombedannelse i levende mus. Denne mikroskopiske teknologien vil være verdifullt å studere molekylære mekanismen for vaskulær sykdom og å teste farmakologiske stoffer i henhold patofysiologiske forhold.
Abstract
Interaksjon av aktiverte blodplater og leukocytter (hovedsakelig nøytrofiler) på den aktiverte endotel medierer trombose og vaskulær inflammasjon. 1,2 Under trombedannelse på stedet av arteriolar skade, blodplater adherente til den aktiverte endotel og subendothelial matriksproteiner støtter nøytrofil rullende og heft. 3 omvendt, under venular inflammatoriske tilstander, kan neutrofiler vedheftende til aktivert endotel støtte adhesjon og akkumulering av sirkulerende blodplater. Heterotypic platelignende nøytrofil aggregering trenger sekvensielle prosesser av de spesifikke reseptor-counter reseptor interaksjoner mellom celler. 4 Det er kjent at aktivert endotelcellene frigi adhesjonsmolekyler som von Willebrand faktor, og dermed initiere blodplate adhesjon og akkumulering under høye skjærbetingelser. 5 Også, aktivert endotelceller støtte nøytrofile rullende og heft ved å uttrykke selectins end intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1), henholdsvis, under lave skjærbetingelser. 4 Platelet P-selektin samhandler med nøytrofiler gjennom P-selektin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1), for derved å indusere aktivering av nøytrofile β2 integriner og fast adhesjon mellom to celletyper. Til tross for fremskritt i in vitro eksperimenter der heterotypic blodplatelignende nøytrofile interaksjoner bestemmes i fullblod eller isolerte celler, 6,7 disse studiene ikke kan manipulere oxidant stress forhold under vaskulær sykdom. I denne rapporten bruker fluorescently-merket, spesifikke antistoffer mot en mus blodplater og nøytrofile markør, beskriver vi en detaljert intravital mikroskopisk protokoll for å overvåke heterotypic interaksjoner av blodplater og nøytrofile på den aktiverte endotel under TNF-α-indusert inflammasjon eller etter laser-indusert skade i cremaster muskel microvessels av levende mus.
Protocol
1. Utarbeidelse av Intravital mikroskop (figur 1A)
- Forbered superfusjons buffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, og 17 mM 3 NaHCO, pH 7,4).
- Slå på en sirkulasjons vannbad for å opprettholde temperaturen av buffer og et termo-kontrollert teppe ved 37 ° C. Aerate buffer med nitrogengass (5% CO 2 balanseres med nitrogen).
- Slå på mikroskopet systemet (Sutter Lambda DG-4 høy hastighet bølgelengde veksler, arbeidsstasjon datamaskin, Olympus BX61W mikroskop, MPC-200 multi-manipulator, ROE-200 scene kontrolleren, høyhastighets kamera, og forsterker).
- For vaskulær inflammasjon modellen bruker en 100% dikroisk speil. Å indusere trombedannelse med laser skade, erstatte en 100% speil med en 50/50% speilet og slå på en micropoint laser ablasjon system.
2. Utarbeidelse av Cremaster Muscle for Intravital Mikroskopi (figur 1B)
- Anesthetize enhannmus (6-8 uker gamle, C57BL / 6) ved ip injeksjon av ketamin (125 mg / kg kroppsvekt (BW)) og xylazin (12,5 mg / kg kroppsvekt). University of Illinois Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer. For en vaskulær inflammasjon modell, injisere murint TNF-α (0,5 ug i 250 pl fysiologisk saltvann) intrascrotally til en mus 3t før avbildning (2-2.5 hr før operasjonen).
- Plasser musen på en termo-kontrollert teppe ved 37 ° C på en intravital mikroskop skuffen.
- Trekk opp huden på overflaten av halsen ved hjelp av pinsett og incise horisontalt midtlinjen av halsen huden opp til 1 cm med en saks.
- Forsiktig å åpne livmorhalsen muskel bruker sløv saks og fjern muskel rundt luftrøret.
- Cannulate en PE90 rør i luftrøret for å eliminere pustevansker.
- Fjern forsiktig venstre side av cervical muskel og isolere halsvenen fra omkringliggende vev.
- C årligsent en PE10 rør i den venstre halsvene for infusjon av antistoffer og andre anestetika.
- Trekk forsiktig ut og incise testikkelpungen huden horisontalt. For å opprettholde vev integritet gjennom hele forsøket, ble forvarmet buffer superfused over operasjonsområdet.
- Trykk på den nedre del av magen med en forcep og trekk forsiktig ut en testikkel med den andre forcep.
- Fjern de omkringliggende bindevev rundt testiklene.
- Incise den cremaster muskel vertikalt og flat muskel over et glass dekkglass på en intravital mikroskop skuffen ved å feste periferien.
- Tillate 10-20 min for muskelen å stabilisere før datainnsamlingen. Cremaster muskel arterioler (for trombedannelse) og venules (for vaskulær inflammasjon) med en diameter på 30-45 mikrometer ble valgt for vår studie.
- For å opprettholde bedøvende betingelser, tilfører 30-50 ml av den samme bedøvelse omtrent hvert 30 min gjennom jugular cannulus.
- Etter plassering av musen på intravital mikroskop, åpen SlideBook 5.0-programvaren og klikk på "Focus Window" på menylinjen for å angi riktige optikk og objektiv (60X).
- Infuser Dylight 488-konjugert anti-mus rotte CD42c (0,1 ug / g BW i 100 pl fysiologisk saltvann) og Alexa Fluor 647-konjugert anti-mus rotte Gr-1-antistoffer (0,05 ug / g BW i 100 pl fysiologisk saltvann) gjennom en jugular cannulus .
- Gå til menylinjen, og klikk på "Image Capture" i verktøylinjen.
- En ny meny kommer opp, I "Image", velg "Bin Factor" som 1x1 og velg "640" på bredde og "460" på høyden.
- I "Filter Set", merk av i boksen for de kanalene du ønsker å avdekke og sette eksponeringstiden for hver. For eksempel åpen kanal: 10 msek FITC kanal: 50 msek, og Cy5 kanal: 50 millisekunder.
- Velg "Time-Lapse Capture" for å justere antall tidspunkter og intervaller. For betennelse modell, er antall tidspunkter satt til 1000-1500 med et intervall på 200 ms (Totalt medgått tid: 5 min).
- Klikk på "Test" for å se en enkelt-plan bilde på det angitte eksponeringstid for den kanalen. Justere eksponering tid og / eller mikroskop lys til histogrammet viser en tilstrekkelig intensitet fordeling (For flerkanals fangst, gjenta denne prosessen for hver kanal).
- Når alle parametrene er satt (kanaler, eksponering ganger, og så videre) i "Image Capture", velg "Start" for å starte fangst.
- Overvåke rullende og tilhenger blodplater og nøytrofile for 5 min i den øverste halvdelen av en betent cremaster venule i vaskulær inflammasjon modell. Åtte til ti forskjellige venules føres i en mus.
- Bildene ble tatt ved hjelp av en total forstørrelse på 60x (1,0 NA nedsenking i vann objektiv) gir en vindusstørrelse av 157 mikrometer x 118 mikrometer.
- Ved gjennomføring av forsøket, ble musene avlives via cervical dislocation.
4. Dataanalyse for Venular Betennelse Model
- Åpne SlideBook 5.0-programvaren og klikk "Folder" på menylinjen for å åpne en fil.
- Klikk på drop-down kanal menyen og velg "Åpne, FITC, Cy5, etc."
- Klikk "Renormalize (røde og grønne søyler)" og velge kanal. Dra de røde og grønne linjene til venstre eller høyre for å grovt optimalisere fluorescens signal.
- Klikk på "Apply" og "OK" for å oppdatere bildet.
- Klikk "Thumbnail" knappen for å velge gjeldende visningen som standard.
- Spill fanget timelapse bilde, og telle rullende og tilhenger nøytrofile under 5 min periode.
- Å analysere blodplater trombedannelse, gå til "Mask" og velg "Create".
- Navngi en maske og mark "I dagens bilde".
- Klikk på "Large blyantikonet" i "Marquee Tool" i hovedvinduet.
- Farge en region utenfor fartøyet i hovedvisningen for å angi en bakgrunn maske.
- Gå to "Mask", klikk "Kopier dette flyet", klikk "Kopier maske i gjeldende endepunktet" og velg "Alle tidspunkter", og klikk "OK".
- For å beregne bakgrunn signal, gå til "Statistikk" og klikk "Mask statistikk".
- Klikk på "Current 2D Time Lapse eller 4D Image (s)" i Image Scope, og velg "Hele Mask" i Mask Scope. I Egenskaper, velg "medgått tid (hh: mm: ms)" under Dato av Capture, velg "Area (piksler)" under morfometri, velg "maksimal intensitet" under Intensity, og klikk "Export" (Denne statistikken metoden tillater oss å beregne auto-fluorescensintensitet (bakgrunn signal)).
- Åpne tekstfilen i MS Office Excel og beregne den gjennomsnittlige verdien av bakgrunnen signal gjennom opptaksperioden. Dette er bakgrunnen fluorescensintensiteten.
- Å bestemme trombe intensitet, klikk på "Large blyantikon" igjen i "Marquee Tool" i hovedvinduet.
- Fargen i skipet i hovedvinduet for å sette blodplater signal.
- Gå til "Mask", klikk "Kopier dette flyet", klikk "Kopier maske i dagens endepunktet", velg "Alle tidspunkter", og klikk "OK".
- Gå til "Statistikk" og klikk "Mask statistikk".
- Klikk på "Current 2D Time Lapse eller 4D Image (s)" i Image Scope, og velg "Hele Mask" i Mask Scope. I Egenskaper, velg "medgått tid (hh: mm: ms)" under Dato av Capture, velg "Area (piksler)" under morfometri, velg "Sum Intensitet" under Intensity, og klikk "Export" (Denne statistikken metoden tillate oss å beregne fluorescensintensiteten inne i beholderen).
- Åpne tekstfilen i MS Office Excel. Fluorescens signalet av blodplater beregnes ved å subtrahere den gjennomsnittlige verdien av bakgrunnen intensitet x areale (piksel) fra summen intensiteten av innsiden av beholderen. Dette er fluorescensintensiteten av blodplate trombe.
- Gjenta dette i 30 forskjellige venules 3-5 forskjellige mus. Deretter beregner medianverdi av fluorescensintensiteten av blodplater.
- Tilanalysere nøytrofile rullende og heft, ble rullende tilstrømning av nøytrofile bestemt over 5 min i hver venule og presenteres som celle tall per minutt. Antallet tilhenger nøytrofile som var stille i> 30 sek og sakte krabbet (<10 mikrometer over 30 sek), men ikke rulle over, ble talt opp og presentert som celle tall per 5 min.
5. Intravital Mikroskopi for laser-indusert arteriolar Trombose
5-1 Kalibrering av ablasjon laser
- Plasser en speilet lysbilde på mikroskop scenen, påfør en liten dråpe av destillert vann til toppen av lysbildet, og justere intensiteten og fokusere ved hjelp av okularet.
- Åpne "Focus Window" og velg "FRAP"-kategorien i SlideBook 5.0-programvaren.
- Still laser effekt ved 40-50, og satt både "dobbeltklikk repetisjoner" og "Dobbelklikk størrelse" til 8. Merke på "Guide" for å få opp et sett med trådkorset.
- Velg "Arrow"-ikonet fra oppgavelinjen on øverst på skjermbildet.
- Under "FRAP Alignment" klikker "Fire neste". En liten flekk skal vises nær nedre venstre hjørne på skjermen. Når flekken vises, dobbeltklikker du på midten av det. Når klikket, bør et annet sted vises over og til høyre for den første plassen, dobbeltklikk på den. Gjenta dette for 16 poeng (det 16. punktet vil vises i nedre høyre hjørne.) Klikk "Lagre" når du er ferdig å oppdatere kalibreringsparametrene.
- For å teste nøyaktigheten av kalibreringen, klikk på "Center"-knappen, en liten flekk skal vises i midten av skjermen. Hvis ikke, gjenta kalibreringen til ønsket nøyaktighet oppnås.
5-2 laser-indusert arteriolar trombedannelse
- Plasser en bedøvet mus (se fremgangsmåten av 2-2 til 2-12) på mikroskopet scenen.
- Under "Capture"-vinduet, velg en protokoll eller opprette en ny. Innstillingene er som følger: Cy5 (70 msek eksponering), Open (10 MSEc eksponering) og FITC (50 msek eksponering). Bildet er tatt over 20 min (ca 2400 tidspunkter med et intervall tid på 500 msek).
- Infuser Dylight 488-konjugert anti-mus CD42c og Alexa Fluor 647-konjugert anti-mus GR-1 antistoffer som beskrevet ovenfor.
- Optimaliser mikroskop parametere inkludert fluorescensintensitet og mørkefelt bilde som beskrevet i 3-3 til 3-7.
- Klikk på "Test"-knappen for å sikre riktig lysfelt intensitet eller antistoff signal, arteriole plassering og fokus.
- Klikk "Start" for å starte bildeopptak prosessen.
- Før avfyring ablasjon laser, sørg for at musepekeren ikonet har blitt valgt og at åreveggen er i klart fokus.
- Å fyre av laser, dobbeltklikk på et sted 2-3 mikrometer internt fra åreveggen. Skade i arteriolar endotelceller forårsaker en visuell form endring som skal bli synlig i lysfelt bildet, etterfulgt av blodplate akkumulering. Monitor trombeformasjon i 5 min etter laser skade.
- Fem minutter etter laser skade (tromben størrelse bør nå være stabil) pause og avbryte opptaket. Deretter starter en fange med 2400 tidspunkter med en 500 msek intervall for å spille tilhenger blodplater og rullende / tilhenger nøytrofile for 20 min. Tre til fem arterioler er spilt inn med en mus.
- Ved gjennomføring av forsøket, ble musene avlives via cervical forvridning.
6. Dataanalyse for arteriolar Trombose Model
- Gå over trinn 4,1 gjennom 4.5.
- For å få den bakgrunnsfluorescens intensitet under blodplater trombedannelse, gå over trinn 4,7 gjennom 4.14.
- Gå til "Mask", klikk på "Segment", velg FITC i kanal, og sette den gjennomsnittlige verdien av bakgrunnen signal på Low. Klikk på "Apply" og "OK".
- Å analysere fluorescensintensiteten av blodplate tromben (Dylight 488-konjugert anti-CD42c antistoff),
- Å kvantifisere de rullende og tilhenger nøytrofile, spille timelapse og telle antall celler som synlig rulle over de blodplater trombe over 20 min. Rolling er definert som en reduksjon i nøytrofil hastighet mens samarbeidsstil blodplate tromben for minst 2 sek. Adherente nøytrofiler menes alle nøytrofiler som forblir festet til blodplate trombe for minst 2 min. Antallet rullende og tilhenger nøytrofile ble presentert som celle tall pr 20 min. Rolling hastighet ble beregnet ved hjelp av en partikkel system for sporing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av en detaljert intravital mikroskopi analyse, var heterotypic blodplatelignende nøytrofile interaksjoner på aktiverte endothelium visualiseres ved infusjon av fluorescently-merkede antistoffer mot en blodplater (CD42c) eller nøytrofile markør (Gr-1) i levende mus.
I en modell av TNF-α-indusert venular inflammasjon, ble de fleste rullende nøytrofile stabilt festet til endotelet formodentlig ved interaksjon av aktiverte β2 integriner med ICAM-1 under opptaket perioden (3 til 4,5 timer etter injeksjon av TNF-α, figur 2A ). 8 rulle og adherente nøytrofiler var allerede tilstede før videooverføring begynte grunnet TNF-α indusert endotelcelle aktivering. Antallet rullende og vedheftende nøytrofile i opphisset endotelceller var 0,25 ± 0,05 celler per minutt og 18,5 ± 0,7 celler pr 5 min, henholdsvis (figur 2B og 2C). De fleste nøytrofile ble overholdt than aktivert endotelet for varigheten av videoopptak (1 til 1,5 timer), og det var bare en minimal reduksjon i adherente celler sammen med en minimal økning i bølgende celler (data ikke vist). Vi fant at de fleste blodplater holder seg til tilhenger og krypende nøytrofile stedet for betent åreveggen (Figur 2A, Video 1). Blodplater tromber akkumulert og embolized gjentatte ganger for varigheten av videoopptak. Den integrerte fluorescens signalet knyttet adherente blodplater ble vist i figur 2D.
Utnytte laser-indusert arteriolar trombose modell, var vi i stand til å undersøke og karakterisere heterotypic samspill av blodplater og nøytrofile på stedet av arteriolar vegg skade. I denne modellen, tromben størrelsen toppet seg rundt 100 sek etter laser skaden, etterfulgt av en serie av rask liten embolisering for neste 2-3 min (data ikke vist). 9,10 Fem minutter etter laser personskade, størrelsen av blodplate thrombus holdt seg relativt konstant under avbildning (5-25 min etter laser skade, Tall 3A-3C) og nøytrofile kastes på og overholdt blodplater trombe (Tall 3A-3B, Video 2). Fluorescens-signalet fra de sirkulerende blodplatene var ubetydelig i sammenligning med det fra blodplate trombe. Antallet rullende og tilhenger nøytrofile var 21,5 ± 3,0 og 1,6 ± 0,4 celler over 20 min, henholdsvis (Tall 3D-3E). Initiell rask rullende av nøytrofiler oppstod på endotelceller. Når neutrofiler kontaktet blodplate trombe, rullende hastighet av nøytrofile på et blodplate trombe endret med en rekkevidde på 8,2 ± 1,1 um per sekund (figur 3F), som er mediert av interaksjon av P-selektin og PSGL-1. 11
Figur 1.Skjematisk av intravital mikroskop system (A) og utarbeidelse av cremaster muskel microvessel (B).
Figur 2. Heterotypic interaksjoner av blodplater og nøytrofile under TNF-α-indusert venular inflammasjon i levende mus. Blodplater og nøytrofile ble oppdaget av Dylight 488-konjugert anti-mus CD42c og Alexa Fluor 647-konjugert anti-mus Gr-1-antistoffer, henholdsvis. ( A) Representant binarized bilder av utseendet på fluorescens signaler forbundet med nøytrofile (rød) og blodplater (grønn) over 180 sek. Pil viser retningen av blodstrømmen. Bar = 10 uM. (BC) Antallet av rullende (celler / minutt) og adherente neutrofiler (celler / 5 min) for betente endotelceller vises. Data representerer middelverdien ± SEM av 30 different venules i 4 villtype mus. (D) Median integrert fluorescens signalet av blodplater (F trombocytter) er plottet som en funksjon av tiden. Ingen signal ble oppdaget med Dylight 488-konjugert kontroll rotte IgG (data ikke vist).
Figur 3. Heterotypic interaksjon av neutrofiler med en blodplate trombe på stedet av laser-indusert arteriolar skade i levende mus. Blodplater og nøytrofile ble detektert som beskrevet i figur 2.. (A) et enkelt nøytrofile (rød, en gul pil) ruller over blodplate trombe (grønn), mens en andre nøytrofile (rød, en hvit pil) hurtig ruller over arteriolar endotelceller, vist over 5 sek. (b) én nøytrofile (rød) rulle over og fester seg til en blodplate trombe (grønn) vist over 15 sek . Pilspiss viser rullende og tilhenger neutrophils. Bar = 10 mikrometer. Den tykke, grå pilen viser retningen av blodstrømmen. (C) Median integrert fluorescens signalet av blodplater (F trombocytter) er plottet som en funksjon av tiden. (DE) Antallet rullende og vedheftende nøytrofiler på blodplate tromben vises (cells/20 min). (F) rullende hastighet av nøytrofile over blodplater trombe. Data representerer middelverdien ± SEM av 14 tromber i 5 villtype mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokoll for real-time fluorescens intravital mikroskop for å visualisere heterotypic blodplatelignende nøytrofile interaksjoner på aktivert endotel under vaskulær inflammasjon og trombose. Tidligere ble lignende fluorescens mikroskopiske tilnærminger rapportert å studere molekylære mekanismen for trombedannelse og vaskulær inflammasjon. 8,12 Siden heterotypic celle-celle interaksjon kan være viktig for vaso-okklusjon på skadestedet, vil denne teknologien være et verdifullt verktøy for studere cellulære og molekylære mekanismer for vaskulær sykdom. Fordelen med real-time imaging teknologi er å overvåke umiddelbare og senere interaksjoner intravaskulære celler på aktiveres / skadet endotel henhold inflammatoriske og trombotisk forhold. Videre kan vår mikroskopiske system brukes i å studere heterotypic interaksjoner mellom sirkulerende tumorceller og endotelceller eller blodceller ved hjelp fluorescently-merket tumorceller eller antistoffer mot tumorcellelinjer markører som human epitelcelleopprinnelse adhesjonsmolekyl (EpCAM). 13,14 stedet for å bruke fluorescently-merkede antistoffer, kan dette mikroskopi også utføres med transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i en bestemt celletype som CD41-EYFP + megakaryocytter. 15
Bruke intensiteten fluorescently-merkede antistoffer, kan vi fastslå kinetikken av blodplater trombedannelse og molekylær uttrykk på aktiverte intravaskulære cellene etter fartøy skade. Men de fleste antistoffer som brukes i denne hensikt hemme antigen funksjon som kan føre til uventede resultater. Derfor bør eksperimentet utføres med spesiell omsorg for å optimalisere konsentrasjonen der antistoffet gir tilstrekkelig fluorescens signal ved binding dens til antigenet uten å påvirke antigen-funksjonen. I tillegg er en annen antistoffspesifisitet issue. Det er kjent at subpopulasjoner av dendrittiske celler og monocytter uttrykker lave nivåer av Gr-1. 16
Likevel, har vi funnet at monocytter er bare 3-5% av rullende leukocytter under akutt inflammasjon og trombedannelse, som bestemmes av en fluorescensmerket antistoff mot mus F4/80 som uttrykkes utelukkende i monocytter og dendrittiske celler (data ikke vist). Derfor er de fleste rullende og vedheftende leukocytter under TNF-α indusert venular inflammasjon og laser-indusert arteriolære trombose ville være nøytrofiler.
I denne rapporten har vi brukt to mus modeller av vaskulær sykdom. Selv om vi forstår at ingen dyremodell kan rekapitulere menneskelige sykdomstilstander, gjennomførte arbeidet i microvessels av levende mus bruker denne teknologien vil ha en direkte relevans til sykdom hos mennesker og vil være lett å oversette til bedre behandling av trombo-inflammatoriske sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Institutes of Health (P30 HL101302 og RO1 HL109439 til JC) og American Heart Association (SDG 5270005 til JC). A. Barazia ble støttet av en T32HL007829 NIH trening stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
