Summary
痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。
Abstract
皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発3の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。
現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3DイメージングはさらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。
Introduction
現在のところ、それは小さなファイバ神経障害、3つ6-8を診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘9 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡6 PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリアらはPN、侵害受容性マーカー10との共同標識PGP陽性IENFを研究する二重標識法を適用した。我々の以前の研究では、我々はTrkの陽性IENFを実証しなく、Trkの陰性IENF、痛みを伴う糖尿病性神経障害5の動物モデルにおいてアップレギュレートされた。この共同標識法はIENFDとPNに関連付けられている形態学的変化を研究する能力を合計する侵害受容IENFDの定量化を比較する機能を提供します。侵害受容IENFとコンパを可視化する機能侵害IENFDにIENFD合計の定量化を再度客観的疼痛の存在の証拠、そしておそらくPNに伴う痛みの重症度に関する洞察を提供することができます。また、この手法は、動物モデルの皮膚に適用可能である。以前の研究と比較して、現在のプロトコルは、2D画像解析で発生するエラーを回避する機会を作成し、3次元画像解析のための方法が記載されている。
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Protocol
パート：免疫組織化学
バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クライオスタットに厚さ50μmのセクションに区分に埋め込まれ、最大1週間のために4で20％グリセロール°Cとリン酸緩衝食塩水（PBS）で凍結保護されています。以下に説明するプロトコルは、8皮膚切片ワン96ウェルプレートに浮遊免疫組織化学を受けることが可能な皮膚切片の最大数に設計されている。
1日目：
1。角質層非特異免疫反応の防止
- ラベル96ウェルプレート、 図1に示すように。 画像-IT 96ウェルプレートの1行目の各ウェルにバックグラウンド染色11,12を遮断するための効果的なFX信号（画像-IT）、150μlのを追加します。
- 96ウェルプレートの2行目と3で各ウェルに1×PBSを150μlを加える。
- DLで撮影生から1セクション、PTで取ら生から1セクション：患者ごとに2つの50μmのセクションを取得します。接種ループ（LeLoop）は形態的損傷を避けるために、次へのすすぎ1からセクションを転送するために使用されます。そっと画像-ITを含む、よく行1の個体に、接種ループを使用して、各50μmのセクションを転送します。フラットロッカーで室温で30分間画像-ITのセクションをインキュベートする。
- 室温で10分間1X PBS（行2と3）で2回のセクションをすすぐ。リンスの間にフラットロッカーにウェルプレートを置きます。
2。 5％BSAブロッキング溶液と1％のリンス液の調製
- 生検のセクションでは、画像-ITでインキュベートされていますが、ソリューションをブロック5％を準備る（5％BSAが完全に溶解するまでBSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦溶液）。
- 4行目の各ウェルに5％BSAブロッキング溶液150μlのを追加します。
- 接種ループを使用して、5％BSAブロッキング溶液の個々のウェル内にセクションを転送します。フラットロッカーで室温で1〜2時間で5％BSAブロッキング溶液内のセクションをインキュベートする。
3。一次抗体の1％BSAリンス液と希釈の調製
- のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液（1％BSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦解をBSAが完全に溶解するまで）をご用意。
- のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液に一次抗体を希釈。
- 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。一次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。
- 一次抗体の希釈：PGP、1:500; TrkのA、1％BSAリンス液で1:500。
4。一次抗体に区画検のインキュベーション
- 96ウェルプレート（5行目）の指定されたウェルに希釈した一次抗体を150μlを加える。
- 指定されたプライマリ抗体井戸（5行目）に5％ブロッキング溶液（行4）からセクションを転送します。
- 乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。
- フラットロッカーで96ウェルプレート4でO / N°Cをインキュベートする。
2日目：
5。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ
- 各行6でよく、図7、図8に1％BSAリンス液を150μlを加える。
- RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列6,7、および8）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。
6。二次抗体の希釈
<OL>- 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。二次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。
- 二次抗体の希釈液：1％BSAリンス液でTrkのA（アレクサフルーア647ロバ抗ヤギ、1:250）のためのPGP（アレクサフルーア488ロバ抗ウサギ、1:250）、のために。
7。二次抗体に区画検のインキュベーション
- 96ウェルプレート（行9）の彼らの指定ウェルに希釈した二次抗体を150μlを加える。
- よく二次抗体に1％BSAブロッキング溶液（行8）（行9）からセクションを転送します。
- 乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。
- 指定した二次抗体Oのセクションをインキュベート4℃/ N°フラットロッカー上のC。
8。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ
- 行10,11、および12の各ウェルに1％BSAリンス液を150μlを加える。
- RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列10,11、および12）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。
9。顕微鏡スライドとマウント区分検の準備
- 生検のセクションでは、1％BSAリンス液（行12）の最後のすすぎにインキュベートされていますが、顕微鏡スライドを準備します。
- 一度スライドに1％BSAすすぎ溶液50μlを置きます。
- 1％BSAリンス液（行12）からセクションを削除し、指定した顕微鏡スライド上の1％BSAリンス液50μlのドロップに配置します。セクションの位置を最適化した後、対策を講じて、球根のガラスピペットで余分な1％BSAリンス液を除去標本に触れないように。
注：セクションが折り返されていないことを確認し、試料が顕微鏡スライドの表面に平らにする必要があります。
- 顕微鏡スライド上に生の近くにDAPIでゴールド退色マウンティング試薬を延長の代わりに1滴。 22x22のmmの顕微鏡カバーガラスを取り、優しく生と延長のドロップDAPIドロップゴールド退色防止剤の上に置きます。各セクションごとに繰り返します。
- 暗闇の中で室温でO / N顕微鏡スライドが乾燥しましょう。
注：ピペットチップを使用して、任意の気泡を取り除きます。 Gold退色防止試薬を延長過剰拭き取り。
パートB：共焦点イメージング
10。共焦点像
- FluoViewバージョン5.0ソフトウェアと40X油浸（1.3 NA）客観的かつズームで2回共焦点顕微鏡オリンパスFluoView 500レーザーを使用して画像蛍光シグナル。 それぞれ543 nmのヘリウムネオングリーンレーザーと633 nmのヘリウムネオン赤色レーザーを励起するためにアレクサフルーア488とアレクサフルーア647を使用してください。アレクサフルーア488信号が赤LUTによって緑見上げるテーブル（LUT）とアレクサフルーア647で表されます。
- 信号を強化するためには400μmで、各検出器のための共焦点開口部を設定します。シーケンシャルスキャンは1,024×信号分離を最大化するために1,024の解像度で撮影する必要があります。
- カルマンアベレージ（2フレーム）と1.2μmのZステップの間隔（FluoViewソフトウェアによって計算された最適なスキャンユニットに基づく）を使用して三次元のZシリーズをキャプチャします。
パートC：三次元可視化とアニメーション
11。 3次元（3D）可視化とアニメーション
- 3D画像セットを可視化するImaris x64のソフトウェアで開くFluoviewファイル（バージョン7.3、ビットプレンAG）。
- として神経特定の信号のコントラストを向上させるために必要な表示に調整します。
- suコマンドを作成します。真皮表皮境界を可視化するためにデータポート。境界線を描画する描画モードで等高線ツールを使用します。
- 基礎蛍光シグナルを見るために境界に半透明な表面を割り当てます。
- 3D映画のスナップショットイメージを作成するために、3D蛍光シグナルの静止画をキャプチャします。
- 3D映画を作成するためにアニメーション機能を使用します。画像（ 図2、図3、及び図4）別々にマージされた各信号を表示するために360度を数回回転させることができる。毎秒15フレームでアニメーション化された200のフレームで構成されるムービーを作成するためにアニメーションを設定します。生のAVIファイルとして各ムービーを保存します。
- VirtualDubのソフトウェア（バージョン1.9.4）で最終AVIムービーを圧縮します。
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Representative Results
私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を持つ66歳の男性、2型糖尿病（：;疼痛スコア108ヶ月47期間）の。定量的な官能試験及び神経伝導研究を含む神経学的検査履歴とは、末梢神経障害を評価するために実施した。疼痛スコアは、0〜100のビジュアルアナログ痛みのスケールに基づいて決定した。
このプロトコルを使用して、我々は、ヒトの皮膚におけるIENFs（ 図2）の3次元構造を研究することができる。 図2の図3）で軸索の腫脹を研究するために使用することができる。 図3に示す軸索の腫脹の3D画像は、これらの腫れがIENFsに沿って分布球状構造体であることを示している。さらに、これらの方法はIENFs（ 図4）の分岐研究するために用いることができる。 図4に示す分岐の3D画像は、形態学的変化は、PNの存在と場所を取ることを示している。前述したように、真皮-表皮境界は形態および配向神経及び真皮と表皮の間に8画素強度差に基づいて決定された。青図2、図3に示すようにトレース、 および4、真皮表皮接合部を示している。
図1。皮膚生検免疫組織化学のための96ウェルプレートのセットアップを示す模式図である。
図2。 IENFの三次元（3D）画像。合計IENFを表すグリーンラベル（A）PGP陽性IENF、、（最初の360°回転）の代表的な3D画像と侵害受容IENF（1秒360°回転）を表す赤、ラベル（B）Trkの陽性IENF、および（C ）ケース1から皮膚サンプルでPGP陽性、侵害受容IENFを（第3 360°回転）実証合成画像。バー=20μmである。 ムービーを表示するにはここをクリックしてください。
図3。 PNのIENFにおける軸索腫脹の3次元（3D）画像。ケース2から皮膚サンプルで緑信号とPGPにより標識IENFsに沿って軸索の腫脹（矢じり）、、のと皮下神経叢内の代表的な3D画像。バー=10μmである。 ムービーを表示するにはここをクリックしてください。
図4。 PNのIENFの分岐軸索の三次元（3D）画像。ケース3から皮膚サンプルでは、緑色の信号とPGPにより標識IENFsに沿って軸索の分岐（矢じり）の代表的な3D画像、。バー=20μmである。 ムービーを表示するにはここをクリックしてください。
| 5％BSAブロッキングソリューションのコンポーネント： | 12.5ミリリットルのために必要な量 |
| 1X PBS | 8.125ミリリットル |
| 0.1％トリトンX-100（TX-100）[最終濃度：0.03％] | 3.75ミリリットル |
| ウシ血清アルブミン（BSA） | 0.625グラム |
| 合計 | 12.5ミリリットル |
表1。 5％BSA、ソリューションをブロック。
| 1％のリンス液のコンポーネント： | 12ミリリットルのために必要な量 |
| 1X PBS | 8.625ミリリットル |
| 0.1％TX-100 [最終濃度：0.03％] | 3.25ミリリットル |
| ウシ血清アルブミン（BSA） | 0.125グラム |
| 合計 | 12ミリリットル |
表2。 1％BSAは、ソリューションをブロック。
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Discussion
IENFDの測定は広く末梢神経障害13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN 15の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。
我々は以前侵害IENFD数の増加は、DB / dbマウスにおける疼痛行動、2型糖尿病5のマウスモデルに関連付けられていることを報告した。そのレポートでは、まず侵害IENFを研究するための二重免疫蛍光プロトコルを適用した。現在の研究では、PNの患者から、ヒトの皮膚への我々のプロトコルを展開します。二重免疫蛍光分析は、仲介IENFsのサブセットで、合計IENF及び侵害IENF両方の測定値を提供します痛み。これらの侵害IENFはTrkのAや他の侵害受容神経ペプチド5のために主に陽性である。痛みを伴う神経障害のために類似した二重免疫蛍光分析はラウリアら10によって記載されている。彼らは、報告された痛みを伴う神経障害を有する患者において一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーV部材1（TRPV1）のためIENFD減少。現在のプロトコルでは、我々の動物のデータ5に基づいて侵害IENFDを測定するための代替的アプローチを提供することができます。
現在のプロトコルはIENF構造を研究するための3次元的なアプローチを提供しています。ダブルimmunofluorecent分析と組み合わせることで、現在のプロトコルは、侵害受容IENFsの形態を調べるためのメソッドを提供します。これまでの研究では、密度との関連を報告したり、PNと侵害受容IENFの分岐していない。ここでは、人間の皮膚のIENFsの分岐や腫れ軸索研究するためのプロトコルを示しています。当社の3D分析は、このmのことを示唆しているethodはPNでIENFの形態学的変化を研究するために使用することができる。また、3D画像は、2Dイメージングに関連付けられている構造を重複の減少可視化に関連するエラーを回避することによってIENFD測定の現在のプロトコルを向上させることができます。
軸索の膨潤は、元の軸索の口径16の二度よりも大きな直径を有する軸索部の拡大として定義される。この構造は、軸索の細胞骨格と軸索輸送のコンポーネントの断片が含まれています。軸索の腫脹は、軸索神経障害6,16,17の初期の特徴と考えられている。しかし、軸索の膨潤構造の3次元解析は、文献に報告されていない。 図3に示すように、3次元イメージングはPNに関連付けられた軸索の膨潤のために重要な洞察を提供することができる。
それはよく軸索分岐が神経損傷18からの回復を伴うことを特徴としている。しかし、軸索の分岐を定量化するための利用可能な方法論はまだ2Dの画像に基づいて制限されています。 図4で説明したように、軸索の分岐が再生神経の曲がりくねった性質によって複雑にすることができる。従って、分岐点は、定量の正確さに影響を与える周辺の神経線維によって隠さすることができる。我々のプロトコルの3次元画像解析、分岐神経の詳細については、改善された可視化を提供します。
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Disclosures
宣言するために特別の利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、健康補助K08 NS061039-01A2の国立研究所、ミシガン大学の神経学研究·ディスカバリー、およびA.アルフレッド·トーブマン医学研究所のためのプログラムによってサポートされていました。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P90 DK-20572の国立研究所によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析コアを使用していました。著者らは、侵害受容性バイオマーカーの免疫組織化学技術の初期開発をサポートするために、人間の皮膚のサンプルの彼らの寛大な寄付のためにロビンソンシングルトンとゴードン·スミス（ユタ大学）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
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