Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana
Summary
A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.
Abstract
Uma biópsia da pele é geralmente utilizado para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) para o diagnóstico de 1,2 polineuropatia periférica. Actualmente, é prática comum para recolher três milímetros biópsias de pele a partir da perna distal (DL) e na coxa proximal (PT) para a avaliação de polineuropatias comprimento dependentes 3. No entanto, devido à natureza de IENFs multidireccional, é um desafio para examinar sobreposição estruturas nervosas através da análise de imagem bidimensional (2D). Alternativamente, tridimensional de imagem (3D) poderia fornecer a melhor solução para este dilema.
No relatório atual, apresentamos métodos para aplicar imagens em 3D para estudar neuropatia dolorosa (PN). A fim de identificar IENFs, amostras de pele são processadas para análise de imunofluorescência de produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal panela. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada por imuno-histoquímica PGP usando microscopia de campo claro 4. No presente estudo, aplicou-se análise de imunofluorescência dupla para identificar IENFD total, utilizando o PGP, e IENF nociceptiva, através da utilização de anticorpos que reconhecem a tropomiosina-receptor-quinase A (Trk A), o receptor de alta afinidade para o factor de crescimento do nervo 5. As vantagens do IENF co-coloração com PGP e Trk anticorpos se beneficia do estudo de PN através da coloração claramente fibras PGP-positivas, nociceptivos. Estes sinais de fluorescência pode ser quantificada para determinar as alterações morfológicas e IENFD nociceptivos do IENF associados PN. As imagens fluorescentes são obtidas por microscopia confocal e processadas para análise 3D. 3D-imaging fornece capacidades de rotação para analisar mais alterações morfológicas associadas à PN. Tomados em conjunto, co-coloração fluorescente, imagem confocal e análise 3D beneficiar claramente o estudo de PN.
Introduction
Actualmente, é prática comum para os médicos para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) a partir de biópsias de punção da pele, que podem ser utilizados para diagnosticar neuropatias pequenas fibras 3, 6-8. As biópsias são tomadas a partir da perna distal (DL), de 10 cm acima do maléolo lateral, e a coxa proximal (PT), 20 cm abaixo da espinha ilíaca anterior 9. Todos IENF são rotulados usando o produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal pan 10-12. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada pela coloração PGP com brightfield microscopia 6. Além disso, vários grupos de pesquisa têm utilizaram protocolos de imunofluorescência para o PGP imunohistoquímica 7-9. Neuropatia fibra pequeno é comumente associado com dor neuropática. A fim de entender melhor o papel do IENF essencial para o processamento da dor, foi desenvolvida uma técnica para co-label IENF total, com fibras que geram dor. Nociceptiva IENF, especificamente Aδ e fibras C, pode ser estudada através da co-rotulagem de IENF com PGP e o marcador nociceptiva, tropomyosin-receptor-quinase A (Trk A) 5. Trk A é o receptor de elevada afinidade para o factor de crescimento do nervo, que é essencial para o desenvolvimento de nocicepção. As fibras nervosas nociceptivas A positivas Trk são fibras peptidérgicas que expressam a substância P (SP) e peptídeo relacionado com gene da calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria e colegas aplicaram a técnica de dupla marcação para estudar PN, co-rotulagem IENF PGP positivo com um marcador nociceptivo 10. No nosso estudo anterior, foi demonstrado que IENF Trk A-positivos, mas não IENF Trk A-negativos, foram regulada positivamente num modelo animal de neuropatia diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-rotulagem fornece a capacidade de comparar a quantificação de IENFD nociceptiva totalizar IENFD ea capacidade de estudar alterações morfológicas associadas à PN. A capacidade de visualizar nociceptiva IENF e compare quantificação de IENFD total IENFD nociceptiva poderia fornecer provas objectivas para a presença da dor, e possivelmente percepção da intensidade da dor associada com PN. Esta técnica é também aplicável para a pele de modelos animais. Em comparação com estudos anteriores, o protocolo actual descreve métodos para análise de imagem 3D, criando a possibilidade de evitar os erros que possam ocorrer na análise da imagem 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medição da IENFD tem sido amplamente utilizada para determinar o grau de neuropatias periféricas 13,14. Actualmente, o protocolo mais comumente utilizado apenas mede a densidade de fibras nervosas que penetram na membrana basal da epiderme, e não toma em consideração a ramificação axonal e / ou alterações morfológicas dos nervos. Além disso, a análise IENFD actual não foi mostrado para correlacionar IENFD com a presença de dor no PN 15.
Nós relatamos ant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde K08 NS061039-01A2, o Programa de Neurologia Research & Discovery e The Taubman Alfred A. Instituto de Pesquisa de Medicina da Universidade de Michigan. Este trabalho utilizou a Morfologia e Análise de Imagem Núcleo de Michigan Diabetes Centro de Pesquisa e Formação, financiado pelo National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais. Os autores gostariam de agradecer a Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) pela sua generosa doação de amostras de pele humana para apoiar o desenvolvimento inicial da técnica de imuno-histoquímica biomarcador nociceptiva.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
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