Tredimensionell avbildning av Nociceptiva Intraepidermal nervfibrer i human hud Biopsier
Summary
För att studera de förändringar av nociceptiva intraepidermal nervfibrer (IENFs) i smärtsamma neuropatier (PN), utvecklade vi protokoll som direkt skulle kunna undersöka tredimensionella morfologiska förändringar som observerats i nociceptiva IENFs. Tredimensionell analys av IENFs har potential att utvärdera de morfologiska förändringarna av IENF i PN.
Abstract
En stansbiopsi av huden används ofta för att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfiber (IENFD) för diagnos av perifer polyneuropati 1,2. För närvarande är det vanligt att samla in 3 biopsier mm hud från den distala benet (DL) och den proximala låret (PT) för utvärdering av längd-beroende polyneuropatier 3. Men på grund av den månginriktat natur IENFs, är det svårt att undersöka överlappande nervstrukturer genom analys av tvådimensionella (2D) avbildning. Alternativt kunde tredimensionella (3D) avbildning ge en bättre lösning på detta dilemma.
I den aktuella rapporten presenterar vi metoder för att tillämpa 3D-avbildning för att studera smärtsam neuropati (PN). För att identifiera IENFs är hudprover behandlas för immunofluorescerande analys av protein-genprodukten 9,5 (PGP), en pan neuronal markör. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD avskräckabryts av PGP immunohistokemi med brightfield mikroskopi 4. I den aktuella studien, tillämpade vi dubbel immunofluorescens analys för att identifiera total IENFD, använder PGP, och nociceptiv IENF, genom användning av antikroppar som känner igen tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A), högaffinitetsreceptorn för nervtillväxtfaktor 5. Fördelarna med co-färgning IENF med PGP och Trk A antikroppar gynnar studie av PN genom att tydligt färgning PGP-positiva, nociceptiva fibrer. Dessa fluorescerande signaler kan kvantifieras för att bestämma nociceptiva IENFD och morfologiska förändringar i IENF förknippas med PN. De fluorescerande bilder förvärvas genom konfokalmikroskopi och bearbetas för 3D-analys. 3D-bildbehandling ger roterande förmåga att ytterligare analysera morfologiska förändringar i samband med PN. Sammantaget fluorescerande co-färgning, konfokal avbildning och 3D analys drar bevisligen studiet av PN.
Introduction
För närvarande är det vanligt att läkare att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfibrer, (IENFD) från huden stansbiopsier, som kan användas för att diagnostisera små fibrer neuropati 3, 6-8. Biopsier tas från den distala benet (DL), 10 cm ovanför laterala fotknölen, och den proximala låret (PT), 20 cm under främre iliaca ryggraden 9. Alla IENF är märkta med proteingenprodukt 9,5 (PGP), en pan neuronal markör 10-12. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD bestäms av PGP färgning med brightfield mikroskopi 6. Dessutom har flera forskargrupper använde immunofluorescerande protokoll för PGP immunohistokemi 7-9. Små fibrer neuropati är ofta förknippad med neuropatisk smärta. För att ytterligare förstå rollen av IENF viktigt för smärta bearbetning, utvecklade vi en teknik för att co-label total IENF med fibrer som genererar smärta. Nociceptiv IENF, särskilt Aδ och C-fibrer, kan studeras genom co-märkning av IENF med PGP och nociceptiv markör, tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A) 5. Trk A är den högaffinitetsreceptor för nervtillväxtfaktor som är väsentlig för utvecklingen av nociception. TRK A-positiva nociceptiva nervfibrer är peptiderga fibrer som uttrycker substans P (SP) och kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP). Tidigare gällde Lauria och kollegor dubbel-märkning teknik för att studera PN, co-märkning PGP-positiv IENF med en nociceptiv markör 10. I vår tidigare studie visade vi att Trk A-positiv IENF, men inte Trk A-negativ IENF var uppreglerad vid en djurmodell av smärtsam diabetesneuropati 5. Detta samarbete märkning teknik ger möjlighet att jämföra kvantifiering av nociceptiv IENFD till total IENFD och förmågan att studera morfologiska förändringar i samband med PN. Förmågan att visualisera nociceptiv IENF och bolagenre kvantifiering av total IENFD till nociceptiv IENFD kunde ge objektiva belägg för förekomst av smärta, och möjligen inblick i svårighetsgraden av smärta i samband med PN. Denna teknik är också tillämplig på hud av djurmodeller. I jämförelse med tidigare studier, beskriver det nuvarande protokollet metoder för 3D bildanalys, skapar möjlighet att undvika fel som kan uppstå i 2D bildanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mätning av IENFD har i stor utsträckning använts för att fastställa graden av perifera neuropatier 13,14. För närvarande mäter den vanligaste protokoll som endast tätheter av nervfibrer som penetrerar basalmembranet av överhuden, det tar inte hänsyn till axonal förgrening och / eller morfologiska förändringar i nerver. Dessutom har nuvarande IENFD analysen inte visats korrelera IENFD med förekomsten av smärta i PN 15.
Vi har tidigare rapporterat att ett …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag K08 NS061039-01A2, Programmet för Neurology Research & Discovery, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bildanalys Kärna av Michigan Diabetes Research and Training Center, som finansieras av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 från National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar. Författarna vill tacka Robinson Singleton och Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover för att stödja den inledande utvecklingen av nociceptiv biomarkör immunohistokemi teknik.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
