על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.
ביופסיה של העור משמשת בדרך כלל כדי לכמת את צפיפות סיבי עצב intraepidermal (IENFD) לאבחון של 1,2 פולינאורופתיה ההיקפי. נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ כדי לאסוף 3 מ"מ ביופסיות עור מהרגל דיסטלי (DL) והירך הפרוקסימלי (PT) להערכת polyneuropathies אורך תלויה 3. עם זאת, בשל אופי multidirectional של IENFs, זה מאתגר לבחון חופף מבנים עצביים דרך הניתוח של הדמיה דו ממדית (2D). לחלופין, הדמיה תלת ממדית (3D) יכולה לספק פתרון טוב יותר לדילמה זו.
בדו"ח הנוכחי, אנו מציגים שיטות ליישום 3D הדמיה ללמוד נוירופתיה הכואבת (PN). על מנת לזהות IENFs, דגימות עור מעובדות לניתוח immunofluorescent של מוצר חלבון גן 9.5 (PGP), סמן עצבי מחבת. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD להרתיענכרה על ידי אימונוהיסטוכימיה PGP באמצעות מיקרוסקופיה brightfield 4. במחקר הנוכחי, אנחנו מוחלים ניתוח כפול immunofluorescent לזהות IENFD הכולל, באמצעות PGP, וIENF nociceptive, באמצעות השימוש בנוגדנים המזהים tropomyosin קולט-קינאז, זיקה גבוהה לקולטן (TRK) לגורם גדילה עצבי 5. היתרונות של IENF שיתוף מכתים עם PGP וTRK A נוגדני יתרונות המחקר של PN ידי בבירור מכתים סיבי PGP חיוביים, nociceptive. ניתן לכמת אותות ניאון אלה כדי לקבוע שינויי IENFD ומורפולוגי nociceptive של IENF קשורים PN. את תמונות הניאון נרכשות על ידי מיקרוסקופיה confocal ומעובד לניתוח 3D. 3D הדמיה מספקת יכולות סיבוב נוסף כדי לנתח שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. יחדיו, ניאון שיתוף מכתים, ההדמיה confocal, וניתוח 3D באופן ברור לטובת המחקר של PN.
נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ עבור רופאים לכמת צפיפות סיבי עצב intraepidermal, (IENFD) מביופסיות אגרוף עור, שניתן להשתמש בם כדי לאבחן neuropathies קטן סיבים 3, 6-8. ביופסיות שנלקחו מהרגל דיסטלי (DL), 10 ס"מ מעל malleolus לרוחב, וירך הפרוקסימלי (PT), 20 ס"מ מתחת לעמוד השדרה הכסל הקדמי 9. כל IENF מסומנים באמצעות מוצר גן חלבון 9.5 (PGP), סמן 10-12 מחבת עצבית. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD נקבע על ידי צביעת PGP עם brightfield מיקרוסקופיה 6. בנוסף, מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקולי Immunofluorescent לPGP אימונוהיסטוכימיה 7-9. נוירופתיה סיבים קטנה היא נפוצה הקשורים כאב נוירופתי. על מנת להבין את תפקידו של IENF החיוני לעיבוד כאב נוסף, פיתחנו טכניקה לIENF הכוללת שיתוף תווית עם סיבים שיוצרים כאב. Nociceptive IENF, במיוחד Aδ וסיבי C, ניתן ללמוד דרך שיתוף התיוג של IENF עם PGP וסמן nociceptive, tropomyosin-קולטן קינאז (TRK) 5. TRK הוא זיקה הגבוהה לקולטן לגורם גדילה עצבי שחיוני להתפתחות של Nociception. את סיבי עצב nociceptive חיובי TRK הם סיבים שpeptidergic המפורש חומר P (SP) וקלציטונין גנים הקשורים פפטיד (CGRP). בעבר, Lauria ועמיתיו ליישם את הטכניקה כפולת התיוג ללמוד PN, IENF PGP חיובי שיתוף תיוג עם סמן nociceptive 10. במחקר הקודם שלנו, הוכיח כי IENF TRK-חיובי, אך לא IENF שלילי TRK, שהוגברו במודל חיה של נוירופתיה סוכרתית כואבת 5. טכניקת שיתוף תיוג זה מספקת את היכולת להשוות כימות של IENFD nociceptive לסך IENFD והיכולת ללמוד שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. היכולת לדמיין IENF nociceptive וcompaמחדש כימות של IENFD המוחלטת לIENFD nociceptive יכולה לספק ראיות אובייקטיביות לקיומו של כאב, ואולי תובנה חומרת כאב קשור PN. טכניקה זו היא גם לעור של מודלים של בעלי חיים. בהשוואה למחקרים קודמים, בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לניתוח תמונת 3D, יצירת ההזדמנות להימנע מטעויות שעלולות להתרחש בניתוח תמונת 2D.
מדידה של IENFD כבר בשימוש נרחב על מנת לקבוע את מידת נוירופתיה היקפית 13,14. נכון לעכשיו, הפרוטוקול הנפוץ ביותר מודד רק את הצפיפות של סיבי עצב שחודרים את קרום המרתף של האפידרמיס, זה לא לוקח בחשבון הסתעפות ו / או שינויים מורפולוגיים של העצבים axonal. בנוסף, ניתוח IENFD נוכחי ל…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי K08 NS061039-01A2, התכנית לנוירולוגיה מחקר וגילוי, ואלפרד טאובמן מכון המחקר הרפואי א באוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשה במורפולוגיה וניתוח תמונת הליבה של מחקר מישיגן הסוכרת ומרכז הדרכה, שמומן על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5P90 DK-20572 מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות. המחברים מבקשים להודות לרובינסון וסינגלטון גורדון סמית (אוניברסיטת יוטה) לתרומתם הנדיבה של דגימות עור אנושיות כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של טכניקת אימונוהיסטוכימיה הסמן הביולוגי nociceptive.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |