Tredimensjonal Imaging av nociseptive Intraepidermal nervefibrene i menneskelig hud Biopsi
Summary
For å studere endringer av nociceptive intraepidermal nervefibre (IENFs) i smertefulle nevropatier (PN), utviklet vi protokoller som kan direkte undersøke tredimensjonale morfologiske endringer observert i nociceptive IENFs. Tredimensjonal analyse av IENFs har potensial til å vurdere morfologiske endringer av IENF i PN.
Abstract
En punch biopsi av huden er vanlig å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter (IENFD) for diagnostisering av perifer polynevropati 1,2. I dag er det vanlig praksis å samle inn 3 mm hud biopsier fra den distale benet (DL) og proksimale lår (PT) for evaluering av lengde-avhengige polynevropatier tre. Imidlertid, på grunn av arten av IENFs retninger, er det en utfordring å undersøke overlappende nervestrukturer gjennom analyse av to-dimensjonale (2D) avbildning. Alternativt kan tre-dimensjonale (3D) avbildning gi en bedre løsning på dette dilemma.
I dagens rapport presenterer vi metoder for å bruke 3D avbildning å studere smertefull nevropati (PN). For å identifisere IENFs, blir Hudprøvene behandlet for analyse av immunofluorescent protein genprodukt 9,5 (PGP), et pan neuronal markør. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD avskrekkeminelagt av PGP immunhistokjemi hjelp lysfelt mikroskopi fire. I denne studien, søkte vi dobbelt immunofluorescerende analyse for å identifisere total IENFD, ved hjelp av PGP, og nociceptive IENF, ved bruk av antistoffer som gjenkjenner tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A), høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor 5.. Fordelene med co-flekker IENF med PGP og Trk A-antistoffer fordeler studiet av PN ved klart flekker PGP-positive, nociceptive fiber. Disse fluorescerende signaler kan kvantifiseres å bestemme nociceptive IENFD og morfologiske endringer av IENF forbundet med PN. Fluorescerende bildene er kjøpt av konfokalmikroskopi og behandles for 3D analyse. 3D-avbildning gir rotasjons evner å ytterligere analysere morfologiske endringer knyttet til PN. Til sammen fluorescerende co-flekker, confocal bildebehandling og 3D-analyse tydelig fordel studiet av PN.
Introduction
I dag er det vanlig praksis for leger å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter, (IENFD) fra hud punsj biopsier, som kan brukes til å diagnostisere små fiber nevropati 3, 6-8. Biopsier er tatt fra den distale benet (DL), 10 cm over den laterale malleolus, og den proksimale lår (PT), 20 cm under fremre iliaca ryggraden ni. Alle IENF er merket med protein genproduktet 9.5 (PGP), et pan neuronal markør 10-12. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD bestemt av PGP farging med lysfelt mikroskopi seks. I tillegg har flere forskningsgrupper brukt immunofluorescent protokoller for PGP immunhistokjemi 7-9. Lite fiber nevropati er ofte forbundet med nevropatisk smerte. For ytterligere å forstå den rollen IENF avgjørende for smerte behandling, har vi utviklet en teknikk for å co-label total IENF med fibre som genererer smerte. Nociceptive IENF, spesielt Aδ og C-fibre, kan studeres gjennom co-merking av IENF med PGP og nociceptiv markør, tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A) 5. Trk A er høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor som er essensielt for utvikling av nociception. De Trk A-positive nociceptive nervefibre er peptidergic fibre som uttrykker substans P (SP) og kalsitonin relatert peptid (CGRP). Tidligere brukt Lauria og kolleger dobbel-merking teknikk for å studere PN, co-merking PGP-positive IENF med en nociceptiv markør 10. I vår tidligere studie demonstrerte vi at Trk A-positive, IENF, men ikke Trk A-negativ IENF ble oppregulert ved en dyremodell for smertefull diabetisk nevropati 5.. Dette co-merking teknikken gir mulighet til å sammenligne kvantifisering av nociseptive IENFD til total IENFD og muligheten til å studere morfologiske endringer knyttet til PN. Evnen til å visualisere nociseptive IENF og selskaperRe kvantifisering av total IENFD til nociceptiv IENFD kunne gi objektive bevis for tilstedeværelse av smerte og eventuelt innsikt i alvorlighetsgraden av smerte forbundet med PN. Denne teknikken er også aktuelt for huden dyremodeller. I forhold til tidligere studier, beskriver dagens protokoll metoder for 3D bildeanalyse, skaper muligheten til å unngå feil som kan oppstå i 2D bildeanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Måling av IENFD har vært mye brukt for å fastslå graden av perifere nevropatier 13,14. I dag måler den mest brukte protokollen bare tettheter av nervefibre som penetrerer basalmembranen av epidermis, det tar ikke hensyn aksonal forgrening og / eller morfologiske endringer i nervene. I tillegg har dagens IENFD analyse ikke vist seg å korrelere IENFD med tilstedeværelse av smerte i PN 15.
Vi har tidligere rapportert at økt antall nociseptive IENFD er forbundet med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, Program for Nevrologi Research & Discovery, og The A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte Morfologi og bildeanalyse Kjernen i Michigan Diabetes Research and Training Center, finansiert av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke Robinson Singleton og Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjon av menneskelige huden prøver å støtte den første utviklingen av nociceptiv biomarkør immunhistokjemi teknikk.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
