Summary

Tredimensjonal Imaging av nociseptive Intraepidermal nervefibrene i menneskelig hud Biopsi

Published: April 29, 2013
doi:

Summary

For å studere endringer av nociceptive intraepidermal nervefibre (IENFs) i smertefulle nevropatier (PN), utviklet vi protokoller som kan direkte undersøke tredimensjonale morfologiske endringer observert i nociceptive IENFs. Tredimensjonal analyse av IENFs har potensial til å vurdere morfologiske endringer av IENF i PN.

Abstract

En punch biopsi av huden er vanlig å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter (IENFD) for diagnostisering av perifer polynevropati 1,2. I dag er det vanlig praksis å samle inn 3 mm hud biopsier fra den distale benet (DL) og proksimale lår (PT) for evaluering av lengde-avhengige polynevropatier tre. Imidlertid, på grunn av arten av IENFs retninger, er det en utfordring å undersøke overlappende nervestrukturer gjennom analyse av to-dimensjonale (2D) avbildning. Alternativt kan tre-dimensjonale (3D) avbildning gi en bedre løsning på dette dilemma.

I dagens rapport presenterer vi metoder for å bruke 3D avbildning å studere smertefull nevropati (PN). For å identifisere IENFs, blir Hudprøvene behandlet for analyse av immunofluorescent protein genprodukt 9,5 (PGP), et pan neuronal markør. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD avskrekkeminelagt av PGP immunhistokjemi hjelp lysfelt mikroskopi fire. I denne studien, søkte vi dobbelt immunofluorescerende analyse for å identifisere total IENFD, ved hjelp av PGP, og nociceptive IENF, ved bruk av antistoffer som gjenkjenner tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A), høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor 5.. Fordelene med co-flekker IENF med PGP og Trk A-antistoffer fordeler studiet av PN ved klart flekker PGP-positive, nociceptive fiber. Disse fluorescerende signaler kan kvantifiseres å bestemme nociceptive IENFD og morfologiske endringer av IENF forbundet med PN. Fluorescerende bildene er kjøpt av konfokalmikroskopi og behandles for 3D analyse. 3D-avbildning gir rotasjons evner å ytterligere analysere morfologiske endringer knyttet til PN. Til sammen fluorescerende co-flekker, confocal bildebehandling og 3D-analyse tydelig fordel studiet av PN.

Introduction

I dag er det vanlig praksis for leger å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter, (IENFD) fra hud punsj biopsier, som kan brukes til å diagnostisere små fiber nevropati 3, 6-8. Biopsier er tatt fra den distale benet (DL), 10 cm over den laterale malleolus, og den proksimale lår (PT), 20 cm under fremre iliaca ryggraden ni. Alle IENF er merket med protein genproduktet 9.5 (PGP), et pan neuronal markør 10-12. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD bestemt av PGP farging med lysfelt mikroskopi seks. I tillegg har flere forskningsgrupper brukt immunofluorescent protokoller for PGP immunhistokjemi 7-9. Lite fiber nevropati er ofte forbundet med nevropatisk smerte. For ytterligere å forstå den rollen IENF avgjørende for smerte behandling, har vi utviklet en teknikk for å co-label total IENF med fibre som genererer smerte. Nociceptive IENF, spesielt Aδ og C-fibre, kan studeres gjennom co-merking av IENF med PGP og nociceptiv markør, tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A) 5. Trk A er høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor som er essensielt for utvikling av nociception. De Trk A-positive nociceptive nervefibre er peptidergic fibre som uttrykker substans P (SP) og kalsitonin relatert peptid (CGRP). Tidligere brukt Lauria og kolleger dobbel-merking teknikk for å studere PN, co-merking PGP-positive IENF med en nociceptiv markør 10. I vår tidligere studie demonstrerte vi at Trk A-positive, IENF, men ikke Trk A-negativ IENF ble oppregulert ved en dyremodell for smertefull diabetisk nevropati 5.. Dette co-merking teknikken gir mulighet til å sammenligne kvantifisering av nociseptive IENFD til total IENFD og muligheten til å studere morfologiske endringer knyttet til PN. Evnen til å visualisere nociseptive IENF og selskaperRe kvantifisering av total IENFD til nociceptiv IENFD kunne gi objektive bevis for tilstedeværelse av smerte og eventuelt innsikt i alvorlighetsgraden av smerte forbundet med PN. Denne teknikken er også aktuelt for huden dyremodeller. I forhold til tidligere studier, beskriver dagens protokoll metoder for 3D bildeanalyse, skaper muligheten til å unngå feil som kan oppstå i 2D bildeanalyse.

Protocol

Del A: Immunohistokjemi Fremstilling av 96-brønns plate og forebygging av bakgrunnsfarging Punch hud biopsier er samlet inn fra humane individer og inkubert i 12-24 timer i fikseringsoppløsning (2% paraformaldehyd med 0,75 M L-lysin-løsning (pH 7,4) og 0,05 mM natrium-perjodat) ved 4 ° C som tidligere beskrevet 8.. Prøver blir deretter cryoprotected i fosfatbufret saltvann (PBS) med 20% glycerol ved 4 ° C i opptil en uke, forankret i monterings media optimal skjæring temperatu…

Representative Results

Vi søkte gjeldende protokoll for å studere morfologi IENF i PT og DL hud biopsier fra pasienter med PN. Huden, fra tre personer ble samlet inn ved University of Utah for å demonstrere pathomorphology forbundet med PN. Fagene er: Sak 1: en 51-år gammel mann med en historie med PN av type 2 diabetes (varighet: 14 måneder, smerteskår: 51); Tilfelle 2: en 56-år gammel mann med en historie med PN av type 2 diabetes (varighet: 108 måneder, smerteskår: 47) og sak 3: en 66-år gammel mann med en historie med PN av type…

Discussion

Måling av IENFD har vært mye brukt for å fastslå graden av perifere nevropatier 13,14. I dag måler den mest brukte protokollen bare tettheter av nervefibre som penetrerer basalmembranen av epidermis, det tar ikke hensyn aksonal forgrening og / eller morfologiske endringer i nervene. I tillegg har dagens IENFD analyse ikke vist seg å korrelere IENFD med tilstedeværelse av smerte i PN 15.

Vi har tidligere rapportert at økt antall nociseptive IENFD er forbundet med…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, Program for Nevrologi Research & Discovery, og The A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte Morfologi og bildeanalyse Kjernen i Michigan Diabetes Research and Training Center, finansiert av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke Robinson Singleton og Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjon av menneskelige huden prøver å støtte den første utviklingen av nociceptiv biomarkør immunhistokjemi teknikk.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
Microscope Cover Glass 22×22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

References

  1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
  3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
  5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
  6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
  7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
  8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
  9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
  10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
  11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
  14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
  15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
  16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
  17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
  18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

Play Video

Cite This Article
Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

View Video