Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana
Summary
Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.
Abstract
Un punzón de biopsia de la piel se utiliza comúnmente para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos (IENFD) para el diagnóstico de 1,2 polineuropatía periférica. En la actualidad, es una práctica común para recoger biopsias de piel 3 mm a partir de la pata distal (DL) y el muslo proximal (PT) para la evaluación de las polineuropatías dependiente de la longitud 3. Sin embargo, debido a la naturaleza multidireccional de IENFs, es un reto para examinar superposición de estructuras nerviosas a través del análisis de formación de imágenes de dos dimensiones (2D). Alternativamente, imágenes en tres dimensiones (3D) podría proporcionar una mejor solución para este dilema.
En el presente informe, se presentan métodos para la aplicación de imágenes en 3D para estudiar la neuropatía dolorosa (PN). Con el fin de identificar IENFs, muestras de piel se procesan para el análisis de inmunofluorescencia de producto de gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal sartén. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD disuadirminada por inmunohistoquímica utilizando PGP microscopía de campo claro 4. En el estudio actual, se aplicó análisis de doble inmunofluorescencia para identificar IENFD total de, utilizando PGP, y IENF nociceptivo, a través del uso de anticuerpos que reconocen la tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A), el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento de los nervios 5. Las ventajas de IENF co-tinción con PGP y Trk A anticuerpos beneficia el estudio de la PN por tinción con claridad, fibras nociceptivas PGP-positivos. Estas señales fluorescentes se pueden cuantificar para determinar los cambios morfológicos y IENFD nociceptivas de IENF asociados con PN. Las imágenes fluorescentes se adquirieron por microscopía confocal y se procesaron para análisis en 3D. 3D-imagen proporciona capacidades de rotación seguir analizando los cambios morfológicos asociados a la PN. En conjunto, co-tinción fluorescente, la imagen confocal y análisis 3D se benefician claramente el estudio de la PN.
Introduction
En la actualidad, es una práctica común para los médicos para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos, (IENFD) a partir de biopsias de piel en sacabocados, que pueden ser utilizados para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas 3, 6-8. Las biopsias se toman de la pierna distal (DL), 10 cm por encima del maléolo lateral y el muslo proximal (PT), 20 cm por debajo de la espina ilíaca anterior 9. Todos IENF están etiquetados de usar el producto gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal bandeja 10-12. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD determinado por tinción de PGP con microscopía de campo claro 6. Además, varios grupos de investigación han utilizado protocolos de inmunofluorescencia para PGP inmunohistoquímica 7-9. Neuropatía de fibras pequeñas se asocia con el dolor neuropático. Para entender mejor el papel de IENF esencial para el procesamiento del dolor, se desarrolló una técnica para co-label total de IENF con fibras que generan dolor. Nocicepcióntiva IENF, específicamente Aδ y las fibras C, se pueden estudiar a través de la co-etiquetado de IENF con PGP y el marcador nociceptivo, tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A) 5. Trk A es el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso que es esencial para el desarrollo de la nocicepción. Las fibras nerviosas nociceptivas A-positivos Trk son fibras peptidérgicas que expresan la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria y sus colegas aplicaron la técnica de doble etiquetado para estudiar PN, co-etiquetado IENF PGP-positiva con un marcador de 10 nociceptivo. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que Trk IENF A positivo, pero no Trk IENF A negativo, se upregulated en un modelo animal de la neuropatía diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-etiquetado proporciona la capacidad para comparar la cuantificación de IENFD nociceptivo al total de IENFD y la capacidad para estudiar los cambios morfológicos asociados con PN. La capacidad de visualizar nociceptivo IENF y compañerasre cuantificación de IENFD total a la IENFD nociceptivo podría proporcionar evidencia objetiva para la presencia de dolor, y, posiblemente, una idea de la severidad del dolor asociado con PN. Esta técnica es también aplicable a la piel de modelos animales. En comparación con estudios previos, el protocolo actual describe métodos para el análisis de imagen en 3D, la creación de la oportunidad de evitar errores que podrían ocurrir en el análisis de imagen 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medición de IENFD ha sido ampliamente utilizado para determinar el grado de neuropatías periféricas 13,14. En la actualidad, el protocolo más comúnmente utilizado sólo mide las densidades de las fibras nerviosas que penetran en la membrana basal de la epidermis; no toma en consideración de ramificación axonal y / o cambios morfológicos de los nervios. Además, no se ha demostrado el análisis IENFD actual para correlacionar IENFD con la presencia de dolor en PN 15.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el Programa de Investigación de Neurología y descubrimiento, y el Instituto A. Alfred Taubman de Investigación Médica de la Universidad de Michigan. En este trabajo se utilizó la Morfología y Análisis de Imágenes Core del Michigan Diabetes Research and Training Center, financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención 5P90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales. Los autores desean agradecer a Robinson Singleton y Gordon Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana para apoyar el desarrollo inicial de la técnica inmunohistoquímica biomarcador nociceptivo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
