Summary
Le matériau décrit ici une méthode développée pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires. C’est ce qu’on a appelé la méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Cette méthode améliore la sensibilité pour la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence de l’ARN (FISH).
Abstract
Au cours de la différenciation des cellules germinales testiculaires, la structure de la chromatine nucléaire change dynamiquement. Ce qui suit décrit une méthode conçue pour préserver la disposition tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires trouvées chez la souris; cette méthode a été appelée méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Dans cette méthode, les tubules testiculaires sont directement traités par une étape de perméabilisation qui élimine le matériel cytoplasmique, suivie d’une étape de fixation qui fixe les matières nucléaires. Les tubules sont ensuite dissociés, la suspension cellulaire est cytospun et les cellules adhèrent aux lames. Cette méthode améliore la sensibilité à la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence arn (FISH) et à la combinaison de ces méthodes de détection. À titre d’exemple d’application possible de la méthode de lame 3D, un FISH à ARN Cot-1 est montré pour détecter les ARN naissants. La méthode de lame 3D facilitera l’examen détaillé des relations spatiales entre la structure de la chromatine, l’ADN et l’ARN lors de la différenciation des cellules germinales testiculaires.
Introduction
Dans les testicules, les cellules germinales se différencient des spermatogones diploïdes par méiose en spermatozoïdes matures et haploïdes. Au cours de ce processus, la structure de la chromatine nucléaire des cellules germinales est continuellement et dynamiquement remodelée. Les étalements de surface sont couramment utilisés pour l’examen cytologique des cellules spermatogéniques individuelles. Une méthode dominante d’étalements de surface emploie un traitement hypotonique par lequel les cellules spermatogéniques individuelles sont étalées et aplatir1. Ces conditions sont optimales pour l’analyse détaillée des chromosomes méiotiques. Des dispositifs chromosomiques tels que le statut synaptique et les foyers de recombinaison sont facilement observés utilisant cette méthode. Cependant, le traitement hypotonique perturbe l’architecture subnucléaire de chromatine, ainsi cette technique n’est pas appropriée pour l’analyse structurale des noyaux. Par conséquent, une méthode améliorée a été conçue pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires. Cette méthode a été appelée méthode tridimensionnelle (3D) de diapositives (Figure 1). La méthode de lame 3D a permis la détection de la localisation naissante de l’ARN dans les noyaux car elle a été initialement optimisée pour examiner l’expression des gènes et les états de la chromatine lors de la différenciation des cellules germinales testiculaires par hybridation in situ de fluorescence de l’ARN (FISH)2,3. Cette méthode 3D est également applicable à la combinaison de l’immunofluorescence, de l’ADN et de l’ARN FISH. De plus, cette méthode a aidé à la découverte de la chromatine sexuelle postméiotique (PMSC), un compartiment silencieux des chromosomes sexuels trouvés dans les spermatides postméiotiques2.
La méthode de lame 3D a été optimisée à l’origine par la combinaison de deux étapes essentielles de préparation de la lame couramment utilisées pour la coloration nucléaire: l’étape de fixation conçue pour fixer les matières nucléaires et l’étape de perméabilisation destinée à éliminer les matériaux cytoplasmiques afin d’améliorer l’accessibilité des réactifs de coloration, tels que les anticorps et les sondes FISH. Comme décrit précédemment dans une autre publication3,il a été déterminé que l’étape de perméabilisation doit précéder l’étape de fixation afin d’obtenir des résultats optimaux avec un faible fond cytoplasmique. Dans cette méthode de lame 3D, l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation subséquente sont effectuées directement sur des tubules séminifères et sont suivies par la dissociation mécanique des cellules germinales avec une pince avant le cytospinning sur les lames. Une méthode alternative pour l’ARN FISH de cellules spermatogéniques a été développée dans un autre laboratoire4. Dans cette méthode, compatible avec la méthode 3D, l’étape de perméabilisation doit précéder l’étape de fixation afin d’obtenir des résultats optimaux de l’ARN FISH.
Le protocole suivant décrit la méthode de lame 3D et fournit un exemple d’application possible, Cot-1 RNA FISH pour la détection des ARN naissants nucléaires. L’ADN cot-1 est constitué d’éléments répétitifs dans le génome. Ici, une sonde d’ADN Cot-1 est hybridée à un intron et un UTR des transcriptions naissantes, détectant ainsi les régions transcriptionnellement actives dans le noyau5,6. Les lames 3D sont polyvalentes et peuvent être appliquées à une combinaison de techniques d’immunofluorescence, d’ADN et d’ARN FISH afin d’obtenir un examen détaillé des relations spatiales entre l’architecture de la chromatine.
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Protocol
1.3D Préparation des diapositives
- Préparez les réactifs suivants :
- Tampon CSK: NaCl 100 mM, saccharose 300 mM, TUYAUX 10 mM, MgCl 3 mM2. Ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH. Stockez la mémoire tampon CSK à 4 °C.
- Tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-100 : Ajouter 200 μl de Triton X-100 à 40 ml de tampon CSK. Mélanger la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que le Triton X-100 soit complètement dissous. Conservez le tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-100 à 4 °C.
- Paraformaldéhyde (PFA) – PBS à 4 %, pH 7,4 : Dissoudre 4 g de PFA dans environ 70 à 80 ml d’eau. Afin d’accélérer le processus de dissolution, ajouter environ 20 μl de 4 N NaOH et maintenir la solution dans un bain-marie à 60 °C jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous et que la solution soit transparente. Ce processus prend environ 1 heure. Une fois que le PFA est complètement dissous, ajouter 10 ml de PBS 10x. Régler le volume final à 100 ml avec de l’eau et refroidir la solution à température ambiante (25 °C). Utilisez une solution fraîchement préparée pour chaque nouvelle expérience.
Remarque : Obtenir la permission de l’établissement pour tous les travaux sur les animaux et respecter les lignes directrices pertinentes en matière de soins aux animaux.
- Euthanasier les souris mâles. À l’aide de pinces et de ciseaux, excisez les testicules de la souris. Placez le testicule dans PBS (ou RPMI 1640). Après l’élimination des testicules, effectuez rapidement les étapes suivantes 1.3-1.4 afin d’empêcher la dégradation de l’ARN.
- Rompez le testicule sur une petite boîte de Petri et retirez la tunica albuginea. Démêler les tubules séminifères dans le PBS sur la glace à l’aide de pinces.
- À l’aide de pinces, transférer plusieurs tubules (plusieurs morceaux de tubules d’environ 5 à 10 mm de longueur) dans un puits d’une parabole de 4 puits contenant 500 ml de tampon CSK + 0,5 % de Triton X-100 sur de la glace, et incuber pendant 6 min. La surexposition au tampon CSK peut entraîner la perturbation des cellules.
- À l’aide de pinces, transférer tous les tubules dans un puits d’une parabole à 4 puits contenant une solution de PFA-PBS à 4 %. Cette étape peut être préformée sans stéréomicroscope, mais éventuellement elle peut être utilisée. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Simultanément commencer à préparer 12 chambres cytospin pendant les périodes d’incubation.
- À l’aide de pinces, transférer tous les tubules dans un puits d’une parabole de 4 puits contenant du PBS. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- À l’arrière d’une lame de verre, transférer tous les tubules dans 30 μl de PBS (le haut de la lame doit être évité en raison de la charge cationique). En utilisant les pointes de deux pinces, déchirez les tubules en morceaux. Hachez les tubules dans une direction horizontale en coupant les tubules entre les extrémités de deux pinces et en tirant la pince horizontalement. Continuez avec cette étape pendant environ 10-20 secondes.
- Mélanger la suspension par pipetage à l’aide d’une pipette P20.
- Transférer la suspension dans un tube à microcentrifugation, diluer avec du PBS à environ 1,3 ml. Appliquer 100 μl de suspension sur chacune des 12 chambres de cytospin (1,2 ml au total). À cette étape, la concentration des cellules n’a pas besoin d’être déterminée.
- Cytospin les échantillons à 2 000 tr/min pendant 10 min à température ambiante. Après le cytospinning, sécher les lames sur le banc de laboratoire pendant quelques minutes à température ambiante. Une fois que les toboggans ont été laissés sécher complètement pendant quelques minutes, passez à l’étape suivante.
- À l’aide d’un pot Coplin contenant du PBS, lavez les lames pendant 5 min à température ambiante.
- Transférer les lames dans un bocal Coplin contenant 70% d’éthanol et attendre au moins 2 min avant le début de l’ARN FISH. Les lames sont stables pendant quelques semaines dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C. Pour le stockage à long terme, déshydrater les lames en utilisant un traitement en série avec 80% et 100% d’éthanol dans des pots Coplin pendant 2 min chacun et sécher à l’air déshydrater complètement les lames. Conserver à -80 °C dans une boîte à diapositives.
2. Préparation de la sonde d’ADN Cot-1 par amorçage aléatoire
- Préparez les réactifs suivants :
- Tampon d’hybridation : Mélanger les composants procédants pour préparer 900 ml de stock tampon d’hybridation; cette solution sera utilisée pour stocker des sondes. Ce stock tampon d’hybridation permet l’ajout de 10% de volume de solution inhibitrice de RNase (Ribonucleoside Vanadyl Complex) avant l’hybridation.
Avant l’hybridation, ajouter 1/10 vol de 200 mM du complexe ribonucléoside vanadyl ou de l’eau au stock tampon d’hybridation pour correspondre à la concentration finale. À -20 °C, ce mélange est stable pendant plus d’un an.composant Quantité (μl) Concentration finale Formamide 500 50 % (v/v) 50% Dextrane 200 10 % (p/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC : Dissoudre 88,2 g de citrate de sodium et 175,3 g de NaCl dans environ 800 ml d’eau. Réglez le pH à 7,0 en utilisant quelques gouttes de 1 M HCl. Ajoutez de l’eau pour ajuster le volume final à 1 L. Stérilisez par autoclavage. Après préparation, 20x SSC peuvent être stockés à température ambiante.
- 50% (p / v) Dextrane: Incorporer l’eau et ajouter lentement 50 g de sulfate de dextrane. Continuez à remuer pendant la nuit à température ambiante. Ajouter de l’eau pour régler le volume final à 100 ml. Conserver à température ambiante.
- Tampon d’hybridation : Mélanger les composants procédants pour préparer 900 ml de stock tampon d’hybridation; cette solution sera utilisée pour stocker des sondes. Ce stock tampon d’hybridation permet l’ajout de 10% de volume de solution inhibitrice de RNase (Ribonucleoside Vanadyl Complex) avant l’hybridation.
- Ajouter les constituants suivants énumérés ci-dessous à un tube pcr. À l’aide d’une machine PCR, mélanger et incuber la solution pendant 5 min à 95 °C.
composant Quantité par réaction (μl) final ADN cot-1 : 1 mg/ml 1 1 μg Apprêt aléatoire de 9mer (du kit) 10 Eau 27 - Centrifuger brièvement et placer sur la glace.
- Ajoutez les composants suivants. Mélanger et incuber pendant 30 min à 37 °C à l’aide d’un appareil pcr. (Pour plus de détails sur la trousse utilisée, voir le tableau des réactifs et de l’équipement).
composant Quantité par réaction (μl) Concentration finale Mélange préparé à partir de l’étape 2.2 38 Tampon nucléotidique 5x (du kit) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM Klenow (du kit) 2 - Ajouter 2 μl de tampon d’arrêt (du kit) pour interrompre la réaction.
- Purifier la réaction arrêtée à l’aide de colonnes microspin.
- Ajouter 50 μg (5 μl) d’ADN de sperme de hareng (50 fois plus d’ADN cot-1) à la fraction purifiée.
- Mesurez le volume total à l’aide d’une pipette. Ajouter 0,7x volume d’éthanol à 100 % et 0,1x volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2), bien mélanger et centrifuger pendant 15 min à la vitesse maximale (17 000 x g) à l’aide d’une microcentrifugation à 4 °C.
- Retirer le liquide et ajouter 200 μl d’éthanol à 70 %, bien mélanger et centrifuger pendant 5 min à la vitesse maximale à 4 °C.
- Retirez l’excès de liquide. Sécher le précipité pendant 10-30 min à température ambiante.
- Dissoudre le culot dans 20 μl de stock tampon d’hybridation. Parce que le culot est souvent difficile à dissoudre, pipettez à plusieurs reprises. Comme autre option, un mélangeur de vortex peut également être utilisé pour dissoudre efficacement la pastille. Les sondes peuvent être maintenues à -20 °C jusqu’à leur utilisation.
3. Poisson à ARN cot-1
- Ajoutez les composants répertoriés ci-dessous à un tube PCR. À l’aide d’un appareil de PCR, incuber pendant 10 min à 80 °C, suivi d’une étape de préannealage d’environ 10-30 min à 42 °C. Conserver à 42 °C jusqu’à l’hybridation. Ribonucleoside Vanadyl Complex est facultatif; il peut être remplacé par de l’eau.
composant Quantité par réaction (μl) final Sonde d’ADN Cot-1 (50 ng/μl) 2 100 ng Complexe Ribonucleoside Vanadyl (200 mM) 2 20 mM Tampon d’hybridation ajouté à 20 - Déshydrater les lames dans un bocal Coplin contenant 80 % d’éthanol pendant 2 min, suivi d’un bocal Coplin contenant 100 % d’éthanol pendant 2 min. Sécher complètement les lames sur le banc de laboratoire à température ambiante.
- Préchauffer à l’avance une chambre de boîte à pointe (remplie de 2 à 3 cm d’eau) dans un incubateur à 42 °C. Placez la diapositive sur la chambre de la boîte de pointe. Centrifuger brièvement les sondes préannealées et pipetter directement sur les lames déshydratées. Évitez de faire des bulles. Couvrez doucement la glissière avec un glissement de couverture.
- Hybrider pendant 6 h à une nuit (14-15 h) à 42 °C.
- Préparer des solutions de lavage dans des pots Coplin (deux pots avec 2x SSC et 50% formamide, et deux pots avec 2x SSC). Préchauffer à 42 °C pendant 30 min au bain-marie.
- Utilisez une lame de rasoir pour retirer le glissement du couvercle du bord de la glissière. Évitez de gratter les échantillons. Laver les lames dans un bocal Coplin contenant 2x SSC et 50% de formamide pendant 5 min à 45 °C. Répétez cette étape une fois.
- Laver les lames dans un bocal Coplin contenant 2x SSC pendant 5 min à 45 °C. Répétez cette étape une fois.
- Ajoutez 20 μl de support de montage DAPI aux diapositives et couvrez-les avec un bordereau de couverture. Appuyez doucement sur le verre du couvercle pour retirer le support de montage supplémentaire. Épongez le support de montage supplémentaire avec du tissu de nettoyage. Les lames sont prêtes pour l’évaluation par microscopie.
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Representative Results
Un résultat représentatif d’une diapositive 3D est illustré à la figure 2. Dans cette expérience, Cot-1 RNA FISH a été réalisée pour détecter la transcription naissante ainsi que l’immunomarquage à l’aide d’anticorps anti CBX1 et γH2AX. Pour combiner l’ARN FISH et l’immunomarquage, l’immunomarquage a été réalisé en premier, suivi de l’ARN FISH comme décrit en3. CBX1 est une protéine d’hétérochromatine qui se localise à l’hétérochromatine péricentromérique et aux chromosomes sexuels silencieux dans la méiose appelée corps XY (ou corps sexuel). γH2AX est une forme phosphorylée de variante histone H2AX et se localise sur le corps XY. Dans cette image, les signaux Cot-1 s’accumulent sur les régions euchromatiques, mais sont exclus de l’hétérochromatine péricentromérique et du corps XY.
Pendant la préparation de propagation de surface, le traitement avec la solution hypotonique gonfle les noyaux et étend physiquement les structures subnucléaires. Cette méthode dominante pour l’étude méiotique est la mieux adaptée pour capturer tous les chromosomes méiotiques dans un seul plan z1. Pour clarifier la différence entre la méthode de la lame 3D et les étalements de surface après traitement hypotonique, des images représentatives des spermatocytes pachytènes de chaque expérience sont montrées en utilisant le même grossissement à l’aide d’un microscope épifluorescent(figures 2A et 2B). Dans les étalements de surface traités avec une solution hypotonique, la structure tridimensionnelle de la chromatine est perturbée et tous les axes chromosomiques méiotiques peuvent être capturés dans un seul plan z. La préparation de la diapositive 3D, cependant, préserve la structure de la chromatine intacte.
Figure 1. Schéma de la méthode de diapositive 3D. La méthode de glissement 3D peut préserver la structure de chromatine tridimensionnelle. En raison de la nature tridimensionnelle de la diapositive, l’acquisition de données avec plusieurs sections z est nécessaire pour couvrir un noyau.
Figure 2. La comparaison entre la méthode de la lame 3D et la surface se propage après traitement hypotonique au même grossissement. (A) À l’aide de la lame 3D, l’ARN Cot-1 FISH (cy3) et l’immunomarquage avec des anticorps anti CBX1 (fitc) et γH2AX (cy5) sont effectués. Un spermatocyte pachytène avec une seule section z est montré. (B) En utilisant les étalements de surface, des immunomarquages avec des anticorps anti SCP3 et γH2AX sont effectués. Un spermatocyte pachytène est montré. Cercles: Corps XY. Barres: 10 μm.
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Discussion
Dans la préparation de la lame 3D, l’étape de perméabilisation précède l’étape de fixation. Ces étapes sont effectuées directement sur des tubules séminifères, préservant ainsi la structure tridimensionnelle de la chromatine. Une autre option pour préserver la structure de la chromatine pour l’ARN/ADN FISH est d’effectuer l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation simultanément. Cette technique alternative a été réalisée dans des cellules germinales marsupiales et chez des embryons de préimplantation de souris7,8. Cependant, si l’étape de fixation précède l’étape de perméabilisation, elle peut donner lieu à un fond cytoplasmique élevé. Par conséquent, le déterminant critique de l’optimisation de la lame pour l’ARN et l’ADN FISH dépend de l’ordre de la perméabilisation et des étapes de fixation. La durée de l’étape de perméabilisation est également un facteur important pour l’optimisation de la préparation de la lame. Six minutes est la condition générale pour cette méthode. Cependant, il peut être ajusté en fonction de la variation des matériaux utilisés.
La préservation de la structure tridimensionnelle de la chromatine est une caractéristique de la diapositive 3D qui la sépare distinctement des lames étalées en surface. Cet avantage diffère grandement de celui de la préparation de propagation des chromosomes. La méthode de glissement 3D préserve la structure de la chromatine tridimensionnelle, mais nécessite l’acquisition de données avec plusieurs sections z pour englober un noyau entier. Une seule section z ne peut pas capturer tous les signaux d’un noyau. Ainsi, la nécessité de plusieurs sections z est une limitation majeure de cette méthode. Pour capturer un noyau dans une seule section z, les étalements de surface ont un avantage. Par conséquent, la méthode 3D et la préparation de propagation de surface présentent des avantages distincts et compensent mutuellement les caractéristiques l’une de l’autre pour l’étude de la méiose et de la spermatogenèse.
La méthode de la lame 3D peut être appliquée à tous les types de cellules présentes dans les testicules, y compris les spermatogones, les spermatides rondes et les cellules de Sertoli. Cette méthode a également été appliquée pour examiner le compactage de la chromatine des chromosomes sexuels au début de l’inactivation méiotique des chromosomes sexuels, et pour examiner les modifications épigénétiques sur PMSC10. En termes d’applications futures, cette méthode peut être appliquée à d’autres tissus ou cellules. Si c’est le cas, il est recommandé que l’étape de perméabilisation précède l’étape de fixation. Alternativement, l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation peuvent être réalisées simultanément.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Je remercie Jeannie T. Lee pour la supervision de ce projet lorsque j’étais dans le laboratoire Lee et Tyler Broering pour l’édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Basil O’Connor Starter Scholar Award de la March of Dimes Foundation et le NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
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