Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

Abstract

תשישות תא T היא גורם מרכזי בסילוק הפתוגן נכשל במהלך זיהומים נגיפיים כרוניים. מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו בחשיפה אנטיגן המתמשכת הזה ולתרום לירידה של התפשטות, פונקצית cytolytic מופחתת, ולקויי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T. במודל העכברי של זיהום LCMV, מנהלה של חסימת נוגדנים כנגד שני מסלולים אלה בתוספת תגובות תא T. עם זאת, אין כיום assay במבחנה כדי למדוד את ההשפעה של מצור כזה על הפרשת ציטוקינים בתאים מדגימות אנושיות. הפרוטוקול והגישה ניסויית שלנו מאפשרים לנו באופן מדויק ויעיל לכמת את השיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים מנבדקים נגועים ב-HIV.

כאן, אנו מתארים במבחנה עיצוב ניסיוני המאפשר מדידות של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ואת השפעתן על cel האחרתת ליטר. תאי CD8 T היו מתרוקנים מכל הדם וPBMCs שנותרה היו מבודדות באמצעות שיטת הפרדת Ficoll. PBMCs המדולדלת CD8 אז הודגרו עם חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 ו / או IL-10Rα, ולאחר גירוי עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 48 שעה, supernatant נאסף לניתוח ציטוקינים על ידי מערכי חרוזים וכדורי תא נאספו גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR. לניתוח מפורט יותר, אוכלוסיות תאים שונות התקבלו על ידי דלדול משנה סלקטיבית מPBMCs או על ידי מיון באמצעות cytometry זרימה לפני שהוערך באותה מבחני. שיטות אלה מספקות גישה רגישה וספציפית מאוד על מנת לקבוע את האפנון של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T-helper אנטיגן הספציפי ולקבוע יחסי גומלין פונקציונליים בין אוכלוסיות השונות של תאים חיסוניים.

Introduction

במהלך זיהומים נגיפיים מתמשכים, תאים הספציפי-T וירוס לרכוש ליקויים תפקודיים בתהליך המכונה תשישות תא T. בשלב מוקדם במחקרי vivo במודל העכברי LCMV של זיהום נגיפי כרוני ציין כי תאי T ספציפי וירוס המותשים צמצמו פונקצית cytolytic כנגד תאים נגועים בנגיף, לאבד את היכולת שלהם להתרבות וצמצמו יכולת לייצר ציטוקינים כגון IL-2, TNF- α וIFN-γ 1,2. רשת מורכבת של מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו במהלך זיהומים כרוניים ותורמת לתפקוד תא T (הנסקרת ב 3,4). בvivo ממשל של חסימת נוגדנים נגד מסלולים מעכבים אלו בעכבר LCMV דגם משוחזר תפקוד של תאי T ספציפי וירוס מותשים וסליקה נגיפית משופרת, המציין כי תשישות תא T היא תופעה הפיכה באופן חלקי (הנסקרת ב 5).

ממצאים על המודל LCMV דואר הוארך במהירות לדלקות ויראליות כרוניות אנושיות כמו HBV, HCV ו-HIV 5. בהידבקות ב-HIV-1 כרונית, PD-1 ו-IL-10 מסלוליהם הוגברו בנושאים נגועים ולתאם עם פרמטרים של התקדמות מחלה, באופן ישיר עם העומס הנגיפי והפכו עם CD4 לספור 6-8. מצור נוגדן של מסלולי PD-1 או IL-10 בהתפשטות מבחנה המשוחזרת של תאי CD4 ו CD8 T-HIV ספציפיים המצביעים על כך, בדומה למודל של עכברי LCMV, תשישות תא T בבני האדם היא תופעה הפיכה באופן חלקי. עם זאת, בשל האופי העדין של ניסויים על דגימות אנושיות, כמו גם מגבלות ברגישות של מבחני חוץ גופייה, חקירה יסודית של פרופילי השיקום התפקודי הושגו על ידי התערבויות אלה הוא בולטים נעדרו. מבחני למניעת הפצת נשק היו, עד כה, המבחנה assay אמין רק בנבדק במרבית המחקרים, אך יש חוסר מדהים של ראיות על ההשפעה של בין אלהventions על: 1) יכולת ההרג של תאי T ציטוטוקסיים, 2) השפעת נגיפים של תאי T על שכפול נגיפי, 3) פרופיל הפרשת ציטוקינים, ו4) ההשפעה על עזרה תא T מסוג CD4 בתת תא אחר.

מכתים ציטוקינים תאיים (ICS) הוא זרימה מאוד שימושית ושימוש נרחב assay המבוסס cytometry המשמש לזיהוי ייצור של ציטוקינים בסוגי תאים שונים בשני עכברים ובני אדם. כמו כן, נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של מצור נוגדן של מסלולים מעכבים. במבחני ICS, הפרשת ציטוקינים חסומה על ידי התוספת של Brefeldin ו / או Monensin. ציטוקינים לכודים בתוך התאים ולאחר מכן זוהו עם נוגדני ניאון באמצעות cytometry זרימה צבעוני. משך assay הוא מוגבל בדרך כלל 6 או 12 שעות לאחר גירוי אנטיגן שכן הן Brefeldin וMonensin, אשר מתווספים בדרך כלל תוך 2 שעות של בנוסף אנטיגן, הם רעילים לתאים. ICS assay הוא טכניקה רבת עוצמה שהייתה לי שימושיn החקירה של ההשפעה של in vivo ממשל של חסימת התערבות נוגדנים בעכברים שבו תאים שהוצאו לאחר תקופה מסוימת של זמן לאחר חשיפת נוגדן 9. עם זאת, ישנן מספר מגבלות ליישום של גישה ניסויית זה כדי להעריך את ההשפעה של המצור על קולטנים מעכבים בדגימות אנושיות. בעת ביצוע התערבויות נוגדן של מסלולים מעכבים בגירוי 6 או 12 שעות במבחנה (בדרך כלל במקרה של דגימות אנושיות), המצור על קולטנים מעכבים ברוב המקרים אינו משנה את התדירות של תגובת תאי T אנטיגן הספציפי כפי שהיא נמדדת על ידי מבחני סטנדרטיים ICS 6, 7. מדידות של ייצור ציטוקינים לכל תא כפי שהיא נמדדת על ידי עוצמת הקרינה ממוצעת או החציוני נתנו תוצאות לא עקביות 6, 7, 10. מצד השני, כאשר ICS מתבצע בנקודת זמן מאוחר לאחר גירוי (כלומר שישה ימים), שינויים במספר ג מפרישי ציטוקיניםניתן לצפות אמות. ההבדלים הם השפעה משולבת של התפשטות שהשתנתה, הישרדות, ושינויים בתפקוד מפעיל המצטברים על פני תקופת הזמן המוגדרת 6. דרך אחת להתגבר באופן חלקי על המגבלות האלה היא כדי לדגור במשך תקופות זמן ארוכות יותר (36 שעה למשל, 60 שעה, וכו '.) עם האנטיגן לפני התוספת של חוסם הפרשת ציטוקינים מבלי להמתין ללהתרחש התפשטות. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לקבוע את קינטיקה של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T-HIV הספציפיים 11,12, עם זאת, גישה זו אינה מסוגלת לזהות את תגובות קטנות ולא תיתן תוצאה משולבת של סך הפרשת ציטוקינים המתרחשת מאז גירוי. לכן, ICS הוא לא מספיק שיטה רגישה כדי לזהות את ההשפעה של מצור של מסלולים מעכבים על הכמות של ציטוקינים המיוצרת על ידי תאי T מופעלים לעומת quantitation ציטוקינים mRNA או מדידות של הפרשת ציטוקינים בsupernatanלא באותן נקודות הזמן. בנוסף, רוב ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מופעלים לפעול באופנה autocrine על ידי תרומה למשוב חיובי או שלילי לולאות באמצעות אינטראקציה עם תאי המציגים אנטיגנים. לכן, תוספת של Brefeldin או Monensin במהלך assay ICS מונעת הפרשת ציטוקינים וכך הגירוי של תאי T הוא לא אופטימלי. לבסוף, זיהוי של ציטוקינים מרובים עם ICS הוא מוגבל על ידי זמינה והרגישות של נוגדנים לזיהוי של ציטוקינים עם cytometry זרימה, כמו גם מאילוצים במספר fluorochromes, שניתן להשתמש בו זמנית בכל פנל נתון.

פיתחנו במבחנה גישה ניסויית רגישה מאוד כדי להעריך את ההשפעה של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ולאחר מכן עזרה CD4 לאנטיגן הצגת תאים (נגמ"שים) ותאי הרג טבעי (תאי NK). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את סבלנותct של מצור של מולקולות מעכבות על תפקוד תאי CD8 T על ידי depleting תאי T מסוג CD4 מPBMCs או על ידי גירוי עם פפטידים אופטימליים שמוכרים רק על ידי תאי CD8 T. בניגוד למבחני מכתים ציטוקינים תאיים, החלטנו שלא להתערב בהפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על מנת להיות מסוגל: 1) לבצע כימות מדויק יותר של רמות ציטוקינים המיוצרים; 2) לחקור פנל רחב יותר של ציטוקינים או מולקולות מפעיל: 3) להעריך את ההשפעה של ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על תת תא אחר. אנו לעורר PBMCs המדולדלת CD8 עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות חסימת נוגדנים למסלול immunoregulatory של עניין. לאחר הזמן הרצוי של דגירה, בדרך כלל 48 שעות, אנו אוספים supernatants למדוד הפרשת ציטוקינים עם מערכי חרוז ולאסוף את כדורי תא או לניתוח פנוטיפי של תת תא אחר או לניתוח תעתיק. של לב, בזמן t48 נקודת זמן שעות שלו, אנחנו לא לזהות אוכלוסייה משמעותית של תאים מתרבים T 12. זוהי גישה גמישה וכמה עיבודים של עיצוב זה יכול להיות מיושמים לטיפול בהשערות שונות. לדוגמא, תת תאים הבודדים (כגון תאי HIV-ספציפיים T מסוג CD4 או PD-1 תאי T מסוג CD4 גבוהים, וכו '.) ניתן למיין לאחר 12 שעות של דגירה לפני דגירה נוספת ל36 שעה אחריו אוסף של supernatants וכדורי תא כדי לחקור באופן ספציפי יותר את ההשפעה של התערבויות מצור על הפרשת ציטוקינים על ידי אוכלוסיות מוגדרות של PBMCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דלדול ובידוד של PBMCs באמצעות הפרדת Ficoll

  1. לרוקן תאי CD8 + T על ידי הוספת קוקטייל דלדול אדם CD8 + ב50 / מיליליטר μl של דם מלא.
  2. מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר (18-25 ° C).
  3. לאחר דגירה, לערבב דם כל עם HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של האנק ללא Ca 2 + או Mg 2 +) ושכבה מעל Histopaque. ספין ב340 RCF ל30 דקות (לא בלם, האצה איטית).
  4. לאסוף PBMCs ולהעביר לחרוטי 50ml חדשים. לשטוף 2x עם 45 RPMI מיליליטר 1640 בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, וHEPES 1% על ידי ספינינג 10 דקות ב 340 RCF.

2. מצור נוגדנים וגירוי אנטיגן ספציפי של תאים

  1. תאי resuspend ב2x10 6 לכל מצב בRPMI 1640 מכיל 10% סרום אדם בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES,היווה 500 μl לכל מצב.
  2. Aliquot 500 μl של תא השעיה לכל צינור FACS.
  3. בהתאם למסלול שנחקר, להוסיף PD-L1, IL-10Rα חסימת נוגדנים ו / או בקרות אלוטיפ ב10 מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 15 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לעורר תאים עם בריכת פפטיד HIV-1 Gag בריכוז סופי 1 מיקרוגרם / מיליליטר / פפטיד. כמו כן כולל שליטת "אין גירוי" לכל מצב חסימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.

3. איסוף וניתוח של supernatant

  1. לאחר 48 שעות, ספין למטה צינורות FACS ל7 דקות ב340 RCF.
  2. לאסוף בזהירות 2 x 225 supernatant μl בצינורות Eppendorf עבור מערכי חרוז Luminex מבלי להפריע גלולה.
  3. להשבית וירוס בsupernatant נאסף עם 25 μl 0.5% PBS-Tween לתת ריכוז סופי של 0.05% PBS-Tween.
  4. supernatants חנות שנאסף שאינם immediately משמש ב-80 ° C במקפיא.
  5. למדוד ריכוזים ציטוקינים רצויים באמצעות ערכת Millipore Luminex על פי הפרוטוקול של היצרן.

4. איסוף וניתוח פנוטיפי של תאים באמצעות cytometry הזרימה

  1. לאחר איסוף supernatant, לשטוף תאים ב-PBS 3ml. ספין תאים למשך 7 דקות ב340 RCF ולמזוג לשטוף עודף.
  2. כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. שטפו תאי PBS למשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS.
  4. אם מכתים את מונוציטים או תאי המציגים אנטיגנים אחרים, קולטני Fc בלוק על ידי הוספת 1.4 μl של FCR חסימה מגיב ומערבולת לערבב.
  5. דגירה של 10 דקות ב 4 ° C.
  6. הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת, ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
  7. שטוף תאים עם FBS 1% PBS, למזוג שטיפה עודפת, ולהוסיף 200 paraformaldehyde μl 4%. לדגורבטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך.
  8. שטוף תאים עם FBS 1% PBS, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולרכוש בmultilaser cytometer זרימה (לדוגמא BD LSRII או Fortessa).

5. ניתוח של תאים באמצעות qRT-PCR

  1. לתאים לא ניתח באמצעות cytometry זרימה: לאחר איסוף supernatant, תאי lyse ב300 μl RLT Qiagen המאגר המכיל 1% בטא mercaptoethanol. אם לא ממשיך בפרוטוקול, ניתן להקפיא תאים ב -80 ° C לאחר שלב זה.
  2. בודד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הבאה הפרוטוקול של היצרן.
  3. לסנתז cDNA מ-RNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA הבאה הפרוטוקול של היצרן.
  4. לבצע PCR כמותיים תוך שימוש בטכנולוגית SYBR ירוק.
  5. ליצור תמהיל פריימר עבור כל צבע יסוד המשמש כוללים גנים משק בית (למשל IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) על ידי הוספת פריימרים לnuclease ללא מים לתת ריכוז סופי של 10מיקרומטר. שמור על קרח.
  6. יצירת תערובת הורים עבור כל צבע יסוד על ידי הוספת מים 10.5 μl nuclease חינם, 12.5 ירוק SYBR μl, ותמהיל פריימר μl 1 לכל צלחת היטב. שמור על קרח.
  7. פיפטה תערובת הורים 24 μl לבאר כל הצלחת שתשמש.
  8. הוספת cDNA μl 1 היטב כל אחד על פי תבנית.
  9. כובע בארות וצלחת צנטריפוגות במשך 3 דקות ב800 RCF.
  10. הפעל צלחת על מכונה qRT-PCR, למשל מכשיר Stratagene MX3005P.

6. הסתגלות לתאית ציטוקין הכתמה ב48 שעות

הוספת Brefeldin וMonensin 6 שעות לפני מכתים ציטוקינים תאיים. Brefeldin מתווסף בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בזמן Monensin מתווסף על פי הוראות יצרן. לנוחיותכם, ניתן להוסיף Brefeldin 12 שעה לפני להכתים בריכוז של 5 מיקרוגרם / מיליליטר.

  1. אחרי כתם פני השטח, לשטוף תאים עם FBS PBS 1% וכתם בציטוקינים tracellular כגון IL-12, IFN-γ, ו-TNF-α באמצעות ערכת קיבוע / permeabilization פתרון ופרוטוקול.
  2. שטוף תאים, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולהפעיל על multilaser cytometer זרימה (LSR למשל BD השני או Fortessa).

7. הסתגלות למיון תאים

  1. 16 שעות לאחר גירוי, כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן. שמור את התאים על קרח במהלך ההליך כולו.
  2. שטוף תאים עם PBS במשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS.
  3. הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת לערבב, ותאי דגירה על קרח בחושך עבור 20 דקות.
  4. שטפו תאים עם FBS 1% PBS ב340 RCF וב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl RPMI הקר 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES.
  5. תאי סינון באמצעות 5 מיליליטר פוליסטTube מסביב לתחתית רנה עם מכסה תא מסננת.
  6. הכן צינורות איסוף למין על ידי הוספת 200 RPMI μl 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, וHEPES 1% לצינור אחד. שמור את כל הצינורות על קרח במהלך מיון.
  7. בשידור חי למיין את תת התא של ריבית על מכשיר (לדוגמא BD FACS Aria II) ממוקם במתקן המצויד לחומרים ביולוגיים מסוכנים.
  8. אחרי התאים מוינו, תאי מקום בחזרה בחממה לסכום רצוי של זמן ופעל עם ניתוח אוסף supernatant / Luminex וניתוח אוסף התא גלולה / ה-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת ביצוע מדידות ציטוקינים באמצעות מערכת זו במבחנה, זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין בין תגובות אנטיגן הספציפי בהשוואה לשום שליטת גירוי. באופן כללי, אנחנו נחשבים לתגובות חיוביות כמו כל ערכים של גירוי אנטיגני שנותנות עלייה לפחות פי שלוש ברמות ציטוקינים בהשוואה לשום שליטת הגירוי ושהיו בתוך הטווח ליניארי של assay. אנחנו משתמשים במבחני רגישות גבוהים מערך חרוז שיכול לזהות ריכוזים של ציטוקינים נמוכים כמו 0.16 pg / ml, מה שמאפשר לנו להתבונן בתגובות אנטיגן הספציפי חלשות T מסוג CD4 תא. דגימות מנוהלות בשני עותקים, על מנת להבטיח שערכים מדויקים מתקבלים. איור 2A מראה כי לייצור IFN-γ, assay יכול לזהות החציוני של גידול 800 פי השוואה לשום גירוי. ערכים אלו תלויים בציטוקינים נבדקו כי לכמה מהם, כגון IL-13 ו-IL-2, ערכים נמוכים יותר בהשוואה לשום גירוי יהיהלהיות שנצפה. גישה דומה חלה על פרופיל תעתיק של ה-mRNA של בדיקות ציטוקינים שונות. איור 2 מראה את הרמה של ה-mRNA לIFN-γ, כי הוא גדל באופן משמעותי (יותר מפי שלוש) לאחר גירוי. עם assay זה, יש מתאם חזק בין הפרשת חלבון IFN-γ ורמות IFN-γ-mRNA (איור 2 ג). למרות שאנחנו פיתחנו מבחנה בגישה זו כדי לחקור את תפקוד תא HIV-ספציפי T מסוג CD4, יש לנו גם השתמש בהצלחה בגישה זו כדי להעריך את ההשפעה של PD-L1 ו / או מצור IL-10Rα בתגובות תא T מסוג CD4 לאחר גירוי עם SEB, anti-CD3/CD28, lysate CMV וRD-1 פפטידים מחפת Mycobacterium (מידע לא מוצגים). בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות לאנטיגנים חיידקיים, כוללים תגובות מושרה חיסון, באותה מידה. איור 2 ד מראה כי גירוי עם HIV-Gag תוצאות בהפרשת IFN-γ יותר תוך גירוי עם toxoi טטנוסתוצאות ד בIL-13 הפרשה גבוהה יותר, הוכחת פרופיל ציטוקינים השונים של HIV ותגובות תא T מסוג CD4 טטנוס ספציפיים.

כוח עיקרי של assay זה הוא היכולת לזהות הבדלים בהפרשת ציטוקינים לאחר מניפולציה נוגדן של מסלולים מעכבים שאינם מזוהים על ידי במבחני חוץ גופית אחרים כמו ICS. יש לציין כי חלק ציטוקינים, כגון IL-2, עשויים להיות נצרכים על ידי תאים, כך מדידות בsupernatant פוטנציאליות עלולות לזלזל ברמות ציטוקינים המיוצרים. מסיבה זו, כל הבדלים בהפרשת ציטוקינים נצפו לאחר מצור נוגדן צריכים להיות גם אישרו ברמת ה-mRNA להעריך האם הבדלים נצפים הם כתוצאה משינויים לייצור תאים. איור 3 א מציג את ההשפעה של נוגדן חוסם PD-L1 בIFN -Γ ו-IL-2 הפרשה על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים לאחר 48 שעות של גירוי עם אנטיגן מאותו המקור. מצור של המסלול PD-1 בדרך כלל אין לוהשפעה משמעותית על הפרשת ציטוקינים ללא כל גירוי אנטיגן אך משפרת IFN-γ ו-IL-2 הפרשה כאשר תאי מגורה עם בריכות פפטיד Gag-HIV-1. כאשר תאי CD3 מתרוקנים מPBMCs, אין IFN-γ או IL-2 מיוצר בתגובה לאנטיגן גירוי (איור 3) מצביע על כך שההפרשה של IFN-γ ו-IL-2 היא מושרה בתגובה לT מסוג CD4 HIV-הספציפי גירוי אנטיגן הספציפי בתא. עבור חלק ציטוקינים, כגון IL-21, הרגישות של מערכי חרוז אינה מאפשרת זיהוי של רמות חלבון לאחר תגובות אנטיגן חלשות כגון איידס. לציטוקינים אלו, כימות של mRNA ניתן לבצע במקום 12.

ציטוקינים מסוימים, כגון IFN-γ ו-TNF-α, יכולים להיות מיוצרים על ידי מגוון רחב של תת תא. בעת ביצוע ניסויים בPBMCs המדולדלת-CD8, זה קשה לפעמים identfy מקור הפרשת חלבון, ולכן קשה לזהות את משנה התא שresponטוליפ אין למצור של המולקולות המעכבות. מסיבה זו פיתחנו גרסה של שיטה זו כדי לבצע חקירה מעמיקה יותר של ההשפעה של חסימת מולקולות מעכבות על הפרשת ציטוקינים על ידי מיון תת תא שונה בהתאם למאפיינים פנוטיפי שלהם. איור 4 מראה את ההשפעה של מצור PD-1 על IFN -Γ ו-IL-2 מופרש על ידי תאי T מסוג CD4 ממוינים. לצורך ניסוי זה, PBMCs המדולדלת-CD8 היו מגורה לשעות 12 בנוכחות נוגדני PD-L1 חסימה או שליטת אלוטיפ. לאחר שעות 12, תאים היו משטח מוכתם עם נוגדני ניאון ותאי T מסוג CD4 מוינו באמצעות cytometer זרימת סדרן תא. תאי T מסוג CD4 מסודרים אז הודגרו נוסף ל36 שעה וציטוקינים נמדדו בsupernatant באמצעות מערכי חרוז כפי שתואר לעיל. אנחנו השתמשנו בהצלחה גישה זו בעבר כדי למיין תאי T מסוג CD4 פי רמות ביטוי שלהם PD-1 והראינו כי מצור PD-L1 יכול לשקם את התפקוד של HIV-sp תאי T מסוג CD4 ecific המבטאים רמות גבוהות של PD-1 12.

מספר מסלולי immunoregulatory זוהו כתפקוד תא T השלטון בהידבקות ב-HIV הוא בהתמדה. אנחנו השתמשנו בהצלחה assay זה בעבר כדי להראות את ההשפעה של IL-10 מצור על IFN-γ ו-IL-2 הפרשה על ידי תאי T מסוג CD4-HIV-1-ספציפיים 8,13. אחד היתרונות של שיטה זו היא היכולת להעריך כיצד מולקולות immunoregulatory להסדיר את יחסי הגומלין בין תאי HIV-ספציפיים T מסוג CD4 עם תאי המציגים אנטיגנים (נגמ"שים). איור 5A מראה את ההשפעה של IL-10 מצור על שחזור הפרשת IL-12 מ אנטיגן הצגת תאים. עם התאמה של טכניקה זו, על ידי ביצוע ICS ב48 שעות לאחר גירוי, הצלחנו להראות כי מונוציטים הם המקור העיקרי של IL-12 לאחר גירוי עם בריכות פפטיד Gag HIV-1 (איור 5).

דואר 1 "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
איור 1. ייצוג סכמטי של PBMCs המדולדלת CD8 מתודולוגיה. מבודדת מנבדקים נגועים ב-HIV הם טופחו במשך דקות 15 או עם נוגדני שליטת אלוטיפ או חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 או IL-10Rα. לאחר גירוי שעות 48 עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, supernatants נאספים למדידות של הפרשת ציטוקינים עם מערכי חרוז וכדורי תא נאספים גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק של רמות ה-mRNA באמצעות qRT-PCR.

איור 2
איור 2. זיהוי של תגובות תא T אנטיגן הספציפי עם ה-mRNA או הפרשת חלבון. : PBMCs מדולדלת-CD8 מגורה עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1. הפרשת IFN-γ נמדדה ב48 שעות לאחר הגירוי ב ':. רמות IFN-γ-mRNA נמדדו עם qRT-PCR בכדורי תא ב48 שעות לאחר גירוי C:. מתאם של ריכוז IFN-γ בsupernatants עם רמות IFN-γ-mRNA. D:. השוואה של IFN-γ ו-IL-13 רמות חלבון בין PBMCs המדולדלת CD8 מגורה עם בריכת HIV-1 Gag פפטיד או טטנוס toxoid לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3
איור 3. שינויים של הפרשת ציטוקינים לאחר המניפולציה של מסלולים מעכבים הוא CD4 T תא תלוי A ו-B:. CD8 מדולדל או PBMCs המדולדלת CD3 מגורה עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות שליטת אלוטיפ או נוגדן חוסם PD-L1. IFN-γ ו-IL-2 הפרשה נמדדו ב48 שעות לאחר גירוי.

er.within-page = "תמיד"> איור 4
איור 4. מיון תאי T מסוג CD4 כדי לזהות הפרשת ציטוקינים לאחר המניפולציה של מצור PD-1. AB: PBMCs מדולדלת-CD8 משלושה נושאים נגועים כרוני, שלא טופלו הודגרו עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 או שמאלה unstimulated ל12 שעות בנוכחות שליטת אלוטיפ או נוגדן חוסם PD-L1. תאי T מסוג CD4 לאחר מכן נבחרו באופן שלילי על ידי הרחקת שושלת בלימפוציטים וטופחו נוסף ל36 שעה.

איור 5
איור 5. יחסי גומלין בין תאי T מסוג CD4 ותאי מציגי אנטיגן. : PBMCs מדולדלת-CD8 היו מגורה עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות שליטת אלוטיפ או נוגדן חסימת IL-10Rα. IL-12 רמות בsupernatant נמדדו ב48 שעות לאחר הגירוי ב '.:PBMCs המדולדלת CD8 מגורה עם בריכת פפטיד HIV-1 איסור פרסום. הפרשת IL-12 במונוציטים נמדדה עם ICS ב48 שעות לאחר גירוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אוסף supernatant הוא חלק הכרחי של עיצוב ניסיוני זה. כאשר קצירת supernatants עבור assay Luminex, aliquots נעשו והמשיכו ב-80 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים בשל ההפשרה להקפיא מחזורים. הקפאה והפשרה יכולה להיות תהליכים קשים לחלבונים, ועל ידי מזעור הקפאה מפשירה, אות תהיה מוגדלת במבחנים. לכן, קל יותר להשיג נתונים הדיר ומדויקים יותר כאשר עובדים מaliquots כי כבר-מופשר הקפאה אותו מספר הפעמים.

אנחנו ביצענו בעבר ניתוח הקינטית של הפרשת ציטוקינים ורמות ה-mRNA לאחר גירוי עם בריכות פפטיד HIV-Gag 12. בהתבסס על קינטיקה אלה, בחרנו את נקודת זמן 48 שעות כדי לבצע את מדידות הפרשת ציטוקינים. בהתחשב בהבדלים שנצפו בין ה-mRNA והפרשת חלבון, כמו גם בין גירויים שונים, קיים הכרח כי חוקרים לבצע הקינטית שלהם מנתח בהתאם לגירוייםהם משתמשים והאם הם מודדים ביטוי mRNA או הפרשת ציטוקינים חלבון.

כאשר תת תא מסודרים (שימוש בגישה שמוצגת באיור 3), חשוב להתאים את עוצמת הקול של התרבות בהתאם למספר התא ממוין. ב assay הסטנדרטי, אנחנו בדרך כלל דגירה 1 מ'PBMCs המדולדלת CD8 ב500 μl של מדיום. עם זאת, כאשר אנו סוג התא תת, כגון תאי T מסוג CD4, אנחנו בדרך כלל למיין עד 100,000 תאים. מסיבה זו, אנו להחליש את עוצמת הקול של המדיום ל200 μl על מנת לשמור מדילול התאים וכדי להשיג ריכוז ציטוקינים שניתן לזהות עם מערך חרוז. עבור כל ניסוי, את עוצמת הקול של תרביות התאים צריך להיבדק בניסוי, תוך התחשבות בסוג התא, מספרי התא ממוינים, ציטוקינים של עניין, ואת הרגישות של ערכת זיהוי.

היבט חשוב נוסף בעת ביצוע assay Luminex הוא inactivati ​​וירוסהלאה. וירוס צריך להיות מובטל כדי להיות מסוגל לרוץ בבטחה דגימות על המכשיר. 20-Tween שימשו מסיבה זו. בעבר, חומרי ניקוי אחרים שנבדקו למטרה זו. דילולים שונים של Tween 0.5%, 5-10% טריטון, ולשטוף חיץ נוספו לתאים נגועים ב-HIV ונבדקו נגד תאי noninactivated. Tween נמצא להשבית את הנגיף הטוב ביותר תוך התערבות לפחות במבחנים שבוצעו.

בעת ביצוע cytometry זרימה, צעד חיוני בעת מכתימה את מונוציטים הוא לחסום את הקולטן Fc עם מגיב חסימת Fc למנוע ספציפי מחייב של נוגדנים חד שבטיים. הקולטן Fc נמצא על פני השטח של תאי המציגים אנטיגנים ונקשר לאזור Fc של נוגדנים. אם קולטן זה אינו חסום לפני מכתים, נוגדנים חד שבטיים שיתווספו למקד סמנים ספציפיים עשויים במקום להיקשר לקולטן זה, ולכן נותנים תוצאה חיובית כוזבת. זה חשוב במיוחד כדי למנוע בעת ניתוחציטוקינים הנובעים מסוג תא מסוים, כפי שאינו חוסם את קולטן זה יכול להזיק לתוצאות. תאים דוגרים בתקשורת המכילה סרום אדם יכולים גם לעזור עם בעיה זו, כפי שיש כמויות עצומות של IgG בסרום אשר נקלטות על ידי קולטן Fc.

למרות מבחני Luminex לספק זיהוי רגיש יותר מאשר מבחני ICS, מולקולות מפעיל מסוימות, כגון IL-21 או perforin עדיין קשה לזהות בשיטה זו. מבחנה גישה זו מאפשרת ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR המספק רגישות רבה יותר באיתור מולקולות מפעיל אחרות.

מגבלה אחת של הגישה הניסויית שלנו היא פרשנות שתוצאותיה היא קשה, כאשר ציטוקינים של עניין הוא מיוצר על ידי תת תא שונה מהתמהיל הטרוגני של לויקוציטים ההווה בPBMCs כולו או PBMCs המדולדלת CD8. לדוגמא, זה המקרה לציטוקין IL-10 אשר הוגבר בty תאים השוניםPES בהגדרה של מחלת איידס מתקדמת 8. מיון של האוכלוסייה של עניין לפני דגירה ואוסף נוספים של supernatants הוא גישה חלופית השתמשנו בהצלחה בהקשר זה.

לסיכום, הטכניקות שהוצגו במאמר זה לספק אמצעי אמין למדידת שיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 או CD8 T-HIV-ספציפיים בנוכחות המצור על מסלולי immunoregulatory PD-L1 ו-IL-10. ניתן ליישם את הטכניקות הללו במקרים שבם ציטוקינים לא בקלות לזיהוי על ידי cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לגורדון פרימן למתן נוגדן החסימה אנטי PD-L1. אנו מודים לצוות הרפואי ומעבדה בבית החולים הכללי מסצ'וסטס וכל משתתפי המחקר לתפקיד רב הערך שלהם בפרויקט זה.

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות (PO1 AI-080,192; DEK), הלאומי ללב ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות (RO1 HL-092,565; DEK). DEK נתמך פרס קריירה Scholar המחקר של בריאות קרן המחקר לקוויבק (FRQS) על ידי. FP נתמך על ידי מענק מלגה של כללי וועד הפועל של בית החולים מסצ'וסטס על מחקר והמוסד לבריאות הגלובלית של הרווארד (HGHI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 80 מחלות וירוסים מחלות של מערכת החיסונית איידס תאי T מסוג CD4 תאי CD8 T תאי מציגי אנטיגן ציטוקינים רשתות immunoregulatory PD-1: IL-10 תשישות מונוציטים
<em>במבחנה</em> Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, … More

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter