Summary
我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。
Abstract
T細胞の枯渇は、慢性ウイルス感染時に障害が発生した病原体のクリアランスの主要な要因である。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路は、この進行中の抗原の曝露の際にアップレギュレートおよび増殖の喪失、減少した細胞溶解機能に寄与し、CD4およびCD8 T細胞によるサイトカイン産生が損なわれている。 LCMV感染のマウスモデルにおいて、これらの二つの経路に対する遮断抗体の投与は、T細胞応答を増強した。しかし、ヒト試料からの細胞でのサイトカイン分泌に対するそのような遮断の影響を測定するために何in vitroアッセイは現在ありません。我々のプロトコルおよび実験的アプローチは、正確かつ効率的にHIV感染被験者からのHIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン産生の回復を定量化するために、私たちを可能にする。
ここでは、HIV-特異的CD4 T細胞および他のセルへの影響によるサイトカイン分泌の測定を可能にインビトロ実験デザインを示すLサブセット。 CD8 T細胞は、全血から枯渇し、残りのPBMCをフィコール分離法により単離した。 CD8枯渇PBMCをその後、HIV-1のGagペプチドプールで刺激した後、細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートし、PD-L1および/ またはIL-10Rαに対する遮断抗体とインキュベートした。 48時間後、上清をビーズアレイによるサイトカイン分析のために収集し、細胞ペレットを、定量RT-PCRを用いてフローサイトメトリーまたは転写解析を使用して流れる表現型分析のいずれかのために収集した。より詳細な分析のために、異なる細胞集団を、PBMCからの選択サブセットの枯渇によって、または同一のアッセイで評価される前に、フローサイトメトリーを用いて選別することによって得た。これらの方法は、抗原特異的Tヘルパー細胞によるサイトカイン産生の調節を決定し、免疫細胞の異なる集団の間の機能的相互作用を決定するために、高感度かつ特異的なアプローチを提供する。
Introduction
持続性ウイルス感染の間に、ウイルス特異的T細胞は、T細胞の枯渇として知られるプロセスにおいて機能的欠陥を獲得する。初期の慢性ウイルス感染症のマウスLCMVモデルにおけるインビボ研究消耗ウイルス特異的T細胞は、ウイルス感染細胞に対する細胞溶解機能が低下して増殖する能力を失い、例えばIL-2、TNF-などのサイトカインを産生する能力が低下してきたことを示したαおよびIFN-γ1,2。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路の複雑なネットワークは、慢性感染の間にアップレギュレートし、（3,4に総説）T細胞の機能不全に寄与する。 インビボ LCMVマウスにおいてこれらの経路の阻害に対する阻止抗体の投与モデルは、T細胞の枯渇が（5日）、部分的に可逆的な現象であることを示す、消耗したウイルス特異的T細胞の機能および拡張ウイルスクリアランスを回復した。
目の上の調査結果EのLCMVモデルは迅速なHBV、HCVおよびHIVの5のようなヒトの慢性ウイルス感染症にも拡張されました。慢性HIV-1感染では、PD-1およびIL-10経路は、感染患者でアップレギュレートされ、疾患進行のパラメータと相関、直接ウイルス量と反比例CD4と6-8を数える。 LCMVマウスモデルに類似していることを示してPD-1またはHIV-特異的CD4およびCD8 T細胞のインビトロ復元増殖における IL-10経路の抗体遮断は、ヒトにおけるT細胞の枯渇は、部分的に可逆的な現象である。しかし、ヒトのサンプルだけでなく、in vitroアッセイの感度の限界の実験の繊細な性質のために、これらの介入によって達成機能回復プロファイルの徹底的な調査が著しく欠けている。増殖アッセイは、これまでのところ、ほとんどの研究でテスト唯一の信頼できるin vitroアッセイされているが、まだこれらの相互の影響に関する証拠の著しい欠如している上ventions：細胞傷害性T細胞の1）殺傷能力、2）ウイルス複製に対するT細胞の抗ウイルス効果、3）サイトカイン分泌プロファイル、および他の細胞サブセット上のCD4 T細胞ヘルプに4）の効果。
細胞内サイトカイン染色（ICS）は、マウスおよびヒトの両方における種々の細胞型においてサイトカインの産生を検出するために使用されるベースの非常に有用かつ広く使用されているフローサイトメトリーアッセイである。また、阻害性経路の遮断抗体の効果を調べるために使用されている。 ICSアッセイにおいて、サイトカイン分泌を、ブレフェルジンおよび/またはモネンシンを添加することによって遮断される。細胞内に捕捉されたサイトカインは、次いで、多色フローサイトメトリーを用いた蛍光抗体を用いて検出される。通常は、抗原添加の2時間以内に追加されブレフェルジンとモネンシン、どちらも細胞に対して毒性であるため、アッセイの期間は通常、抗原刺激後6か12時間に制限されています。 ICSアッセイは、便利なIされている強力な手法であるnは、細胞を抗体曝露後9時間の一定期間後に抽出されたマウスにおける抗体の介入を阻止するのインビボ投与の効果の調査。しかし、ヒト試料中の阻害性受容体の遮断の影響を評価するために、この実験的なアプローチを適用するためのいくつかの制限がある。 インビトロで 6または12時間刺激（ヒト試料と、典型的な場合）における阻害経路の抗体介入を行う場合は、標準的なICSアッセイにより測定されるように、ほとんどの場合、阻害性受容体の遮断が、抗原特異的T細胞応答の頻度を変化させない6,7。平均値または中央値蛍光強度によって測定されるセル当たりのサイトカイン産生の測定値は矛盾した結果が図6、図7、図10を与えている。一方、ICSは後後期の時点で実行されるときに、刺激（ すなわち、六日）、サイトカイン分泌数cの変化のエルを観察することができる。相違点は、変化した増殖、生存、および6時間の特定の期間にわたって蓄積するエフェクター機能の変化の複合効果である。部分的にこれらの制限を克服する1つの方法は、増殖が起こるのを待つことなく、サイトカイン分泌ブロッカーの添加前に抗原と、より長い期間（ 例えば 36時間、60時間など ）インキュベートすることである。我々は、正常にHIV特異的CD4およびCD8 T細胞11,12によるサイトカイン分泌の動態を決定するために、このメソッドを使用しているが、このアプローチは、小さな応答を検出することができず、発生した総サイトカイン分泌の統合された結果を得られる刺激以来。したがって、ICSはsupernatanにおけるサイトカインmRNA定量またはサイトカイン分泌の測定値と比較して、活性化T細胞によって産生されるサイトカインの量に対する阻害経路の遮断の影響を検出するための敏感な十分な方法ではない同じ時点でT。さらに、活性化T細胞によって産生されるサイトカインのほとんどが正または負のフィードバックに貢献する自己分泌様式で作用し、抗原提示細胞との相互作用を介してループする。したがって、ICSアッセイの間またはモネンシン、ブレフェルジンの添加は、サイトカイン分泌を防止し、従って、T細胞の刺激が最適ではない。最後に、ICと複数のサイトカインの検出は、フローサイトメトリーと同様に、任意のパネルで同時に使用することができる蛍光色素の数の制約によって可用性とサイトカインの検出のための抗体の感度によって制限されます。
我々は、細胞（APC）及びナチュラルキラー細胞（NK細胞）が抗原提示するHIV特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を調節し、続いてCD4ヘルプの免疫調節経路の影響を評価するための高感度インビトロ実験的なアプローチを開発した。この方法はまた、IMPAを評価するために使用することができるPBMCからCD4 T細胞を枯渇させることによってのみ、CD8 T細胞によって認識され、最適なペプチドを用いて刺激することにより、CD8T細胞機能に対する阻害分子の遮断のCT。細胞内サイトカイン染色アッセイとは対照的に、我々のことができるようにするために、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を妨害しないことを決定した：1）産生されるサイトカインレベルのより正確な定量化を行うこと、2）広範なパネルを調べるサイトカインまたはエフェクター分子の、3）他の細胞サブセット上のHIV-特異的CD4 T細胞によって産生されるサイトカインの影響を評価する。私たちは、関心のある免疫調節経路のための抗体をブロックの存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで、CD8枯渇したPBMCを刺激する。インキュベーションの所望の時間の後、通常48時間後、我々は、ビーズアレイを有するサイトカイン分泌を測定し、異なる細胞サブセットの表現型分析または転写解析のためにいずれかの細胞ペレットを収集するために、上清を集める。注目すべきは、tにおけるその48時間の時点で、我々は、T細胞の増殖し12の有意な集団を検出しない。これは、柔軟なアプローチであり、この設計のいくつかの適応は、異なる仮説に取り組むために適用することができる。 36時間さらにインキュベーションが上清および細胞ペレットの回収が続く前に、例えば、（例えば、HIV-特異的CD4 T細胞またはPD-1の高いCD4 T細胞などのような）個々の細胞サブセットを、インキュベーションの12時間後にソートすることができより具体的に定義されたPBMCのサブ集団によるサイトカイン分泌に対する遮断介入の影響を調査する。
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Protocol
1。フィコール分離により枯渇し、PBMCの分離
- 全血50μL/ mlでヒトCD8 +枯渇カクテルを追加することにより、CD8 + T細胞を枯渇。
- よく混合し、室温（18〜25℃）で20分間インキュベートする。
- インキュベーション後、HBSS（Ca 2 +またはMg 2 +なしのハンクス液）で全血を混ぜてヒストを上の層。 30分（ブレーキなし、緩加速）のための340 RCFでスピン。
- PBMCをを収集し、新たな50ミリリットルコニカルに移す。 340 rcfで10分間スピンし、50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した45ミリリットルのRPMI 1640で2回洗浄。
2。抗体遮断および細胞の抗原特異的刺激
- 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％ヒト血清を含有するRPMI 1640中で条件あたり2×10 6で細胞を再懸濁し、条件あたり500μLを占めている。
- FACSチューブあたりの細胞懸濁液の一部を500μl。
- 調べ経路に応じて、PD-L1、10μg/ mlの抗体でおよび/ またはアイソタイプコントロールを遮断するIL-10Rαを添加し、37℃、5％CO 2で15分間インキュベートする。
- 1μg/ mlの/ペプチド最終濃度でのHIV-1のGagペプチドプールで細胞を刺激する。また、各ブロックする条件について「刺激なし」コントロールが含まれています。 37°C、48時間、5％CO 2でインキュベートする。
3。上清の収集と分析
- 48時間後、340 RCFで7分間FACSチューブをスピンダウン。
- 慎重にペレットを乱すことなく、ルミネックスビーズアレイ用のエッペンドルフチューブ内の2×225μlの上清を回収。
- 0.05％PBS-Tweenでの最終濃度を与えるために25μlの0.5％PBS-Tweenで回収した上清中のウイルスを不活性化する。
- IMMEDでない店回収した上清iately -80℃の冷凍庫で使用。
- 製造業者のプロトコルに従ってミリポアルミネックス·キットを用いて所望のサイトカイン濃度を測定する。
4。フローサイトメトリーを経由して収集し、細胞の表現型解析
- 上清を収集した後、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 340 RCFで7分間細胞をスピンし、過剰な洗浄をデカントします。
- 製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に染色。
- 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。
- のFcRは、試薬と混合する渦をブロックする1.4μLを添加することにより、単球、または他の抗原提示細胞は、ブロックのFc受容体を染色した場合。
- 4℃で10分間インキュベート
- 、表面抗体を追加し、ボルテックスし、暗所で4℃で20分間インキュベートする。
- PBS、1％のFBSで細胞を洗浄、過剰な洗浄をデカントし、200μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。インキュベート暗所で20分間室温で加えた。
- 250μLのPBS、1％FBS中で、PBS、1％のFBS、再懸濁して細胞を洗浄し、フローサイトメーターマルチレーザに取得（ 例えば 、BD LSRIIまたはFortessa）。
5。定量RT-PCRによる細胞の分析
- 細胞のためのフローサイトメトリーを介して分析していない：上清回収後、1％β-メルカプトエタノールを含む300μlのキアゲンバッファーRLT中の細胞を溶解。プロトコールを継続しない場合は、細胞は、この時点の後、-80℃で凍結することができる。
- 製造業者のプロトコルに従ってRNA単離キットを用いてRNAを単離する。
- 製造業者のプロトコルに従ってcDNA合成キットを用いてRNAからcDNAを合成する。
- サイバーグリーン技術を用いた定量的PCRを行う。
- 各プライマーのためのプライマーミックスを作成する10の最終濃度を与えるようにヌクレアーゼフリー水にプライマーを添加することにより、ハウスキーピング遺伝子（ 例えば、IL-13、IL-10、IFN-γ、GAPDH）を含んで使用程度である。氷の上においてください。
- うまく10.5μLのヌクレアーゼフリー水、12.5μlのSYBRグリーン、およびプレートあたり1μlのプライマーミックスを追加することによって、各プライマーのためのマスターミックスを作成します。氷の上においてください。
- 使用されるプレートの各ウェルにピペット24μlのマスターミックス。
- テンプレートに従って各ウェルに1μlのcDNAを追加します。
- 800 RCFで3分間キャップ井戸と遠心プレート。
- 定量RT-PCR装置、 例えばストラタMX3005P機器でプレートを実行します。
6。 48時間で細胞内サイトカイン染色のための適応
ブレフェルジンとモネンシン前細胞内サイトカイン染色に6時間を追加します。モネンシンは、メーカーの説明書に従って添加しながらブレフェルジンを10μg/ mlの濃度で添加される。便宜上、ブレフェルジンは5μg/ mlの濃度で染色する前の12時間後に添加することができる。
- 表面染色した後、中のため、PBS、1％FBSおよび染色で細胞を洗浄固定/透過処理ソリューションキットおよびプロトコルを使用して、例えば、IL-12、IFN-γおよびTNF-αなどのサイトカインtracellular。
- 洗浄細胞、250μlのPBS、1％のFBSに再懸濁し、マルチレーザフローサイトメーター（ 例えば 、BD LSR IIまたはFortessa）上で実行されます。
7。セルを並べ替えるための適応
- 製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に刺激、染色後の16時間。全体の手順の間、氷上で細胞を維持する。
- 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。
- 、表面抗体を追加混合するボルテックスし、20分間、暗所で氷上で細胞をインキュベートする。
- 340 rcfで4℃でPBS、1％FBSで細胞を洗浄し、500μlの中で再懸濁し、10％ウシ胎児血清を含有する冷RPMI 1640 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1％を補充したHEPES。
- 5ミリリットルポリスチレンテープを使用したフィルタセルセルストレーナーキャップ付きルネ丸底チューブ。
- ウシ胎児血清を各チューブに50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％を含有する200μlのRPMI 1640を添加することによってソートコレクションチューブを準備する。並べ替え中に氷の上で全てのチューブを保管してください。
- ライブバイオハザード材料のために装備施設に位置して、機器（ 例えば 、BD FACSアリアII）の利息の細胞サブセットを並べ替える。
- 細胞がソートされた後、戻って所望の時間のためのインキュベーター内で、上澄み収集/ルミネックス解析、細胞ペレット収集/ PCR解析をたどる場所細胞。
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Representative Results
このin vitro系を用いてサイトカインの測定を行う場合には、刺激なしコントロールに比較して抗原特異的応答を区別することができることが不可欠である。一般的に、我々は、アッセイの直線範囲内であった、少なくとも三倍の無刺激対照と比較してサイトカインレベルの増加および抗原刺激を与える任意の値として正の応答を検討した。我々は、弱い抗原特異的CD4 T細胞応答を観察するために、私たちが可能0.16 pg / mlでできるだけ低いサイトカインの濃度を検出できる高感度ビーズアレイアッセイを使用している。試料は、正確な値が得られることを確実にするために重複して実行される。 図2Aは、IFN-γ産生のために、アッセイは、無刺激と比較して800倍の増加の中央値を検出することができることを示している。これらの値は、無刺激と比較して、例えばIL-13およびIL-2などのために、それらのいくつかについて試験したサイトカイン、低い値に依存するであろう観察される。同様のアプローチは、種々のサイトカインテストのmRNAの転写プロファイリングにも適用されます。 図2Bは、刺激後（3倍以上）を大幅に増加され、IFN-γのmRNAのレベルを示しています。このアッセイで、IFN-γタンパク質分泌およびIFN-γmRNAレベル（ 図2C）との間に強い相関がある。我々は、HIV-特異的CD4 T細胞機能を研究するためのこのin vitroアプローチを開発したとしても、我々はまた、正常、SEBで刺激した後CD4 T細胞応答に対するPD-L1および/ またはIL-10Rα遮断の影響を評価するためにこのアプローチを使用している抗CD3/CD28、CMV溶解物および結核菌からのRD-1ペプチド（データは示さず）。この方法は、同様に良好に、ワクチン誘導応答を含む細菌抗原に対する反応を評価するために使用することができます。 図2Dは 、破傷風toxoiで刺激しながら、HIV-GAGによる刺激が大きく、IFN-γ分泌をもたらしていることを示しています高いIL-13分泌におけるd結果、HIVおよび破傷風特異的CD4 T細胞応答の異なるサイトカインプロフィールを示す。
このアッセイの主要な強さは、ICSのような他のin vitroアッセイでは検出されない経路の阻害性抗体の操作の後にサイトカイン分泌の相違を検出する能力である。これは、上清中の測定値は、潜在的に産生されるサイトカインのレベルを過小評価してもよいこのようなIL-2のようないくつかのサイトカインは、細胞によって消費されてもよいことに留意すべきである。この理由のために、抗体遮断後に観察されたサイトカイン分泌の違いも観察された差が変更に起因するかどうかを評価するために、mRNAレベルで確認する必要がある電池の生産につき。 図3Aは、IFNに対するPD-L1ブロッキング抗体の影響を示す-γおよび同種抗原による刺激の48時間後にHIV特異的CD4 T細胞によるIL-2分泌。 PD-1経路の遮断は、一般的にはありません任意の抗原刺激なしサイトカインの分泌に重要な影響が、細胞は、HIV-1のGagペプチドプールで刺激されると、IFN-γおよびIL-2分泌を促進する。 CD3細胞をPBMCから枯渇した場合に、IFN-γおよびIL-2の分泌は、HIV-特異的CD4 Tに応答して誘導されていることを示す刺激（ 図3B）抗原に応答して産生されないIFN-γまたはIL-2が存在しない細胞抗原特異的刺激。例えば、IL-21などのいくつかのサイトカインについては、ビーズアレイの感度は、HIVなどの弱い抗原に対する応答があった後タンパク質レベルの検出を可能にしていません。これらのサイトカインは、mRNAの定量は12ではなく行うことができる。
例えば、IFN-γおよびTNF-αなどの一部のサイトカインは、細胞サブセットの様々な方法によって製造することができる。 CD8枯渇したPBMCの実験を行う場合には、タンパク質分泌のソースをidentfyすることが困難であり、したがって、それは細胞サブセットを同定することは困難で責任阻害分子の遮断にDED。このような理由から、我々は彼らの表現型の特徴に応じて異なる細胞サブセットをソートすることによりサイトカイン分泌の抑制分子をブロックの影響をより徹底的な調査を実行するには、この方法の変形を開発した。 図4は 、IFNにおけるPD-1遮断の影響を示していますソートされたCD4 T細胞によって分泌-γおよびIL-2である。この実験では、CD8枯渇PBMCを、PD-L1ブロッキング抗体またはアイソタイプ対照の存在下で12時間刺激した。 12時間後、細胞表面の蛍光抗体で染色し、CD4 T細胞は、セルソーターフローサイトメーターを用いて選別した。ソートされたCD4 T細胞を、次いで、36時間さらにインキュベートし、そして上記のようにサイトカインビーズアレイを用いて上清中で測定した。我々は成功し、PD-1発現のそのレベルに応じたCD4 T細胞をソートするために、過去にこのアプローチを使用しているとPD-L1遮断は、HIV-SPの機能を回復させることができることが示されている PD-1 12を高レベルに発現ecific CD4 T細胞。
HIV感染におけるT細胞機能を支配するとして同定免疫調節経路の数が絶えず増加している。我々は、正常にHIV-1特異的CD4 T細胞8,13によるIFN-γおよびIL-2分泌に対するIL-10遮断の影響を示すために、過去にこのアッセイを使用している。この方法の利点の一つは、抗原提示細胞（APC）を有するHIV-特異的CD4 T細胞の相互作用を調節する方法免疫調節分子を評価する能力である。 図5Aから IL-12分泌を復元するIL-10遮断の影響を示す抗原提示細胞。この技術の適応により、刺激後48時間でICSを行うことにより、我々は、単球がHIV-1のGagペプチドプール（ 図5B）での刺激後のIL-12の主要な供給源であることを示すことができた。
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図1。方法論の概略図。HIVから単離されたCD8枯渇PBMCを感染した被験者は15分間アイソタイプコントロール抗体またはPD-L1、またはIL-10Rαに対する抗体をブロッキングのいずれかでインキュベートする。 HIV-1のGagペプチドプールと48時間の刺激後、上清をビーズアレイ、細胞ペレットを有するサイトカイン分泌の測定のために収集され、フローサイトメトリー又は定量RT-PCRを用いてmRNAレベルの転写解析用いた表現型分析のためにどちら収集される。
図2。 mRNAまたはタンパク質分泌を有する抗原特異的T細胞応答の検出。 ：CD8枯渇PBMCをHIV-1のGagペプチドプールで刺激した。 IFN-γの分泌は刺激後48時間で測定したB：IFN-γのmRNAレベル刺激後48時間で細胞ペレットに定量RT-PCRで測定したC：IFN-γのmRNAレベルと上清中のIFN-γ濃度の相関。 D：IFN-γおよびHIV-1のGagペプチドプールまたは破傷風トキソイドで刺激したCD8-枯渇したPBMCの間のIL-13タンパク質レベルの比較は、 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。 。 抑制性経路の操作後にサイトカイン分泌の変化は、CD4 T細胞依存性のAであり、B：CD8の枯渇や、CD3枯渇PBMCを、アイソタイプ対照またはPD-L1ブロッキング抗体の存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで刺激した。 IFN-γ及びIL-2の分泌を、刺激後48時間で測定した。
図4。 PD-1遮断の操作後のサイトカイン分泌を検出するために、CD4 T細胞をソーティング。 AB：3慢性感染、未治療の被験者由来のCD8-枯渇したPBMCは、HIV-1のGagペプチドプールとインキュベートし、またはアイソタイプコントロールまたはPD-L1ブロッキング抗体の存在下で12時間刺激されていないままにした。 CD4 T細胞は、次いで負にリンパ球系統排除によって選択され、さらに36時間インキュベートした。
図5。 CD4 T細胞と抗原提示細胞間の相互作用。 ：CD8-枯渇PBMCを、アイソタイプ対照またはIL-10Rα遮断抗体の存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで刺激した。上清中のIL-12レベルは、刺激後48時間で測定したB：CD8枯渇PBMCをHIV-1のGagペプチドプールで刺激した。単球上のIL-12の分泌を、刺激後48時間後にICSで測定した。
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Discussion
上澄みCollectionこの実験計画の不可欠な部分です。ルミネックスアッセイのための上清を採取する際に、アリコートを作製し、サイクルの凍結融解に起因するタンパク質の分解を防止するために-80°Cで保存した。凍結融解のタンパク質について、凍結解凍を最小化することによって、過酷なプロセスであることができ、信号は、アッセイにおいて最大となる。したがって、同じ回数の凍結融解されてきたアリコートから作業する場合、反復可能かつより正確なデータを得ることが容易である。
我々は以前に、HIVのGagペプチドプール12で刺激した後、サイトカイン分泌およびmRNAレベルの動力学的分析を行った。これらの動力学に基づいて、我々はサイトカイン分泌の測定を実行するために48時間の時点を選択した。 mRNAおよびタンパク質の分泌だけでなく、種々の刺激の間に観察された差異を考慮すると、研究者が刺激に応じて、独自の運動解析を行うことが肝要である彼らは、mRNA発現またはタンパク質サイトカイン分泌を測定しているかどうかを使用して。
細胞サブセットは、（ 図3に示されるアプローチを使用して）ソートされる場合には、ソートされた細胞数に係る培養物の容量を調整することが重要である。標準的なアッセイでは、一般的に培地500μl中百万のCD8枯渇PBMCをインキュベートする。我々はこのようなCD4 T細胞のような細胞サブセットを、並べ替えるときしかし、我々は通常、100,000細胞まで並べ替える。この理由から、我々は、細胞を希釈し、控えビーズアレイで検出されたサイトカイン濃度を達成するために、200μlの培地への体積を減少させる。各実験について、細胞培養物の容積は実験的に考慮細胞タイプ、細胞数ソート、目的のサイトカイン、及び検出キットの感度を考慮して、試験されるべきである。
ルミネックスアッセイを行うもう一つの重要な側面は、ウイルスであるinactivati上。ウイルスは、安全に機器上のサンプルを実行できるように不活性化される必要がある。トゥイーン20はこの理由のために使用した。以前に、他の界面活性剤は、この目的のためにテストされていた。 0.5％のTween、5〜10％トリトン、および洗浄緩衝液の種々の希釈物をHIV感染細胞に添加し、noninactivated細胞に対して試験した。トゥイーンが実施されたアッセイで少なくとも妨害しながら、最高のウイルスを不活性化することがわかった。
フローサイトメトリーを行う際に、単球を染色する必須の工程では、モノクローナル抗体の非特異的結合を防ぐためにブロッキング試薬のFcとFc受容体をブロックすることである。 Fc受容体は、抗原提示細胞の表面上に存在し、抗体のFc領域に結合する。この受容体は、染色前にブロックされていない場合、特異的マーカーを標的とするように添加されるモノクローナル抗体ではなく、したがって偽陽性の結果を与え、この受容体に結合することができる。これは、分析するときを避けるために特に重要であるこの受容体をブロックしていないなど、特定の細胞型に由来するサイトカインは、結果に有害である可能性があります。ヒト血清を含む培地中でインキュベートする細胞は、Fc受容体に結合血清中のIgGの豊富な量があるので、この問題を支援することができます。
ルミネックスアッセイは、ICSアッセイより高感度の検出を提供するが、例えばIL-21またはパーフォリンのようなある種のエフェクター分子は、依然としてこの方法では検出が難しい。 このin vitro手法は、他のエフェクター分子の検出においてより高い感度を提供する定量RT-PCRを用いて転写解析を可能にする。
我々の実験的アプローチの一つの制限は、目的のサイトカイン全体のPBMCまたはCD8枯渇PBMC中に存在する白血球の不均一な混合とは異なる細胞サブセットによって産生されたとき、その結果の解釈が困難であることである。例えば、これは、異なる細胞ティにおいて上方制御されるサイトカインIL-10の場合である進行性のHIV疾患8の設定でPES。上清のさらなるインキュベーションおよび収集の前に関心のある人口のソートは、我々は成功してこれに関連して使用している別のアプローチである。
要約すると、本論文で提示技術は、PD-L1およびIL-10の免疫調節経路の遮断の存在下でHIV特異的CD4またはCD8 T細胞によるサイトカイン産生の回復を測定する信頼できる手段を提供する。これらの技術は、サイトカインは、フローサイトメトリーによって容易に検出できない場合においても適用することができる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、抗PD-L1ブロッキング抗体を提供するためのゴードン·フリーマンに感謝します。私たちは、マサチューセッツ総合病院と、このプロジェクトでの重要な役割のためのすべての研究参加者で、臨床および実験室のスタッフに感謝します。
、国立心臓肺および国立衛生研究所の血液研究所（RO1 HL-092565; DEK）、この研究は、国立アレルギー研究所と国立衛生研究所の感染症（DEK PO1 AI-080192）によってサポートされていました。 DEKは、ケベック州保健研究基金研究員のキャリア賞（FRQS）でサポートされています。 FPが研究ハーバード大学グローバルヘルス研究所（HGHI）にマサチューセッツ総合病院経営委員会のフェローシップの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
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