In Vitro analysen å evaluere virkningen av immunoregulatory Pathways på HIV-spesifikke CD4 T Cell effektorfunksjon

Summary

Vi har utviklet en in vitro-analyse for å undersøke rollen til immunoregulatoriske baner i regulering av cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler.

Abstract

T celle utmattelse er en viktig faktor i sviktet patogen klaring under kroniske virusinfeksjoner. Immunoregulatoriske baner, for eksempel PD-1 og IL-10, blir oppregulert ved denne pågående antigen eksponering og bidra til tap av proliferasjon, redusert cytolytisk funksjon, og svekket cytokin produksjon av CD4 og CD8 T-celler. I murine modell av LCMV infeksjon, administrasjon av blokkerer antistoffer mot disse to banene utvidet T celle responser. Men det er ikke noe in vitro assay for å måle effekten av en slik blokade på cytokin sekresjon i celler fra humane prøver. Vår protokoll og eksperimentell tilnærming gjør oss i stand til å nøyaktig og effektivt kvantifisere restaurering av cytokin produksjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler fra HIV-infiserte forsøkspersoner.

Her, vi skildre en in vitro eksperimentell design som gjør målinger av cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler og deres innvirkning på andre cell undergrupper. CD8 T-cellene ble fjernet fra fullblod, og de resterende PBMC ble isolert via Ficoll separasjonsmetode. CD8-fratatte PBMC ble deretter inkubert med blokkerende antistoffer mot PD-L1 og / eller IL-10Rα og etter stimulering med en HIV-1 Gag peptid basseng, ble celler inkubert ved 37 ° C, 5% _CO2. Etter 48 timer, supernatant ble samlet inn for cytokin analyse av perler arrays og celle pellets ble samlet for enten fenotypeanalyser ved hjelp av flowcytometri eller transcriptional analyse ved hjelp QRT-PCR. For mer detaljert analyse, ble ulike cellepopulasjoner oppnås ved selektiv undergruppe uttømming fra PBMCs eller ved å sortere ved hjelp av flowcytometri før de blir vurdert i de samme analysene. Disse metodene gir en meget følsom og spesifikk metode for å bestemme moduleringen av cytokin produksjon av antigen-spesifikke T-hjelperceller, og for å bestemme funksjonelle interaksjoner mellom forskjellige populasjoner av immunceller.

Introduction

Under vedvarende virusinfeksjoner, virusspesifikk-T-celler skaffe funksjonelle defekter i en prosess kjent som T-celle-uttømming. Tidlig in vivo-studier i murine LCMV modellen av kronisk virusinfeksjon indikerte at utslitte virus-spesifikke T-celler har redusert cytolytisk funksjon mot virusinfiserte celler, miste sin evne til å spre seg og har redusert evne til å produsere cytokiner slik som IL-2, TNF- α-og IFN-γ ^1,2. Et komplekst nettverk av immunoregulatoriske baner, for eksempel PD-1 og IL-10, blir oppregulert ved kroniske infeksjoner og bidrar til T-celle-dysfunksjon (gjennomgått i ^3,4). In vivo administrering av blokkerende antistoffer mot disse hemmende baner i LCMV mus Modellen gjen funksjon av utbrukte virus-spesifikke T-celler og forbedret viral klaring, noe som indikerer at T-celleslag er et delvis reversible fenomen (gjennomgått i ^5).

Funn på the LCMV modellen ble raskt utvidet til menneskelige kroniske virusinfeksjoner som HBV, HCV og HIV ^fem. I kronisk HIV-1-infeksjon, er PD-1 og IL-10 banene oppregulert i infiserte individer og korrelerer med parametere av sykdomsprogresjon, direkte med virusmengde og omvendt med CD4-tall ^6-8. Antistoff blokade av PD-1 eller IL-10 pathways in vitro gjen spredning av HIV-spesifikke CD4 og CD8 T-celler som indikerer at, i likhet med den LCMV musemodellen, T-celle utmattelse hos mennesker er et delvis reversibelt fenomen. Men på grunn av den skjøre natur av eksperimenter på humane prøver, så vel som begrensninger i følsomheten av in vitro prøver, grundig undersøkelse av de funksjonelle restaurering profilene oppnådd ved disse tiltak er påfallende fraværende. Spredningsanalyser har vært, så langt, den eneste pålitelige in vitro assay testet i de fleste studier, men det er en bemerkelsesverdig mangel på bevis på virkningen av disse interkonvensjoner for: 1) det drepende effekt på cytotoksiske T-celler, 2) den antivirale virkning av T-celler på viral replikasjon, 3) cytokin sekresjon profil, og 4) den virkning på CD4 T-celle-hjelp på andre celleundersett.

Intracellulær cytokin farging (ICS) er et meget nyttig og mye brukt strømningscytometri basert assay som blir brukt til å detektere produksjon av cytokiner i forskjellige celletyper i både mus og mennesker. Det har også blitt brukt til å undersøke effekten av antistoff blokade av inhibitoriske trasé. I ICS analyser, er cytokin sekresjon blokkert ved tilsetning av Brefeldin og / eller Monensin. Cytokiner er fanget inne i cellene blir deretter detektert med fluoriserende antistoffer ved hjelp av polykromatisk strømningscytometri. Varigheten av forsøket, er vanligvis begrenset til 6 eller 12 timer etter antigen-stimulering, siden både Brefeldin og Monensin, som typisk tilsettes i løpet av 2 timer til antigen tillegg er giftige for cellene. ICS-analysen er en kraftfull teknikk som har vært nyttig in undersøkelsen av effekten av in vivo administrering av blokkerende antistoff intervensjon hos mus, hvor celler ble utvunnet etter en viss tid etter at antistoff eksponering ^9.. Det er imidlertid flere begrensninger for anvendelse av denne eksperimentelle metode for å evaluere virkningen av blokade av inhibitoriske reseptorer i humane prøver. Ved utførelse av antistoff inngrep av inhibitoriske baner i en 6 eller 12 timers stimulering in vitro (typisk tilfelle med humane prøver), betyr blokade av inhibitoriske reseptorer i de fleste tilfeller ikke endre frekvensen for å reagere antigen-spesifikke T-celler som målt ved standard ICS assays ^{6, 7.} Målinger av per-celle-cytokinproduksjon målt ved midlere eller median fluorescensintensitet har gitt inkonsekvente resultater ^{6, 7, 10.} På den annen side, når ICS er utført på et sent tidspunkt etter stimulering (dvs. seks dager), endringer i antall cytokin-sekresjon calen kan observeres. Forskjellene er en kombinert effekt av endret spredning, overlevelse, og endringer i effektorfunksjon som akkumuleres over spesifisert tidsperiode ^seks. En måte å delvis overvinne disse begrensningene er å ruge for lengre perioder av gangen (f.eks 36 timers, 60-timers, osv..) Med antigen før tillegg av cytokin sekresjon blocker uten å vente på spredning å skje. Vi har med hell brukt denne metoden til å bestemme kinetikken for cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 og CD8 T-celler ^11,12, men det er denne metoden ikke i stand til å detektere små respons og vil ikke gi en integrert resultat av den totale cytokin sekresjon forekommer siden stimulering. Derfor er ikke ICS en følsom nok metode for å påvise virkningen av blokade av hemmende trasé på mengden av cytokiner som produseres av aktiverte T-celler sammenlignet med cytokin mRNA kvantifisering eller målinger av cytokin sekresjon i det overståendet ved de samme tidspunkter. I tillegg er de fleste av cytokiner som produseres av aktiverte T-celler opptrer i autokrin måte ved å bidra til enten positiv eller negativ tilbakekopling sløyfer gjennom interaksjon med antigen-presenterende celler. Derfor er tilsetning av Brefeldin eller Monensin under ICS assay hindrer cytokin-sekresjon og således stimulering av T-celler er ikke optimal. Til slutt, er påvisning av flere cytokiner med ICS begrenset av tilgjengeligheten og sensitiviteten til antistoffer for påvisning av cytokiner med flowcytometri samt av begrensningene i antall fluorokromer som kan anvendes samtidig i en gitt panel.

Vi utviklet en svært følsom in vitro eksperimentell tilnærming for å evaluere virkningen av immunoregulatory trasé i å regulere cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler og deretter CD4 hjelp til antigenpresenterende celler (APC) og naturlige drepeceller (NK-celler). Denne metoden kan også brukes til å evaluere IMPAct av blokade av inhibitoriske molekyler på CD8 T-cellefunksjon ved å tappe CD4 T-celler fra PBMC, eller ved å stimulere med optimale peptider som er anerkjent bare av CD8 T-celler. I motsetning til intracellulære cytokin flekker analyser, bestemte vi oss for ikke å forstyrre den cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler for å kunne: 1) foreta en mer nøyaktig kvantifisering av cytokin nivåer produsert, 2) undersøke et bredere panel av cytokiner eller effektmolekyler, og 3) evaluere effekten av cytokiner produsert av HIV-spesifikke CD4 T-celler på andre celle undergrupper. Vi stimulere CD8 utarmet PBMC med en HIV-1 Gag peptid bassenget i nærvær av blokkerende antistoffer for immunoregulatorisk vei av interesse. Etter den ønskede tiden for inkubasjon, som regel 48 timer, samler vi supernatantene for å måle cytokin sekresjon med perle matriser og samle cellepelletene enten for fenotypisk analyse av de forskjellige celle-undergrupper eller for transkripsjonelle analyser. Av notatet, på thans 48 hr tidspunkt har vi ikke påvise en betydelig bestand av voksende T-celler ^12. Dette er en fleksibel tilnærming og flere tilpasninger av denne utforming kan anvendes for å løse forskjellige hypoteser. For eksempel kan de individuelle celleundersett (for eksempel HIV-spesifikke CD4 T-celler eller PD-1 høye CD4 T-celler, etc.) Bli sortert etter 12 timers inkubasjon før ytterligere inkubasjon i 36 timer etterfulgt av samling av supernatanten og cellepelletene å undersøke mer spesifikt virkningen av blokade intervensjoner på cytokin sekresjon av definerte subpopulasjoner av PBMCs.

Protocol

En. Nedbryting og Isolering av PBMC via Ficoll Separation

1. Deplete CD8 +-T-celler ved å tilsette humant CD8 + Depletion Cocktail på 50 ul / ml av helt blod.
2. Bland godt og inkuber i 20 min ved romtemperatur (18-25 ° C).
3. Etter inkubering blandes helblod med HBSS (Hanks balanserte saltoppløsning uten Ca ^{2 +} og Mg ^{2 +)} og lag over Histopaque. Spin ved 340 RCF for 30 min (ingen brems, treg akselerasjon).
4. Samle PBMCs og overføre til en ny 50ml konisk. Vask med 2 x 45 ml RPMI 1640 supplert med 50 IU penicillin, 50 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES ved å spinne i 10 min ved 340 RCF.

2. Antistoff Blokade og Antigen-Specific Stimulering av celler

1. Resuspender cellene ved 2x10 ⁶ per tilstand i RPMI 1640 inneholdende 10% humant serum supplert med 50 IU penicillin, 50 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES,sto for 500 mL per tilstand.
2. Delmengde 500 pl av cellesuspensjonen pr FACS rør.
3. Avhengig av hvilken vei undersøkt, tilsett PD-L1, IL-10Rα blokkerende antistoffer, og / eller isotype kontroller ved 10 pg / ml og inkuberes i 15 min ved 37 ° C, 5% _CO2.
4. Stimuler-celler med en HIV-1 Gag peptid bassenget ved 1 pg / ml / peptid-sluttkonsentrasjon. Inkluderer også en "ingen stimulering" kontroll for hver blokkering tilstand. Inkuber ved 37 ° C, 5% _CO2 i 48 timer.

Tre. Innsamling og analyse av Supernatant

1. Etter 48 timer, spinne ned FACS rør for 7 minutter ved 340 RCF.
2. Samle forsiktig 2 x 225 mL supernatant i Eppendorf rør for Luminex perle arrays uten å forstyrre pelleten.
3. Inaktivere virus i den oppsamlede supernatant med 25 ul 0,5% Tween-PBS for å gi en sluttkonsentrasjon på 0,05% PBS-Tween.
4. Oppbevar samlet Supernatantene som ikke immediately brukt i en -80 ° C fryser.
5. Mål ønskede Cytokinkonsentrasjoner hjelp Millipore Luminex kit i henhold til produsentens protokoll.

4. Innsamling og fenotypeanalyser av celler via flowcytometri

1. Etter å samle supernatant, vaske cellene i 3 ml PBS. Spin-celler i 7 min ved 340 RCF og dekanter overskytende vaske.
2. Stain for levedyktighet ved hjelp av en LIVE / DEAD Fixable død celle Stain Kit i henhold til produsentens protokoll.
3. Vask celler i PBS i 7 min ved 340 RCF og ved 4 ° C. Resuspender i 100 pl PBS-1% FBS.
4. Hvis fargingen for monocytter og andre antigen-presenterende celler, blokkere Fc-reseptorer ved tilsetning av 1,4 mL av FcR blokkering reagens og vortex å blande.
5. Inkuber i 10 min ved 4 ° C.
6. Legg overflate antistoffer, vortex, og inkuber i 20 min ved 4 ° C i mørket.
7. Vask cellene med PBS 1% FBS, dekanter overflødig vask, og tilsett 200 mL 4% paraformaldehyde. Inkuberved romtemperatur i 20 min i mørket.
8. Vask cellene med PBS 1% FBS, resuspender i 250 mL PBS 1% FBS, og tilegne seg på en multilaser flowcytometer (f.eks BD LSRII eller Fortessa).

5. Analyse av celler via QRT-PCR

1. For cellene ikke analysert via flowcytometri: etter supernatant samling, lyse celler i 300 mL Qiagen Buffer RLT inneholder 1% beta-mercaptoethanol. Hvis ikke fortsetter med protokollen, kan cellene bli frosset ved -80 ° C etter dette punkt.
2. Isolere RNA ved hjelp av en RNA isolering kit følge produsentens protokoll.
3. Syntetisere cDNA fra RNA ved hjelp av et cDNA syntese kit følge produsentens protokoll.
4. Utfør kvantitativ PCR hjelp SYBR Grønn teknologi.
5. Opprett en primerblanding for hver primer anvendes inklusive husholdningsgener (for eksempel IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) ved tilsetning av primer til nuclease-fritt vann for å gi en sluttkonsentrasjon på 10uM. Hold på is.
6. Lag en master mix for hver primer ved å legge til 10,5 mL nukleasefritt vann, 12,5 mL SYBR grønt, og en ul primerblandingen per plate også. Hold på is.
7. Pipetter 24 mL konsentrat-blanding til hver brønn av platen som skal brukes.
8. Til 1 pl cDNA til hver brønn i henhold til malen.
9. Cap brønner og sentrifuger plate for tre minutter ved 800 RCF.
10. Kjør plate på en QRT-PCR-maskin, f.eks en Stratagene MX3005P instrument.

6. Tilpasning for Intracellulær cytokin Farging på 48 hr

Legg Brefeldin og Monensin 6 timer før intracellulær cytokin flekker. Brefeldin blir tilsatt ved en konsentrasjon på 10 mikrogram / ml, mens Monensin tilsettes i henhold til produsentens instruksjoner. For enkelhets skyld kan Brefeldin tilsettes 12 t før å farge ved en konsentrasjon på 5 pg / ml.

1. Etter overflaten flekken, vaske cellene med PBS 1% FBS og beis for itracellular cytokiner slik som IL-12, IFN-γ, og TNF-α ved hjelp av en fiksering / Permeabilization løsningssett og protokoll.
2. Vask cellene, resuspender i 250 mL PBS 1% FBS, og kjøre på en multilaser flowcytometer (f.eks BD LSR II eller Fortessa).

7. Tilpasning for sortering Cells

1. 16 timer etter stimulering, beis for levedyktighet ved hjelp av LIVE / DEAD Fixable død celle Stain Kit i henhold til produsentens protokoll. Hold celler på isen under hele prosedyren.
2. Vask cellene med PBS i 7 min ved 340 RCF og ved 4 ° C. Resuspender i 100 pl PBS-1% FBS.
3. Legg overflateantistoffer, vortex å blande og inkubere cellene på is i mørket i 20 min.
4. Vask cellene med PBS 1% FBS ved 340 RCF og ved 4 ° C og resuspender i 500 pl kald RPMI 1640 inneholdende 10% fetalt bovint serum supplert med 50 IU penicillin, 50 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES.
5. Filtrer celler ved hjelp av 5 ml polystyrenRene rundbunnet Tube med Cell-Sil cap.
6. Forbered prøverør for slag ved å tilsette 200 pl RPMI 1640 inneholdende 10% fetalt bovint serum supplert med 50 IU penicillin, 50 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES til hvert rør. Hold alle rørene på is under slag.
7. Levende sortere celle undergrupper av interesse på et instrument (for eksempel BD FACS Aria II) ligger i et anlegg utstyrt for biologisk farlig materiale.
8. Etter cellene har blitt sortert, sted celler tilbake i inkubatoren for ønsket mengde tid og følge med supernatant samling / Luminex analyse og cellepellet samling / PCR-analyse.

Representative Results

Når det utføres målinger cytokin ved hjelp av denne in vitro-system, er det vesentlig å kunne skille de antigen-spesifikke responser sammenliknet med ingen stimulering kontroll. Generelt, vi betraktet positiv respons som noen verdier av den antigene stimulering som gir i det minste tre-fold økning i cytokin-nivåer sammenlignet med ingen stimulering kontroll og som var innenfor det lineære området av analysen. Vi bruker høy følsomhet perle array-analyser som kan oppdage konsentrasjoner av cytokiner så lavt som 0,16 pg / ml, slik at vi kan observere svake antigen-spesifikke CD4 T-cellerespons. Prøver ble kjørt i duplikat for å sikre at nøyaktige verdier oppnås. Figur 2A viser at for IFN-γ produksjon, kan analysen detektere en median på 800-gangers økning i forhold til uten stimulering. Disse verdiene avhenger av cytokiner ble testet på grunn av en eller annen av dem, slik som IL-13 og IL-2, og lavere verdier sammenlignet med ingen stimulering skalholdes. En lignende tilnærming gjelder for transkripsjons profilering av mRNA fra forskjellige cytokiner tester. Figur 2B viser nivået av mRNA for IFN-γ som er økt betydelig (mer enn tre ganger) etter stimulering. Med denne måling, er det en sterk korrelasjon mellom IFN-γ protein sekresjon og IFN-γ mRNA nivåer (figur 2C). Selv om vi utviklet denne in vitro tilnærming for å studere HIV-spesifikke CD4 T-celle funksjon, har vi også med hell brukt denne tilnærmingen for å evaluere effekten av PD-L1 og / eller IL-10Rα blokade på CD4 T-cellerespons etter stimulering med SEB, anti-CD3/CD28, CMV lysatet og RD-1 peptider fra Mycobacterium tuberculosis (data ikke vist). Denne metoden kan brukes til å vurdere responser til bakterielle antigener, inkludert vaksineinduserte responser, like godt. Figur 2D viser at stimuleringen med HIV-gag resulterer i høyere IFN-γ sekresjon mens stimulering med Tetanus toxoid resulterer i høyere IL-13 sekresjon, som viser de ulike cytokin profilen til hiv og stivkrampe-spesifikke CD4 T-cellerespons.

En stor styrke av denne analysen er evnen til å detektere forskjeller i cytokin sekresjon etter antistoff manipulering av inhibitoriske veier som ikke oppdages av andre in vitro prøver som ICS. Det bør bemerkes at noen av cytokiner, slik som IL-2, kan bli konsumert av celler slik målinger i supernatanten, kan potensielt undervurdere cytokin nivåer produsert. Av denne grunn bør eventuelle forskjeller i cytokin sekresjon observert etter antistoff blokade kan også bekreftet på mRNA-nivå for å evaluere hvorvidt de observerte forskjellene skyldes forandringer i en per celleproduksjon. Figur 3A viser virkningen av en PD-L1 blokkerende antistoff på IFN -γ og IL-2 sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler etter 48 timers stimulering med beslektet antigen. Blokade av PD-1 pathway vanligvis ikke har enbetydelig effekt på cytokin-sekresjon uten antigen stimulering, men øker IFN-γ og IL-2 sekresjon når cellene blir stimulert med HIV-1 Gag peptid bassenger. Når CD3 celler er tømt fra PBMC, er det ingen IFN-γ eller IL-2 som produseres i respons til antigen stimulering (figur 3B) som indikerer at sekresjon av IFN-γ og IL-2 fremkalles som reaksjon på HIV-spesifikke CD4 T celle antigen-spesifikk stimulering. For enkelte cytokiner, slik som IL-21, blir følsomheten til kule arrays tillater ikke påvisning av protein-nivåer etter svake antigen-reaksjoner slik som HIV. For disse cytokiner, kan kvantifisering av mRNA bli utført i stedet ^12.

Noen cytokiner, for eksempel IFN-γ og TNF-α, kan fremstilles ved en rekke celleundersett. Ved utførelse av forsøk med CD8-utarmet PBMC, er det noen ganger vanskelig å identfy kilden til proteinutskillelse, og derfor er det vanskelig å identifisere celleundersett som ansvarded til blokade av de inhiberende molekyler. På grunn av dette har vi utviklet en variant av denne fremgangsmåte for å utføre en mer grundig undersøkelse av virkningen av å blokkere inhibitoriske molekyler på cytokin sekresjon ved å sortere ulike celleundersett i henhold til deres fenotypiske egenskaper. Figur 4 viser virkningen av PD-1-blokade på IFN -γ og IL-2 utskilt av sorterte CD4 T-celler. For dette forsøk ble CD8-utarmet PBMC stimulert i 12 timer i nærvær av en blokkerende PD-L1 antistoff eller et isotype-kontroll. Etter 12 timer, ble cellene farget med overflaten fluorescerende antistoffer og CD4-T-celler ble sortert ved hjelp av et strømningscytometer cell sorter. Sortert CD4 T-celler ble deretter inkubert ytterligere i 36 timer og cytokiner ble målt i supernatanten ved hjelp av kule matriser som beskrevet ovenfor. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen i det siste for å sortere CD4 T-celler i henhold til deres nivå av PD-1 uttrykk og har vist at PD-L1 blokade kan gjenopprette funksjon av HIV-sp ecific CD4 T-celler som uttrykker høye nivåer av PD-1 ^12.

Antallet immunoregulatory trasé identifisert som styrende T celle funksjon i HIV-infeksjon er stadig økende. Vi har med hell brukt denne analysen i det siste for å vise effekten av IL-10 blokade på IFN-γ og IL-2 sekresjon av HIV-1-spesifikke CD4 T-celler ^8,13. En av fordelene med denne fremgangsmåte er evnen til å evaluere hvor immunoregulatoriske molekyler regulere samspill av HIV-spesifikke CD4 T-celler med antigen-presenterende celler (APCer). Figur 5A viser virkningen av IL-10-blokade om gjenoppretting av IL-12 sekresjon fra antigen-presenterende celler. Med en tilpasning av denne teknikken, ved å utføre ICS på 48 timer etter stimulering, var vi i stand til å vise at monocytter er hovedkilden til IL-12 etter stimulering med HIV-1 Gag peptid bassenger (Figur 5B).

e en "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk fremstilling av metodikken. Isolert CD8-utarmet PBMCs fra HIV-infiserte forsøks inkuberes i 15 minutter enten med isotype kontroll antistoffer eller blokkerer antistoffer mot PD-L1 eller IL-10Rα. Etter en 48 timers stimulering med en HIV-1 Gag peptid basseng, er supernatants samlet for målinger av cytokin sekresjon med perle arrays og celle pellets samles enten for fenotypeanalyser ved hjelp av flowcytometri eller transcriptional analyse av mRNA nivåer ved hjelp QRT-PCR.

Figur 2. Påvisning av antigen-spesifikke T-celleresponser med mRNA eller proteinutskillelse. A: CD8-utarmet PBMC stimulert med en HIV-1 Gag peptid bassenget. IFN-γ sekresjon ble målt ved 48 timer etter stimulering B:. IFN-γ mRNAble målt med QRT-PCR i celle pellets ved 48 timer etter stimulering C:. Korrelasjon av IFN-γ konsentrasjon i supernatanter med IFN-γ mRNA nivåer. D:. Sammenligning av IFN-γ og IL-13 protein nivåer mellom CD8-utarmet PBMC stimulert med HIV-1 Gag peptid bassenget eller Tetanustoksoid Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Endringer av cytokin sekresjon etter manipulering av inhibitoriske trasé er CD4 T-celle-avhengige A og B:. CD8 utarmet eller CD3 utarmet PBMC stimulert med en HIV-1 Gag peptid bassenget i nærvær av isotype kontroll-eller PD-L1 blokkerende antistoff. IFN-γ og IL-2 sekresjon ble målt ved 48 timer etter stimulering.

Figur 4. Sortering CD4 T-celler til å gjenkjenne cytokin sekresjon etter manipulering av PD-1-blokade. AB: CD8-utarmet PBMC fra tre kronisk infiserte, ubehandlede forsøkspersoner ble inkubert med en HIV-1 Gag peptid basseng eller venstre ustimulert i 12 timer i nærvær av isotype kontroll-eller PD-L1 blokkerende antistoff. CD4 T-celler ble så merket ved negativt lineage uttrekk på lymfocyttene og inkubert videre i 36 timer.

Figur 5. Samspillet mellom CD4 T-celler og antigen-presenterende celler. A: CD8-utarmet PBMC ble stimulert med en HIV-1 Gag peptid bassenget i nærvær av isotype kontroll-eller IL-10Rα blokkerende antistoff. IL-12-nivåer i supernatanten ble målt ved 48 timer etter stimulering B.:CD8-utarmet PBMC stimulert med en HIV-1 Gag peptid bassenget. IL-12 på monocytter sekresjon ble målt med ICS ved 48 timer etter stimulering.

Discussion

Supernatant samlingen er en viktig del av denne eksperimentelle design. Ved høsting av supernatanter for Luminex analyse ble alikvoter tatt opp og holdt ved -80 ° C for å hindre protein nedbrytning på grunn av fryse-tine-sykluser. Frysing og tining kan være tøffe prosesser for proteiner, og ved å minimere fryse-tiner, vil signalet bli maksimert i analyser. Derfor er det lettere å oppnå mer nøyaktige og repeterbare data ved arbeid fra alikvoter som er blitt fryse-tinte det samme antall ganger.

Vi har tidligere utført kinetisk analyse av cytokin sekresjon og mRNA nivåer etter stimulering med HIV-Gag peptid bassenger ^12. Basert på disse kinetikk, valgte vi den 48 hr tidspunkt å utføre cytokin sekresjon målinger. Gitt forskjellene observert mellom mRNA og protein sekresjon samt mellom ulike stimuli, er det viktig at forskere utføre sin egen bevegelsesanalyser avhengig av stimulide bruker og om de er måle mRNA uttrykk eller protein cytokin sekresjon.

Når celle undergrupper sorteres (ved hjelp av tilnærming er vist i figur 3), er det viktig å justere volumet av kulturen i henhold til cellenummer sortert. I standard analysen, vi vanligvis ruge 1 million CD8-utarmet PBMCs i 500 mL av medium. Men når vi sorterer celle undergrupper, for eksempel CD4 T-celler, vi vanligvis sorterer opptil 100.000 celler. Av denne grunn reduseres vi volumet av mediet til 200 pl for å unngå å fortynne cellene og for å oppnå et cytokin konsentrasjon som er detekterbart med vulsten array. For hvert eksperiment, bør volumet av cellekulturer bli eksperimentelt testes, under hensyntagen til den celletypen, cellenumrene sorteres, cytokinet av interesse, og følsomheten av deteksjonen kit.

Et annet viktig aspekt når du utfører Luminex analysen er virus inactivatipå. Virus må inaktiveres for å være i stand til trygt å kjøre prøvene på instrumentet. Tween-20 ble benyttet av denne grunn. Tidligere hadde andre vaskemidler blitt testet for dette formål. Forskjellige fortynninger av 0,5% Tween, 5-10% Triton, og vaskebuffer ble tilsatt til HIV-infiserte celler og ble testet mot noninactivated celler. Tween ble funnet å inaktivere viruset beste samtidig forstyrrer det minste med de foretatte analyser.

Ved utførelse av strømningscytometri, et viktig trinn ved farging for monocytter er å blokkere Fc-reseptor med en Fc-blokkerende reagens for å forhindre ikke-spesifikk binding av monoklonale antistoffer. De Fc-reseptoren er til stede på overflaten av antigen-presenterende celler og binder seg til Fc-regionen av antistoffer. Hvis denne reseptoren ikke er blokkert før fargingen, kan monoklonale antistoffer som er tilsatt for å målrette spesifikke markører i stedet bindes til denne reseptoren, og derfor gir et falskt positivt resultat. Dette er spesielt viktig å unngå når analyserecytokiner som stammer fra en bestemt celletype, for ikke å blokkere denne reseptoren kan være skadelig for resultatet. Rugende celler i media med humant serum kan også hjelpe med dette problemet, så er det store mengder av IgG i serum som binder seg til Fc-reseptoren.

Selv Luminex assays gi mer følsom påvisning enn ICS-assays, kan visse effektor-molekyler slik som IL-21 eller perforin er fremdeles vanskelig å detektere med denne metoden. Denne in vitro tilnærmingen gjør det mulig for transcriptional analyse ved hjelp QRT-PCR som gir større følsomhet i å oppdage andre effektor molekyler.

En begrensning av vår eksperimentelle tilnærmingen er at tolkningen av resultatene er vanskelig når cytokin av interesse er produsert av ulike celle undergrupper fra den heterogene blanding av leukocytter stede i hele PBMC eller CD8-utarmet PBMCs. For eksempel er dette tilfellet for cytokin IL-10, som er oppregulert på annen celle types i innstillingen av progressiv HIV sykdom ^åtte. Sortering av befolkningen av interesse før videre inkubasjon og innsamling av supernatants er en alternativ tilnærming vi har med hell brukt i denne sammenhengen.

Oppsummert teknikkene presentert i denne papiret gir en pålitelig metode for å måle gjenopprettelse av cytokin produksjon av HIV-spesifikke CD4-eller CD8-T-celler i nærvær av blokaden av PD-L1-og IL-10 immunoregulatoriske baner. Disse teknikkene kan bli anvendt i tilfeller hvor cytokiner ikke er lett detekterbare ved flowcytometri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Human Serum AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30 001 CI
L-glutamine	Mediatech	25 005 CI
HEPES buffer	Mediatech	25060CI
FcR blocking reagent, human	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail	Stem Cell	15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ primer	Invitrogen		FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG