Summary
我们开发了一种体外测定，调查免疫调节途径中的细胞因子分泌的HIV特异性CD4 + T细胞的调节中的作用。
Abstract
T细胞耗竭是在慢性病毒感染的主要因素未能病原清除。免疫调节途径，如PD-1和IL-10，被上调时这种持续抗原暴露，并有助于损失扩散，降低溶细胞功能，并削弱细胞因子的产生由CD4和CD8 T细胞。在LCMV感染的小鼠模型中，封闭抗体对抗这两种途径增强T细胞应答的管理。然而，目前还没有在体外测定来测量这类封锁对细胞因子分泌的人类样本的影响在细胞。我们的协议与实验方法使我们能够准确，有效地量化因子的产生由艾滋病毒感染者HIV特异性CD4 + T细胞的恢复。
在这里，我们描述了体外实验的设计，使细胞因子分泌的测量由HIV特异性CD4 + T细胞及其对其他CEL的影响升子集。 CD8 + T细胞从全血耗尽，剩下的外周血单核细胞经聚蔗糖分离方法分离。 CD8贫化的PBMC再孵育阻断抗体对PD-L1和/或IL-10Rα，并刺激与HIV-1 Gag肽池后，将细胞培养在37℃，5％CO 2。 48小时后，弃上清，用有孔玻璃珠阵列和细胞沉淀收集的细胞因子分析，使用流式细胞术或转录分析利用定量RT-PCR方法收集或表型分析。如需更详细的分析，不同的细胞群从外周血单个核细胞选择性的子集枯竭或使用流式细胞仪正在评估在相同的实验前分选获得的。这些方法提供了一个高度敏感和特异的方法由抗原特异性T辅助细胞以确定细胞因子产生的调节，并确定免疫细胞的不同种群之间的功能性相互作用。
Introduction
在持续的病毒感染，病毒特定的T细胞获得被称为T细胞耗竭过程的功能缺陷。早在慢性病毒感染的小鼠LCMV模型的体内研究表明，耗尽病毒特异性T细胞具有降低溶细胞功能针对病毒感染的细胞，失去它们的增殖能力和减少容量，以产生细胞因子如IL-2，TNF-α α和IFN-γ1,2。免疫途径，如PD-1和IL-10的一个复杂的网络，在慢性感染上调，促进T细胞功能障碍（在3,4审查）。 在封闭抗体对这些抑制途径在LCMV小鼠体内给药模型恢复耗尽病毒特异性T细胞的功能和增强的病毒清除率，表明T细胞耗竭是部分可逆的现象（在5评论）。
在日的调查结果ËLCMV模式被迅速推广到人类慢性病毒感染，如乙肝，丙肝和艾滋病病毒5。在慢性HIV-1感染，PD-1和IL-10途径的上调在感染的受试者和疾病进展的参数相关联，并直接与病毒载量成反比与CD4计数6-8。对PD-1或IL-10途径的 HIV-特异性CD4和CD8 T细胞的体外增殖恢复表明，类似于LCMV小鼠模型，在人体T细胞耗竭是部分可逆的现象的抗体阻断。然而，由于对人的样品实验微妙的性质以及在体外试验中，通过这些措施达到的功能恢复访问彻查的灵敏度局限性是显着存在。增殖试验已经，到目前为止，唯一可靠的体外测定在大多数研究中进行测试，但是有一个显着的证据不足对这些相互的影响关于干预措施：细胞毒性T细胞的1）的杀灭能力，2）T细胞对病毒复制的抗病毒效果，3）的细胞因子分泌的空间，以及4）对其他细胞亚群的CD4 T细胞的辅助作用。
细胞内细胞因子染色（ICS）是一种非常有用的和广泛使用的流式细胞仪为基础的检测，用于检测在小鼠和人类的各种细胞类型的细胞因子的产生。它也被用于研究抑制途径的抗体阻断的效果。在ICS的分析，细胞因子分泌受阻，加入菌素和/或莫能菌素的。细胞因子被困在细胞内，然后与用多色流式细胞术荧光抗体检测。该测定法的持续时间通常限制在抗原刺激后6或12小时，因为这两个布雷菲尔德菌素和莫能菌素，它们通常在2小时内抗原另外的添加，是对细胞有毒。 ICS的试验是一个强大的技术，一直是我非常有用n个封闭抗体干预在细胞一段时间抗体暴露后9提取后的小鼠体内给药的效果进行调查。但是，也有对本实验方法的应用来评估抑制性受体人样品中的封锁的影响一些局限性。当执行抑制途径的体外一个6或12小时的刺激（通常与人类样本的情况下）抗体干预，抑制性受体在大多数情况下的封锁如通过标准测定法ICS测量不改变反应的抗原特异性T细胞的频率6，7。每个细胞的细胞因子产生的作为由平均值或中位数荧光强度测量结果已经给出不一致的结果，6，7，10。另一方面，ICS时后在一晚的时间点进行刺激（ 即 6天），改变细胞因子分泌的c数英语学习者可以观察到。不同之处的改变增殖，存活，并积累在一段6在指定期间内效应器功能变化的综合结果。以部分地克服这些局限性的一种方法是孵育时间较长（ 例如 36小时，60小时等 ），与另外的细胞因子分泌阻断前的抗原，而无需等待扩散发生。我们已经成功地使用这种方法，通过HIV-特异性CD4和CD8 T细胞11,12，以确定细胞因子分泌的动力学，但是，这种方法是不能够检测到小的反应，也不会给予的总细胞因子的分泌产生的积分结果因为刺激。因此，ICS是不是足够敏感的方法检测抑制通路的阻断对细胞因子与细胞因子mRNA的定量或分泌细胞因子的测量在supernatan相比，由活化的T细胞产生量的影响吨在同一时间点。此外，大多数由活化的T细胞产生的细胞因子，通过促进或正或负反馈作用的自分泌方式循环通过与抗原呈递细胞相互作用。因此，除了菌素或莫能菌素的ICS测定期间防止细胞因子的分泌，因而T细胞的刺激不是最佳的。最后，检测多种细胞因子与ICS的是由可用的和抗体的灵敏度进行检测的细胞因子流式细胞术，以及通过荧光染料，可以同时使用在任何给定的面板的数目的限制的限制。
我们开发了一种高度灵敏的体外试验方法，评价在由HIV特异性CD4 + T细胞调节细胞因子的分泌，并随后CD4辅助抗原呈递细胞（APC）和自然杀伤细胞（NK细胞）免疫途径的影响。此方法也可用于评估IMPA克拉消耗者从外周血中CD4 + T细胞，或通过与最优肽只能由CD8 + T细胞识别上的刺激CD8 + T细胞功能的抑制分子的封锁。相反，细胞内细胞因子染色测定法，我们决定不与细胞因子分泌的HIV特异性CD4 + T细胞干预，以便能够：1）执行所产生的细胞因子水平的更精确的量化; 2）调查更广的面板细胞因子或效应分子，以及3）评价由HIV特异性CD4 + T细胞上的其他细胞亚群产生的细胞因子产生的影响。我们刺激CD8耗尽外周血单个核细胞，在封闭抗体对感兴趣的免疫调节途径的存在HIV-1 Gag肽池。孵育后，通常48小时所需要的时间，我们收集上清液测定细胞因子的分泌与磁珠阵列和收集细胞沉淀无论是对不同的细胞亚群的表型分析或转录分析。的注意，在t其48小时的时间点，不检测增殖T细胞12的显著人口。这是一种灵活的方法，该设计的几个适配可以应用于解决不同的假设。例如，单独的细胞亚群（如HIV特异性CD4 + T细胞或PD-1的高CD4 + T细胞， 等等 ）可以在进一步孵育36小时，然后收集上清液和细胞沉淀物的12小时温育后进行排序调查更具体的封锁措施对细胞因子分泌的外周血单个核细胞亚群定义的影响。
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Protocol
1。通过聚蔗糖分离耗竭和外周血单个核细胞的分离
- 通过将人类CD8 +耗竭鸡尾酒在全血50微升/毫升耗尽CD8 + T细胞。
- 拌匀，静置20分钟，在室温（18-25℃）。
- 培养结束后，混合全血用HBSS（Hank平衡盐溶液不含Ca 2 +或Mg 2 +）和层以上的Histopaque。转速为340 RCF 30分钟（无刹车，缓慢加速）。
- 收集的PBMC并转移到新的50ml的锥形。洗涤2倍用45ml的RPMI 1640在340相对离心力纺纱10分钟添加50 IU青霉素，50微克/毫升链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1％HEPES。
2。抗体阻断和细胞的抗原特异性刺激
- 重悬的细胞以2×10 6每条件的RPMI 1640含10％人血清白蛋白补充有50 IU青霉素，50微克/毫升链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1％HEPES，占每股条件500微升。
- 分装500μl的FACS管细胞悬液。
- 根据调查的路径，添加PD-L1，IL-10Rα阻断抗体和/或同种型对照在10微克/毫升孵育15分钟，在37℃，5％CO 2。
- 刺激细胞与1微克/毫升/肽终浓度的HIV-1 Gag肽池。还包括一个“无刺激”控制每个阻塞状态。在37℃，5％CO 2的48小时。
3。收集和上清液分析
- 48小时后，降速FACS管中在340 RCF 7分钟。
- 仔细收集在Eppendorf管中进行的Luminex的珠子阵列2×225微升上清，而不会干扰颗粒。
- 灭活病毒中收集的上清液用25微升0.5％PBS-吐温，得到0.05％PBS-吐温的最终浓度。
- 店收集上清液是不是立即数iately用在-80℃下冷冻。
- 根据制造商的方案使用Millipore公司的Luminex试剂盒测量所需的细胞因子浓度。
4。收集和细胞的表型分析通过流式细胞仪
- 收集上清液后，3毫升PBS洗涤细胞。旋转细胞7分钟在340 RCF，倒出多余的洗。
- 染色使用根据制造商的协议的LIVE / DEAD固定式死细胞染色试剂盒生存能力。
- 在340相对离心力，并在4℃下进行7分钟的PBS洗涤细胞重悬在100μlPBS中的1％FBS中。
- 如果加入1.4微升的Fc受体阻断剂和旋涡混合染色的单核细胞或其他抗原呈递细胞，阻断Fc受体。
- 孵育10分钟，在4℃下
- 添加表面抗体，漩涡，并在黑暗中孵育20分钟，在4°C。
- 用PBS 1％FBS洗涤细胞，倒出多余的冲洗，并加入200微升4％多聚甲醛。孵化在室温下20分钟在黑暗中。
- 用PBS 1％FBS重悬在250μl的PBS中的1％FBS洗涤细胞，并获得在MULTILASER流式细胞仪（ 例如 BD LSRII或Fortessa）。
5。通过定量RT-PCR检测细胞分析
- 对于细胞通过流式细胞仪分析未：收集上清液后，裂解细胞在300微升含1％β-巯基乙醇Qiagen公司RLT缓冲。如果不与协议持续，细胞可在-80℃这一点后冷冻。
- 使用RNA提取试剂盒，按照制造商的方案提取RNA。
- 使用cDNA合成试剂盒，按照制造商的方案从RNA合成cDNA。
- 使用SYBR Green技术进行定量PCR。
- 创建一个引物混合物用于通过将引物与不含核酸酶的水，得到10的终浓度使用，包括管家基因（ 例如 IL-13，IL-10，IFN-γ，GAPDH）的各引物微米。置于冰上。
- 加入10.5μL无核酸酶水，12.5微升SYBR绿，每盘1μl引拌匀创建一个主结构为每个引物。置于冰上。
- 移液器24μl反应混合液到将要使用的板的各孔中。
- 加入1μl的cDNA，以每孔根据模板。
- 盖上井和离心机板3分钟在800 RCF。
- 一个实时荧光定量PCR仪， 例如一个Stratagene公司MX3005P仪器上运行的板块。
6。适应于内细胞因子染色在48小时
添加并菌素莫能菌素6小时前细胞内细胞因子染色。布雷菲尔德菌素加入，以10微克/ ml的浓度而莫能根据制造商的说明被添加。为方便起见，布雷菲德菌素可加入染色在5微克/毫升的浓度之前12小时。
- 表面染色后，用PBS洗涤细胞1％FBS和污垢在胞内细胞因子如IL-12，IFN-γ，并使用一个固定/透化溶液试剂盒和协议的TNF-α。
- 在250μl的PBS中的1％FBS洗涤细胞，重悬，并在MULTILASER运行流式细胞仪（ 例如 BD LSR II或Fortessa）。
7。为适应单元格排序
- 刺激后，污垢为存活16小时使用根据制造商的方案LIVE / DEAD固定式死细胞染色试剂盒。在整个过程中，细胞置于冰上。
- 用PBS为7分钟，在340相对离心力，并在4℃下洗涤细胞重悬在100μlPBS中的1％FBS中。
- 添加表面抗体，旋涡混合，孵育细胞在冰上避光20分钟。
- 用PBS 1％FBS的340相对离心力，并在4℃下洗涤细胞，并重新悬浮于500μl含有10％胎牛血清冷RPMI 1640中补充有50 IU青霉素，50微克/毫升链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1％ HEPES。
- 使用5毫升POLYSTY过滤单元刘若英圆底管与细胞滤网盖。
- 通过加入含有10％胎牛血清补充了50 IU青霉素，50微克/毫升链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1％HEPES，每管200μl的RPMI 1640中准备收集管中为排序。保留所有试管置于冰上排序过程中。
- 对仪器（ 如 BD FACS咏叹调 二）位于搭载的生物危害性物质的设施感兴趣的细胞亚群现场进行排序。
- 细胞已被排序之后，发生细胞放回培养箱的时间所需的金额，并按照与上清收集/ Luminex公司分析和细胞沉淀收集/ PCR分析。
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Representative Results
当使用这种在体外系统中进行的细胞因子的测量，就必须能够区分相比，无刺激对照的抗原特异性应答。在一般情况下，我们认为是抗原刺激的任何值给比无刺激对照和其中分别测定的线性范围内的至少3倍的细胞因子水平的阳性反应。我们使用高灵敏度微球阵列分析，可以检测出细胞因子低至0.16皮克/毫升的浓度，使我们能够观察到弱的抗原特异性CD4 T细胞应答。样品，以确保所获得的精确值运行一式两份。 图2A表明，对于IFN-γ的生产，该法可检测的800倍的中值相比，无刺激。这些值取决于因对他们中的一些测试的细胞因子，如IL-13和IL-2，较低的值相比，无刺激将被观察到。类似的方法适用于各种细胞因子检测mRNA的转录谱。 图2B显示了mRNA的被刺激后显著增加（超过三倍），IFN-γ水平。用该测定中，存在的IFN-γ蛋白质分泌和IFN-γ的mRNA水平（ 图2C）之间有很强的相关性。即使我们开发了这个体外研究HIV特异性CD4 + T细胞功能的方法，我们也成功地使用这种方法来评估PD-L1和/或IL-10Rα封锁的CD4 + T细胞应答的刺激与SEB后的影响，抗CD3/CD28，巨细胞病毒裂解液和来自结核分枝杆菌RD-1肽（数据未显示）。该方法可用于评估对细菌抗原，包括疫苗诱导的反应，得同样好。 图2D示出了刺激与HIV-Gag的结果在较大的IFN-γ的分泌，同时刺激破伤风toxoid导致在更高的IL-13分泌，这表明HIV和破伤风特异性CD4 T细胞应答的不同细胞因子谱。
此法的主要优势是抗体操控并非由其他体外实验一样ICS检测抑制通路后，检测细胞因子分泌的差异的能力。但应注意的是，某些细胞因子，如IL-2，可通过细胞被消耗所以在上清液中测量可能潜在地低估所产生的细胞因子水平。出于这个原因，在抗体阻断后观察到的细胞因子分泌的任何差异，应也证实在mRNA水平来评估观察到的差异是否由于改变了每个细胞的生产。 图3A示出一个PD-L1阻断抗体对干扰素的影响-γ和IL-2的分泌通过48小时的刺激与同源抗原后的HIV特异性CD4 + T细胞。在PD-1途径封锁通常不具有对细胞因子的分泌显著影响，没有任何抗原刺激而增强的IFN-γ和IL-2的分泌，当细胞受到刺激与HIV-1 Gag肽池。当CD3细胞从外周血单个核细胞耗竭，存在于反应产生对抗原刺激（ 图3B），这表明IFN-γ和IL-2的分泌诱导响应于HIV特异性CD4 + T无IFN-γ或IL-2的细胞抗原特异性刺激。对于某些细胞因子，如IL-21，珠阵列的灵敏度不允许检测蛋白质水平的后弱抗原反应，例如HIV。对于那些细胞因子，可以进行mRNA的定量而不是12。
某些细胞因子，如IFN-γ和TNF-α，可通过多种细胞亚群的产生。当对CD8-耗尽的PBMC的实验中，它有时难以identfy蛋白分泌的来源，并且，因此，它是难以确定的小区子集respon副执行干事的抑制分子的封锁。为此，我们已开发了这种方法的变型来执行的阻断对细胞因子分泌的抑制分子，通过根据它们的表型特征的排序不同细胞亚群的影响的更深入的调查， 图4示出了PD-1的阻断对干扰素的影响-γ和IL-2通过排序的CD4 + T细胞分泌的。在这个实验中，CD8耗尽的PBMC在阻断PD-L1的抗体或同种型对照的存在下刺激12小时。后12小时，将细胞用流式细胞仪的细胞分选器表面染色用荧光抗体和CD4 + T细胞进行了排序。排序的CD4 T细胞，然后再培养36小时，细胞因子如上述那样使用珠阵列测量在上清液中。根据它们的PD-1的表达水平，我们已经成功地使用这种方法，在过去到CD4 + T细胞进行排序并显示，PD-L1阻断可以恢复的HIV-SP的功能 ecific CD4 + T细胞表达高水平的PD-1 12。
确定为HIV感染执政T细胞功能的免疫调节通路的数量正在不断增加。我们已经成功地使用该测定法，在过去显示的IL-10的封锁对IFN-γ和IL-2分泌的HIV-1-特异性CD4 T细胞8,13的影响。一个这种方法的优点是，以评估免疫调节分子如何调节HIV特异性CD4 + T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间的相互作用的能力。 图5A示出的IL-10阻断从恢复的IL-12分泌的影响抗原呈递细胞。使用这种技术的一个改编，由刺激后执行ICS在48小时，我们能够显示，单核细胞是IL-12的刺激与HIV-1 Gag肽池（ 图5B）后的主要来源。
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图1。从HIV感染的受试者的方法。分离CD8-耗尽的PBMC 的示意图孵育15分钟或用同种型对照抗体或阻断抗PD-L1或IL-10Rα。 48小时的刺激与HIV-1 Gag肽池后，收集上清细胞因子的分泌与磁珠阵列和细胞沉淀测量收集无论是用流式细胞仪或使用定量RT-PCR检测mRNA水平的转录分析表型分析。
图2。检测与mRNA或蛋白质分泌抗原特异性T细胞应答。答 ：CD8耗尽的外周血单个核细胞与HIV-1 Gag肽库刺激。 IFN-γ的分泌测量在48小时刺激后B：IFN-γmRNA水平分别在刺激后48小时测量定量RT-PCR检测细胞沉淀C：IFN-γ浓度的上清液用IFN-γmRNA水平的相关性。 D：IFN-γ和IL-13与HIV-1 Gag肽池或破伤风类毒素刺激的CD8耗尽的外周血单个核细胞之间的蛋白质含量比较点此查看大图 。
图3。细胞因子分泌的操纵抑制途径的改变后的CD4 + T细胞依赖的A和B：CD8耗尽或耗尽的CD3刺激的外周血单个核细胞在同种型对照或PD-L1的阻断抗体的存在HIV-1 Gag肽池。 IFN-γ和IL-2的分泌测定在刺激后48小时。
图4。分选CD4 + T细胞操纵的PD-1阻断后，检测细胞因子的分泌。 AB：从3慢性感染，未处理的受试者CD8贫化的PBMC培养与HIV-1 Gag肽池或左未刺激12小时的同种型对照或PD-L1阻断性抗体的存在。 CD4 + T细胞，然后负面血统排除对淋巴细胞筛选，再进一步进行36小时培养。
图5。 CD4 + T细胞和抗原呈递细胞之间的相互作用。答 ：CD8耗尽的PBMC刺激与同型对照或IL-10Rα阻断抗体的存在HIV-1 Gag肽池。 IL-12水平在上清液中测定了48小时的刺激后B。：CD8耗尽刺激外周血单个核细胞与HIV-1 Gag肽池。 IL-12的分泌单核细胞测定与ICS在刺激后48小时。
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Discussion
收集上清液这是实验设计的一个必要组成部分。当收获上清液用于与Luminex测定中，等分试样制作并保存于-80℃，以防止蛋白质降解是由于冻融循环。冻融可以苛刻的进程蛋白质，并通过最小化冷冻解冻，信号将被最大化的检测。因此，它更容易从已冻融的次数相同等份工作时，得到可重复的和更准确的数据。
之前我们已经进行细胞因子的分泌和mRNA水平的动力学分析刺激与HIV-Gag肽池12后。基于这些动力学，我们选择了48小时的时间点来进行细胞因子的分泌量测。给定的mRNA和蛋白分泌以及不同的刺激之间观察到的差异，是非常重要的研究人员自己进行动力学分析，取决于刺激他们使用以及他们是否是测量基因表达或蛋白质分泌细胞因子。
当细胞亚群进行排序（使用图3中所示的方法），其根据小区号码排序来调节培养物的体积是重要的。在标准实验中，我们通常在孵化500微升培养基的100万CD8耗尽外周血单个核细胞。然而，当我们的排序细胞亚群，如CD4 + T细胞，我们通常进行排序多达10万个细胞。出于这个原因，我们降低到中200微升的体积，以保持从稀释细胞，并实现了细胞因子的浓度可检测的微球阵列。对于每个实验，细胞培养物的体积应根据实验测试，考虑到细胞类型，细胞数目来分类的，感兴趣的细胞因子，检测试剂盒的灵敏度。
在进行试验的Luminex时另一个重要方面是病毒inactivati上。病毒需要被灭活，以便能够安全地在仪器上运行样品。 Tween-20中，使用这个原因。先前，其他洗涤剂已被测试用于这一目的。 0.5％吐温，5-10％的Triton和洗涤缓冲液中的各种稀释液加入到病毒感染的细胞及对noninactivated细胞进行了测试。吐温被发现灭活该病毒最好的，而干扰最少，进行测定。
当流式细胞仪进行流动，染色单核细胞时，一个重要的步骤是阻断Fc受体与的Fc阻断剂，以防止单克隆抗体的非特异性结合。该Fc受体是存在的抗原呈递细胞的表面上，并结合到抗体的Fc区。如果这个受体染色前不堵塞，被添加到针对特定标记的单克隆抗体可改为绑定到该受体，因此给人一种假阳性结果。这是特别重要的，以避免分析时细胞因子，从某些细胞类型派生的，因为不阻止这种受体可能是有害的结果。培养细胞中含有人血清的培养基也可以帮助解决这个问题，因为有血清中丰富金额的IgG结合的Fc受体。
虽然的Luminex测定提供更灵敏的检测比ICS测定，某些效应分子，如IL-21或穿孔素仍难以检测用此方法。这种体外方法允许使用定量RT-PCR检测，提供检测等效应分子更大的敏感性转录分析。
我们的实验方法的一个局限是其结果的解释是困难的时候所关注的细胞因子是由存在于整个外周血单个核细胞或CD8耗尽外周血白细胞的异构混合不同的细胞亚群产生。例如，这是针对细胞因子IL-10的上调在不同细胞TY的情况PES在逐行HIV疾病8的设置。前上清液进一步培养和收集有关人口的排序是一种替代方法，我们在这方面已经成功地使用。
综上所述，本文所提出的技术提供了通过测量HIV特异性CD4或CD8 + T细胞修复因子的产生，在PD-L1和IL-10的免疫调节通路的阻断存在的可靠手段。这些技术可以在实例中，其中细胞因子是不通过流式细胞术检测的容易被应用。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢戈登·弗里曼提供抗PD-L1的封闭抗体。我们感谢的临床和实验室工作人员在美国马萨诸塞州总医院和所有的研究参与者在这个项目中的不可估量的作用。
，国家心肺和美国国立卫生研究院血液研究所（RO1 HL-092565; DEK），这项研究是由国家过敏研究所和美国国立卫生研究院（DEK PO1 AI-080192）的传染病支持。 DEK是由魁北克卫生研究基金的研究学者成就奖（FRQS）的支持。 FP是由马萨诸塞州总医院执行委员会的研究和哈佛全球健康研究所（HGHI）的奖学金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
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