Summary
We ontwikkelden een in vitro assay om de rol van immuunregulerende trajecten in de regulatie van cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken.
Abstract
T-cel uitputting is een belangrijke factor in niet pathogeen klaring tijdens chronische virale infecties. Immuunregulerende wegen, zoals PD-1 en IL-10, opgereguleerd na deze voortdurende blootstelling aan antigeen en bijdragen aan het verlies van proliferatie, cytolytische verminderde functie en verminderde cytokine productie door CD4 en CD8 T-cellen. In het muizenmodel van LCMV infectie toediening van blokkerende antilichamen tegen deze twee wegen aangevuld T cel responsen. Er is echter nog geen in vitro test om het effect van deze blokkade op cytokine uitscheiding in cellen van humane monsters te bepalen. Ons protocol en experimentele aanpak zijn wij in staat nauwkeurig en efficiënt te kwantificeren het herstel van de productie van cytokines door HIV-specifieke CD4 T-cellen van HIV-geïnfecteerde patiënten.
Hier, we tonen een in vitro experimenteel ontwerp dat de metingen van cytokine secretie mogelijk maakt door HIV-specifieke CD4 T-cellen en hun impact op andere cell subsets. CD8 T-cellen werden uitgeput uit volbloed en de resterende PBMCs werden geïsoleerd via Ficoll scheidingsmethode. CD8-verarmde PBMC werden vervolgens geïncubeerd met blokkerende antilichamen tegen PD-L1 en / of IL-10Rα en na stimulatie met een HIV-1 Gag peptideverzameling werden cellen geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO2. Na 48 uur werd supernatant verzameld voor cytokine analyse met kralen arrays en celpellets werden verzameld voor of fenotypische analyse met flowcytometrie of transcriptionele analyse met qRT-PCR. Voor meer gedetailleerde analyse, werden verschillende celpopulaties verkregen door selectieve deelverzameling uitputting uit PBMC of door het sorteren met behulp van flowcytometrie alvorens te worden beoordeeld in het zelfde assays. Deze methoden geven een zeer gevoelige en specifieke benadering van de modulatie van cytokinine productie van antigeen-specifieke T-helpercellen en functionele interacties tussen verschillende populaties van immuuncellen bepalen.
Introduction
Tijdens aanhoudende virale infecties, virus-specifieke T-cellen te verwerven functionele stoornissen in een proces dat bekend staat als T-cel uitputting. Vroeg in vivo studies in muizen LCMV van chronische virale infectie aangegeven uitgeputte virus-specifieke T-cellen cytolytische functie verminderde tegen viraal geïnfecteerde cellen verliezen hun vermogen om te prolifereren en vermogen om cytokinen zoals IL-2, TNF-productie verminderde α en IFN-γ 1,2. Een complex netwerk van immuunregulerende paden, zoals PD-1 en IL-10, opgereguleerd tijdens chronische infecties en bijdragen T-cel dysfunctie (besproken in 3,4). In vivo toediening van blokkerende antilichamen tegen deze remmende trajecten in de LCMV muis model herstelde functie van uitgeputte virus-specifieke T-cellen en versterkte virale klaring, wat aangeeft dat T-cel uitputting is een gedeeltelijk reversibel fenomeen (beoordeeld in 5).
Bevindingen op the LCMV model werd snel uitgebreid naar menselijke chronische virale infecties zoals HBV, HCV en HIV 5. Bij chronische HIV-1 infectie zijn PD-1 en IL-10 trajecten opgereguleerd in geïnfecteerde personen en parameters correleren met ziekteprogressie, rechtstreeks bij de virale lading en omgekeerd met de CD4 telling 6-8. Antilichaam blokkade van de PD-1 of IL-10 trajecten in vitro hersteld proliferatie van HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen aangeeft dat, vergelijkbaar met de LCMV muismodel T cel uitputting bij mensen is een gedeeltelijk reversibel fenomeen. Echter, vanwege de delicate aard van experimenten op de menselijke monsters, alsook beperkingen in de gevoeligheid van in vitro assays, grondig onderzoek van het functionele herstel profielen die door deze maatregelen is opvallend afwezig. Proliferatietesten zijn geweest, tot nu toe, de enige betrouwbare in vitro test getest in de meeste studies, maar er is een opmerkelijk gebrek aan bewijs over het effect van deze interinterventies op: 1) het doden capaciteit van cytotoxische T-cellen, 2) het antivirale effect van T-cellen virale replicatie, 3) de cytokine secretie profiel, en 4) het effect op CD4 T-cel hulp van andere cel subsets.
Intracellulaire cytokine kleuring (ICS) is een zeer nuttig en veel gebruikt flowcytometrie gebaseerde test die wordt gebruikt om de productie van cytokinen in verschillende celtypes in zowel muizen als mensen te detecteren. Het is ook gebruikt om het effect van antilichaam blokkade van remmende wegen onderzoeken. In ICS tests wordt cytokine secretie geblokkeerd door de toevoeging van Brefeldine en / of Monensin. Cytokinen opgesloten in de cellen worden vervolgens gedetecteerd met fluorescente antilichamen met polychromatische flowcytometrie. De duur van de test wordt meestal beperkt tot 6 of 12 uur na antigeenstimulatie aangezien zowel Brefeldine en monensine, die typisch worden toegevoegd binnen 2 uur antigeen Bovendien zijn giftig voor de cellen. De ICS-test is een krachtige techniek die nuttig i is geweestn het onderzoek van het effect van in vivo toediening van blokkerende interventie antilichaam in muizen wanneer cellen na een bepaalde tijd na blootstelling antilichaam 9 geëxtraheerd. Er zijn echter verscheidene beperkingen voor de toepassing van deze experimentele aanpak het effect van blokkade van remmende receptoren in humane monsters te evalueren. Bij het uitvoeren antilichaam interventies remmende wegen in een 6 of 12 uur stimulatie in vitro (typisch het geval bij humane monsters), ofwel blokkade van remmende receptoren in de meeste gevallen niet de frequentie reageren antigeen-specifieke T-cellen te veranderen zoals gemeten met standaard ICS assays 6, 7. Metingen van per-cel cytokineproductie gemeten door gemiddelde of mediane fluorescentie-intensiteit hebben inconsistente resultaten 6, 7, 10 gegeven. Anderzijds, wanneer ICS wordt uitgevoerd op een laat tijdstip na stimulatie (bijvoorbeeld zes dagen), veranderingen in het aantal cytokineafscheidende cel kan worden waargenomen. De verschillen zijn een gecombineerd effect van veranderde proliferatie, overleving, en veranderingen in effector functie die zich ophopen in de bepaalde periode 6. Een manier om deze beperkingen te overwinnen gedeeltelijk is incuberen langere tijd (bijvoorbeeld 36 uur, 60 uur, enz..) Met het antigeen vóór de toevoeging van de cytokine secretie blocker zonder te wachten tot proliferatie te voorkomen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om de kinetiek van cytokine secretie bepalen door HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen 11,12, maar deze aanpak is niet in staat om kleine responsen detecteren en zal een geïntegreerd resultaat van de totale cytokine secretie optreedt niet geven Sinds stimulatie. Daarom ICS is niet gevoelig genoeg methode om de impact van blokkade van remmende wegen van de hoeveelheid cytokinen geproduceerd door geactiveerde T-cellen ten opzichte van cytokine mRNA kwantificatie of metingen van cytokine secretie in de supernatan detecterent tegelijkertijd punten. Bovendien, de meeste van de door geactiveerde T-cellen cytokines handelen autocriene wijze bijdraagt aan positieve of negatieve terugkoppelingen door interactie met antigen presenterende cellen. Daarom toevoeging van Brefeldine of monensine gedurende de ICS bepaling voorkomt cytokine secretie en derhalve stimulering van T-cellen niet optimaal. Tenslotte wordt detectie van meerdere cytokinen met ICS beperkt door de beschikbaarheid en gevoeligheid van antilichamen voor de detectie van cytokinen met flowcytometrie en door beperkingen in het aantal fluorochromen die kunnen worden gecombineerd in een bepaald paneel.
We hebben een zeer gevoelige in vitro experimentele aanpak het effect van immuunregulerende trajecten evalueren reguleren cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen en vervolgens CD4 hulp aan antigeen presenterende cellen (APC's) en natuurlijke killercellen (NK-cellen). Deze methode kan ook worden gebruikt om de impa evaluerenct van de blokkade van remmende moleculen op CD8 T-cel functie door het uitputten van de CD4 T-cellen uit PBMC of door het stimuleren van een optimale peptiden die worden alleen herkend door CD8 T-cellen. In tegenstelling tot intracellulaire cytokine kleuring assays, besloten we niet te bemoeien met de cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen om te kunnen: 1) voert een kwantificatie van de cytokine niveaus geproduceerd, 2) onderzoeken breder panel van cytokinen of effector moleculen, en 3) hoe de effecten van cytokinen geproduceerd door HIV-specifieke CD4 T-cellen op andere cel subsets. We stimuleren CD8 verarmde PBMC met een HIV-1 Gag peptideverzameling in aanwezigheid van blokkerende antilichamen voor de immuunregulerende route van belang. Nadat de gewenste tijd van incubatie, gewoonlijk 48 uur, verzamelen we de bovenstaande vloeistoffen te cytokineafscheiding meten met kraal arrays en het verzamelen van de cel pellets hetzij voor fenotypische analyse van de verschillende cel subsets of voor transcriptie analyse. Van de nota, bij tzijn 48 uur tijdstip, we niet een aanzienlijke populatie van delende T-cellen 12 detecteren. Dit is een flexibele aanpak en verscheidene aanpassingen van dit ontwerp kan worden toegepast op verschillende hypothesen pakken. Zo kan de individuele cel subsets (HIV-specifieke CD4 T-cellen of PD-1 hoge CD4 T-cellen, enz..) Worden gesorteerd na 12 uur incubatie voor verdere incubatie gedurende 36 uur gevolgd door verzameling supernatanten en celpellets meer in het bijzonder onderzoeken de impact van de blokkade ingrepen op cytokine secretie door bepaalde subpopulaties van PBMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uitputting en Isolatie van PBMC via Ficoll scheiding
- Afbrekende CD8 + T cellen door menselijke CD8 + Uitputting Cocktail toevoegen van 50 ul / ml volbloed.
- Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C).
- Na incubatie mengen volbloed met HBSS (Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder Ca 2 + of Mg 2 +) en laag over Histopaque. Spin bij 340 RCF gedurende 30 min (geen rem, trage acceleratie).
- Verzamelen PBMC en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische. Wassen met 2x 45 ml RPMI 1640 aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES door spinnen gedurende 10 minuten bij 340 RCF.
2. Antilichaam Blokkade en Antigeen-Specifieke Stimulatie van Cellen
- Resuspendeer cellen bij 2x10 6 per conditie in RPMI 1640 dat 10% menselijk serum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES,goed voor 500 ul per conditie.
- Aliquot 500 pi celsuspensie per FACS buis.
- Afhankelijk van de route onderzochte voeg PD-L1, IL-10Rα blokkerende antilichamen en / of isotype controles bij 10 ug / ml en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
- Stimuleer cellen met een HIV-1 Gag peptide zwembad bij 1 ug / ml / peptide uiteindelijke concentratie. Ook een "geen stimulatie" controle voor elke blokkerende aandoening. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
3. Verzameling en analyse van Supernatant
- Na 48 uur, spin down FACS buizen voor 7 min bij 340 RCF.
- Verzamel zorgvuldig de 2 x 225 pi supernatant in Eppendorf buizen voor Luminex bead arrays zonder de pellet te verstoren.
- Inactiveren virus in het verzamelde supernatant met 25 pi 0,5% Tween-PBS tot een eindconcentratie van 0,05% PBS-Tween geven.
- Store verzameld bovenstaande vloeistoffen die niet IMMEDiately in een -80 ° C vriezer.
- Meet gewenste cytokine concentraties met behulp van Millipore Luminex kit volgens protocol van de fabrikant.
4. Collectie en fenotypische analyse van cellen via flowcytometrie
- Na het verzamelen supernatant, wassen cellen in 3 ml PBS. Spin cellen gedurende 7 minuten bij 340 RCF en giet overtollig wassen.
- Vlek voor levensvatbaarheid met een levende / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Was de cellen in PBS gedurende 7 minuten bij 340 RCF en bij 4 ° C. Resuspendeer in 100 pl PBS 1% FBS.
- Indien kleuring op monocyten of andere antigeen presenterende cellen, blok Fc receptoren door het toevoegen 1,4 ui FcR blokkerende reagens en vortex mengen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Voeg oppervlak antilichamen, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met PBS 1% FBS, decanteren teveel wassen, en voeg 200 ul 4% paraformaldehyde. Broedenbij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker.
- Was de cellen met PBS 1% FBS, resuspendeer in 250 pi PBS 1% FBS, en het verwerven van een multilaser flowcytometer (bijv. BD LSRII of Fortessa).
5. Analyse van de cellen via qRT-PCR
- Voor cellen niet geanalyseerd via flowcytometrie: na de inzameling supernatant, Lyse cellen in 300 pi Qiagen Buffer RLT die 1% beta-mercapto-ethanol. Bij stopzetting met protocol, kunnen cellen bij -80 ° C worden ingevroren na dit punt.
- Isoleer RNA met een RNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Samenstel cDNA uit RNA met een cDNA synthese kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Uitvoeren van kwantitatieve PCR met SYBR Green technologie.
- Een primer mix voor elke primer gebruikt, waaronder huishoudelijke genen (bijvoorbeeld IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) door toevoeging primers voor nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 10 gevenuM. Blijf op ijs.
- Maak een master mix voor elke primer door het toevoegen van 10,5 ul nuclease-vrij water, 12,5 ul SYBR groen, en 1 ui primer mix per plaat ook. Blijf op ijs.
- Pipet 24 pi master mix in elk putje van de plaat die zal worden gebruikt.
- Voeg 1 ul cDNA aan elk putje volgens template.
- Cap putten en centrifuge plaat gedurende 3 min bij 800 RCF.
- Run plaat op een qRT-PCR machine, bijvoorbeeld een Stratagene MX3005P instrument.
6. Aanpassing voor intracellulaire cytokine kleuring in 48 uur
Voeg Brefeldine en Monensin 6 uur vóór intracellulaire cytokine kleuring. Brefeldine wordt toegevoegd in een concentratie van 10 ug / ml terwijl Monensin toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Gemakshalve kan Brefeldine 12 uur vóór vlek bij een concentratie van 5 ug / ml toegevoegd.
- Na aanslag op het oppervlak, wassen cellen met PBS 1% FBS en vlek inextracellulaire cytokinen zoals IL-12, IFN-γ en TNF-α met een fixatie / permeabilisatie oplossing kit en protocol.
- Was de cellen, resuspendeer in 250 pi PBS 1% FBS, en draaien op een multilaser flowcytometer (bijv. BD LSR II of Fortessa).
7. Aanpassing voor sorteren Cellen
- 16 uur na stimulatie, vlek voor levensvatbaarheid gebruik van Live / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit volgens het protocol van de fabrikant. Houd cellen op ijs tijdens gehele procedure.
- Was de cellen met PBS gedurende 7 minuten bij 340 RCF en bij 4 ° C. Resuspendeer in 100 pl PBS 1% FBS.
- Voeg oppervlak antilichamen, vortex mengen en incuberen cellen op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
- Was de cellen met PBS 1% FBS bij 340 RCF en bij 4 ° C en resuspendeer in 500 ul koud RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES.
- Filter cellen met 5 ml polystyreenrene ronde bodem buis met Cell-zeef cap.
- Bereid verzamelbuizen voor sorteren door toevoeging 200 pl RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES aan elke buis. Houd alle buizen op ijs tijdens het sorteren.
- Live-sorteren van de cel subsets van de rente op een instrument (bijv. BD FACS Aria II) gelegen in een voorziening die is uitgerust voor biologisch gevaarlijk materiaal.
- Nadat de cellen werden gesorteerd, plaats cellen terug in de incubator voor de gewenste tijdsduur en volgen verzameling supernatant / Luminex analyse en celpellet verzameling / PCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij de uitvoering cytokine metingen gebruik van deze in vitro systeem, is het essentieel om de antigeen-specifieke responsen in vergelijking met de controlegroep die geen stimulatie onderscheiden. In het algemeen hebben wij rekening positieve reacties als alle waarden van de antigene stimulatie die ten minste drie-voudige toename van cytokinen in vergelijking met de controlegroep die geen stimulatie en waarvan in het lineaire bereik van de test geven. Wij maken gebruik van een hoge gevoeligheid kraal reeks testen die concentraties van cytokinen zo laag als 0,16 pg / ml kan detecteren, waardoor we zwak antigeen-specifieke CD4 T-cel responsen te observeren. De monsters worden in duplo in zodat nauwkeurige waarden worden verkregen. Figuur 2A toont dat voor IFN-γ productie, de test kan een mediaan van 800-voudige toename detecteren in vergelijking met geen stimulatie. Deze waarden zijn afhankelijk van de geteste cytokinen want voor sommige, zoals IL-13 en IL-2, lagere waarden vergeleken met geen stimulatie zalin acht worden genomen. Een soortgelijke benadering geldt voor transcriptionele profilering van de mRNA van verschillende cytokinen testen. Figuur 2B toont het niveau van mRNA voor IFN-γ dat na stimulatie significant verhoogd (meer dan drie keer). Met deze test, is er een sterke correlatie tussen IFN-γ eiwitsecretie en IFN-γ mRNA (figuur 2C). Hoewel we deze in vitro benadering van HIV-specifieke CD4 T-cel functie te bestuderen ontwikkeld, hebben we met succes deze benadering toegepast om het effect van PD-L1 en / of IL-10Rα blokkade van CD4 T cellen na stimulatie met SEB evalueren anti-CD3/CD28, CMV lysaat en RD-1 peptiden uit Mycobacterium tuberculosis (gegevens niet getoond). Deze methode kan worden gebruikt om reacties op bacteriële antigenen, waaronder vaccin geïnduceerde responsen, even goed. Figuur 2D toont dat stimulatie met HIV-Gag resulteert in een grotere IFN-γ secretie beoordelen tijdens stimulatie met Tetanus toxoid resulteert in hogere IL-13 secretie, het aantonen van de verschillende cytokine profiel van HIV en tetanus-specifieke CD4 T-cel responsen.
De kracht van deze test is de mogelijkheid om verschillen in cytokine secretie gedetecteerd na antilichaam manipulatie van remmende wegen die niet worden herkend door andere in vitro als ICS. Er zij opgemerkt dat sommige cytokinen, zoals IL-2, kunnen worden door cellen, zodat metingen in het supernatant mogelijk onderschatten de cytokine niveaus geproduceerd. Daarom moeten verschillen in cytokine secretie waargenomen na antilichaam blokkade worden bevestigd op mRNA niveau te evalueren of de waargenomen verschillen door veranderingen in een per cel productie. Figuur 3A toont het effect van een PD-L1 blokkerende antilichaam op IFN -γ en IL-2 secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen na 48 uur stimulatie met de cognate antigeen. Blokkade van de PD-1 pathway over het algemeen geenaanzienlijk effect op de secretie van cytokinen zonder antigeen stimulatie maar bevordert IFN-γ en IL-2 secretie wanneer de cellen gestimuleerd met HIV-1 Gag peptide pools. Wanneer CD3 cellen uitgeput van PBMC, er geen IFN-γ en IL-2 in antwoord op stimulatie (figuur 3B) dat aangeeft dat uitscheiding van IFN-γ en IL-2 wordt geïnduceerd in reactie op HIV-specifieke CD4 T antigen cel antigeen-specifieke stimulatie. Voor sommige cytokinen, zoals IL-21, ofwel de gevoeligheid van korrelarrays geen detectie van eiwit niveaus na zwak antigeen reacties zoals HIV toelaten. Voor deze cytokinen kan kwantificatie van mRNA plaats 12 worden uitgevoerd.
Bepaalde cytokinen zoals IFN-γ en TNF-α, kan worden geproduceerd door een verscheidenheid van cel subsets. Bij het uitvoeren van experimenten op CD8-verarmde PBMC, is het soms moeilijk om de bron van eiwitsecretie identfy, en daarom is het moeilijk om de cel ondergroep te identificeren die verantwoordelijkded blokkade van de remmende moleculen. Daarom hebben wij een variant van deze werkwijze ontwikkeld om een meer diepgaand onderzoek naar de effecten van het blokkeren remmende moleculen op cytokine secretie door het sorteren andere cel subsets overeenkomstig hun fenotypische kenmerken beantwoorden. Figuur 4 toont het effect van PD-1 blokkade van IFN -γ en IL-2 uitgescheiden door gesorteerde CD4 T-cellen. Voor dit experiment, werden CD8-verarmde PBMC gestimuleerd gedurende 12 uur in aanwezigheid van een blokkerende PD-L1 antilichaam of een isotype controle. Na 12 uur werden de cellen oppervlak gekleurd met fluorescente antilichamen en CD4 T-cellen werden gesorteerd met een flow cytometer cell sorter. Gesorteerd CD4 T-cellen werden vervolgens verder geïncubeerd gedurende 36 uur en cytokinen werden gemeten in de supernatant met kraal arrays zoals hierboven beschreven. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze benadering in het verleden aan CD4 T-cellen te sorteren volgens hun niveau van PD-1 expressie en hebben aangetoond dat PD-L1 blokkade functie van HIV-sp kan herstellen ecifieke CD4 T-cellen die hoge niveaus van PD-1 12 expressie.
Het aantal immuunregulerende routes geïdentificeerd als bestuur T-celfunctie bij HIV-infectie wordt steeds groter. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze bepaling in het verleden het effect van IL-10 blokkade van IFN-γ en IL-2 secretie door HIV-1-specifieke CD4 T-cellen 8,13 vertonen. Een van de voordelen van deze methode is het vermogen om te evalueren hoe immuunregulerende moleculen regelen de interactie van HIV-specifieke CD4 T-cellen met antigeen presenterende cellen (APC's). Figuur 5A toont het effect van IL-10 blokkade op het herstel van IL-12 secretie van antigen presenterende cellen. Bij een aanpassing van deze techniek, door het uitvoeren ICS op 48 uur na stimulatie, konden wij aantonen dat monocyten zijn de primaire bron van IL-12 na stimulatie met HIV-1 Gag peptideverzamelingen (Figuur 5B).
e 1 "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische voorstelling van de methode. Geïsoleerd-CD8 verarmde PBMC HIV geïnfecteerde patiënten worden gedurende 15 minuten of met isotype controle antilichamen of blokkerende antilichamen tegen PD-L1 of IL-10Rα. Na een 48 uur stimulatie met een HIV-1 Gag peptide zwembad, zijn bovenstaande vloeistoffen verzameld voor metingen van cytokine secretie met kraal arrays en mobiele pellets worden verzameld, hetzij voor fenotypische analyse met behulp van flowcytometrie of transcriptie analyse van mRNA niveaus met behulp van qRT-PCR.
Figuur 2. Detectie van antigeen-specifieke T-celreacties met mRNA of eiwit secretie. A: CD8-uitgeputte PBMC gestimuleerd met een HIV-1 Gag peptide zwembad. IFN-γ uitscheiding werd gemeten 48 uur na stimulatie B:. IFN-γ mRNAwerden gemeten met qRT-PCR in cel pellets bij 48 uur na stimulatie C:. Correlatie van IFN-γ-concentratie in supernatanten met IFN-γ mRNA. D:. Vergelijking van IFN-γ en IL-13 eiwit niveaus tussen-CD8 verarmd PBMC gestimuleerd met HIV-1 Gag peptide zwembad of tetanustoxoïd Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Veranderingen van cytokine secretie na manipulatie van remmende paden is CD4 T-cel-afhankelijke A en B:. CD8 verarmde of CD3 verarmd PBMC gestimuleerd met een HIV-1 Gag peptideverzameling in aanwezigheid van isotype controle of PD-L1 blokkerend antilichaam. IFN-γ en IL-2 secretie gemeten 48 uur na stimulatie.
Figuur 4. Sorteren CD4 T-cellen om cytokines te detecteren na manipulatie van PD-1 blokkade. AB: CD8-verarmde PBMC drie chronisch geïnfecteerde, onbehandelde patiënten werden geïncubeerd met HIV-1 Gag peptideverzameling of niet gestimuleerd gelaten gedurende 12 uur in aanwezigheid van isotype controle of PD-L1 blokkerend antilichaam. CD4 T-cellen werden vervolgens negatief geselecteerd door afkomst uitsluiting op lymfocyten en verder geïncubeerd gedurende 36 uur.
Figuur 5. Interactie tussen CD4 T-cellen en antigeen presenterende cellen. A: CD8-verarmde PBMC werden gestimuleerd met een HIV-1 Gag peptideverzameling in aanwezigheid van isotype controle of IL-10Rα blokkerend antilichaam. IL-12 niveaus in het supernatant werd gemeten 48 uur na stimulatie B.:-CD8 verarmd PBMC gestimuleerd met een HIV-1 Gag peptide zwembad. IL-12 secretie van monocyten werd gemeten ICS op 48 uur na stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Supernatant collectie is een noodzakelijk onderdeel van dit experimenteel ontwerp. Bij het oogsten supernatanten van de Luminex test werden monsters gemaakt en bewaard bij -80 ° C tot eiwitafbraak door cycli bevriezen-ontdooien te voorkomen. Invriezen en ontdooien kan hard werkwijzen voor eiwitten en door het minimaliseren van vries-dooi, wordt signaal gemaximaliseerd assays. Daarom is het makkelijker reproduceerbare en nauwkeurige gegevens te verkrijgen bij het werken vanuit monsters die zijn bevroren en ontdooid hetzelfde aantal keren.
We hebben eerder uitgevoerde kinetische analyse van cytokine secretie en mRNA na stimulatie met HIV-Gag peptidepools 12. Op basis van deze kinetiek, kozen we voor de 48 uur tijdstip aan het cytokine secretie metingen uit te voeren. Gezien de waargenomen tussen mRNA en eiwit secretie en tussen verschillende stimuli verschillen, is het noodzakelijk dat onderzoekers voeren hun eigen kinetische analyses naargelang de stimulize gebruiken en of ze meten mRNA-expressie of eiwit cytokine secretie.
Wanneer cel subsets worden gesorteerd (met de in figuur 3 benadering), is het belangrijk om het volume van de kweek te passen aan het aantal cellen gesorteerd. In de standaard assay, we incubeer typisch 1 miljoen CD8 verarmde PBMC in 500 ui medium. Echter, toen we een soort cel subsets, zoals CD4 T-cellen, hebben we meestal te sorteren tot 100.000 cellen. Daarom is het volume van het medium 200 gl daalt het volledig uit het verdunnen van de cellen te behouden en een cytokine concentratie die detecteerbaar met de kraal matrix bereiken. Voor elk experiment, moet het volume van de celkweken experimenteel getest worden, rekening houdend met het type cel, het aantal cellen gesorteerd, de cytokine van belang en de gevoeligheid van de detectie kit.
Een ander belangrijk aspect bij het uitvoeren van de Luminex assay virus inactivatiop. Virus moet worden geïnactiveerd om veilig te kunnen draaien monsters op het instrument. Tween-20 werd voor deze reden. Eerder had andere reinigingsmiddelen getest hiervoor. Verschillende verdunningen van 0,5% Tween, 5-10% Triton en wasbuffer werden toegevoegd aan HIV-geïnfecteerde cellen en werden getoetst noninactivated cellen. Tween bleek de beste virus inactiveren terwijl het minst interfereren met de testen uitgevoerd.
Bij het uitvoeren van flowcytometrie, een essentiële stap bij kleuring op monocyten aan het Fc-receptor met een Fc-blokkerende reagens specifieke binding van monoklonale antilichamen voorkomen. Het Fc-receptor aanwezig is op het oppervlak van antigeen presenterende cellen en bindt aan het Fc-gebied van antilichamen. Als deze receptor niet eerder kleuring wordt geblokkeerd, kunnen monoklonale antilichamen die worden toegevoegd aan specifieke merkers richten plaats binden aan deze receptor, dus waardoor vals-positieve resultaten. Dit is vooral belangrijk te voorkomen bij het analyserencytokinen die voortvloeien uit een bepaald type cel, omdat deze receptor niet blokkeert schadelijk zou kunnen zijn voor de resultaten. Incuberen van cellen in media die humaan serum kan ook helpen met dit probleem, want er zijn grote hoeveelheden IgG in het serum die zich binden aan de Fc-receptor.
Hoewel Luminex testen leveren gevoeliger detectie dan ICS testen sommige effector moleculen zoals IL-21 of perforin nog moeilijk te detecteren met deze methode. Deze in vitro benadering zorgt voor transcriptie analyse met behulp van qRT-PCR die een grotere gevoeligheid bij het opsporen van andere effectormoleculen biedt.
Een beperking van onze experimentele aanpak is dat de interpretatie van de resultaten is moeilijk wanneer de cytokine van belang wordt geproduceerd door verschillende cel subsets van de heterogene mix van leukocyten aanwezig geheel PBMCs of-CD8 verarmd PBMC. Bijvoorbeeld is dit het geval voor de cytokine IL-10 die wordt opgereguleerd in andere cel types in de setting van progressieve ziekte HIV 8. Sorteren van de bevolking van belang voor verdere incubatie en het verzamelen van bovenstaande vloeistoffen is een alternatieve benadering hebben we met succes gebruikt in deze context.
Samengevat, de technieken die in dit document een betrouwbare methode voor het meten herstel van cytokineproductie door HIV-specifieke CD4 of CD8 T-cellen in de aanwezigheid van blokkade van de PD-L1 en IL-10 immuunregulerende paden. Deze technieken kunnen worden toegepast in gevallen waarin cytokinen zijn niet gemakkelijk door flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Gordon Freeman voor het verstrekken van de anti-PD-L1 blokkerend antilichaam. Wij danken de klinische en laboratorium personeel van het Massachusetts General Hospital en alle deelnemers aan de studie voor hun waardevolle rol in dit project.
Deze studie werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten van de National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), de National Heart Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK wordt ondersteund door een Research Scholar Career Award van de Quebec Research Fund Health (FRQS). FP wordt ondersteund door een fellowship subsidie van het Massachusetts General Hospital Uitvoerend Comite voor onderzoek en de Harvard Global Health Institute (HGHI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
References
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
- Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
- Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
- Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
- Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
- Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
- Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).
