In vitro-analys för att utvärdera effekten av immunPathWays på HIV-specifika CD4 T-cell effektorfunktion

Summary

Vi utvecklade en in vitro-analys för att undersöka vilken roll immun vägar i regleringen av cytokin sekre av HIV-specifika CD4 T-celler.

Abstract

T-cell utmattning är en viktig faktor i misslyckades patogen clearance vid kroniska virusinfektioner. Immunoreglerande banor, t.ex. PD-1 och IL-10, uppregleras på denna pågående antigenexponering och bidrar till förlust av proliferation, reducerad cytolytisk funktion och försämrad cytokinproduktion av CD4-och CD8-T-celler. I den musmodell av LCMV infektion, administration av blockerande antikroppar mot dessa två vägar augmented T-cellsvar. Det finns dock för närvarande inga in vitro-analys för att mäta effekten av sådan blockad på cytokin sekretion i celler från mänskliga prover. Vår protokoll och experimentell metod ger oss möjlighet att noggrant och effektivt kvantifiera återställande av cytokinproduktion av HIV-specifika CD4 T-celler från HIV-infekterade individer.

Här visar vi ett in vitro-experimentell design som gör mätningar av cytokin sekretion av HIV-specifika CD4 T-celler och deras inverkan på andra cell delmängder. CD8 T-celler utarmat från helblod och återstående PBMC isolerades genom Ficoll separationsmetod. CD8-utarmade PBMC inkuberades därefter med blockerande antikroppar mot PD-L1-och / eller IL-10Rα och, efter stimulering med ett HIV-1 Gag-peptid-poolen, inkuberades celler vid 37 ° C, 5% _CO2. Efter 48 timmar, supernatanten uppsamlades för cytokin analys av pärlor arrayer och cellpelletar samlades in för antingen fenotypisk analys med hjälp av flödescytometri eller transkriptionsanalys med användning av QRT-PCR. För mer detaljerad analys, var olika cellpopulationer som erhålls genom selektiv delmängd utarmning från PBMC eller genom att sortera med hjälp av flödescytometri innan de bedömas i samma analyser. Dessa metoder ger en mycket känslig och specifik metod för bestämning av modulering av cytokinproduktion av antigenspecifika T-hjälparceller och för att bestämma funktionella interaktioner mellan olika populationer av immunceller.

Introduction

Vid ihållande virusinfektioner, virusspecifika-T-celler förvärvar funktionella defekter i en process som kallas T-cell utmattning. Tidigt in vivo-studier på mus LCMV modell av kronisk virusinfektion indikerade att utmattade virusspecifika T-celler har minskat cytolytisk funktion mot virusinfekterade celler, förlorar sin förmåga att föröka sig och har nedsatt förmåga att producera cytokiner såsom IL-2, TNF- α och IFN-γ ^1,2. Ett komplext nätverk av immunoreglerande banor, såsom PD-1 och IL-10, uppregleras under kroniska infektioner och bidrar till T-cellsdysfunktion (översikt i ^3,4). In vivo-administration av blockerande antikroppar mot dessa hämmande banor i LCMV mus modell återställda funktionen hos utmattade virusspecifika T-celler och förhöjd viral clearance, vilket indikerar att T-cell utmattning är en delvis reversibel fenomen (översikt i ^5).

Rön på the LCMV modell var snabbt utvidgas till humana kroniska virusinfektioner, såsom HBV, HCV och HIV ^5. Vid kronisk HIV-1-infektion, är PD-1 och IL-10 banor uppregleras i infekterade individer och korrelerar med parametrar för sjukdomsprogression, direkt med virusmängd och omvänt med CD4 räknar ^6-8. Antikropp blockad av PD-1 eller IL-10 vägar in vitro återställd proliferation av HIV-specifika CD4-och CD8-T-celler vilket tyder på att, i likhet med LCMV musmodell, är T-cell utmattning hos människa en delvis reversibel fenomen. Men på grund av den känsliga karaktären av experiment på mänskliga prover samt begränsningar i känslighet in vitro-tester, grundlig utredning av de funktionella restaurering profiler som uppnås genom dessa insatser är påfallande frånvarande. Proliferationsanalyser har varit hittills den enda pålitliga in vitro testas i de flesta studier, men det finns en anmärkningsvärd brist på bevis om effekterna av dessa interkonventioner på: 1) dödandet kapaciteten av cytotoxiska T-celler, 2) den antivirala effekten av T-celler på virusreplikation, 3) den cytokinutsöndring profilen, och 4) effekten på CD4 T-cell hjälp på andra cellgrupper.

Intracellulär cytokin-färgning (ICS) är en mycket användbar och mycket använt flödescytometri baserad analys som används för att detektera produktionen av cytokiner i olika celltyper i både möss och människor. Det har också använts för att undersöka effekten av antikroppen blockad av inhibitoriska vägar. I ICS analyser är cytokinutsöndring blockerades genom tillsats av Brefeldin och / eller monensin. Cytokiner fångade inuti cellerna sedan detekteras med fluorescerande antikroppar med hjälp polychromatic flödescytometri. Varaktigheten av analysen är vanligtvis begränsad till 6 eller 12 timmar efter antigenstimulering eftersom både Brefeldin och monensin, som typiskt tillsättes inom 2 h av antigen Dessutom är toxiska för cellerna. ICS-analysen är en kraftfull teknik som har varit till nytta in utredning av effekten av in vivo-administration av blockerande ingrepp antikropp hos möss där cellerna extraherade efter en viss tid efter antikroppsexponering ^9. Det finns dock flera begränsningar för tillämpningen av denna experimentella strategi för att utvärdera effekterna av blockaden av hämmande receptorer i humana prover. När du utför antikropps ingripanden av hämmande vägar i en 6 eller 12 h stimulering in vitro (normalt är fallet med humana prover), innebär blockad av hämmande receptorer i de flesta fall inte ändra frekvensen av svarande antigen-specifika T-celler mätt med standard ICS analyser ^{6, 7.} Mätningar av per-cell cytokinproduktion, mätta med medel-eller medianfluorescensintensitet har gett motsägande resultat ^{6, 7, 10.} Å andra sidan, när ICS utförs vid en sen tidpunkt efter stimulering (dvs. sex dagar), förändringar i antalet cytokin-avsöndra calnar kan observeras. Skillnaderna är en kombinerad effekt av förändrad proliferation, överlevnad, och förändringar i effektorfunktion som ackumuleras under den angivna tidsperioden ^6. Ett sätt att delvis övervinna dessa begränsningar är att inkubera under längre tid (t.ex. 36 tim, 60 tim, osv.) Med antigenet före tillsatsen av cytokinutsöndring blockerare utan att vänta på proliferation att inträffa. Vi har med framgång använt detta förfarande för att bestämma kinetiken för cytokinutsöndring av HIV-specifika CD4-och CD8-T-celler ^11,12, dock är detta tillvägagångssätt inte kan upptäcka små svaren och kommer inte att ge ett integrerat resultat av den totala cytokinutsöndring förekommande eftersom stimulering. Därför är inte ICS en tillräckligt känslig metod för att påvisa effekten av blockaden av hämmande vägar på den mängd cytokiner som produceras av aktiverade T-celler jämfört med cytokin-mRNA kvantifiering eller mätningar av cytokin sekre i supernatant vid samma tidpunkter. Dessutom har de flesta av de cytokiner som produceras av aktiverade T-celler agerar på autokrint sätt genom att bidra till antingen positiva eller negativa återkopplingar genom interaktion med antigenpresenterande celler. Därför är tillsatsen av Brefeldin eller monensin under ICS assay förhindrar cytokinutsöndring och sålunda stimulering av T-celler är inte optimal. Slutligen detektering av flera cytokiner med ICS begränsas av tillgången och känsligheten av antikroppar för detektion av cytokiner med flödescytometri samt genom begränsningar i antalet fluorokromer som kan användas samtidigt i en viss panel.

Vi utvecklade en mycket känslig in vitro experimentell metod för att utvärdera effekterna av immun vägar i reglerande cytokin sekretion av HIV-specifika CD4 T-celler och därefter CD4 hjälp till antigenpresenterande celler (APC) och naturliga mördarceller (NK-celler). Denna metod kan också användas för att utvärdera den impact blockad av hämmande molekyler på cellfunktionen CD8 T genom att tömma de CD4 T-celler från PBMC eller genom att stimulera med optimala peptider som känns igen endast av CD8 T-celler. I motsats till intracellulära cytokin färgning analyser, beslutade vi att inte störa cytokinutsöndring av HIV-specifika CD4 T-celler för att kunna: 1) utföra en mer noggrann kvantifiering av cytokinnivåer produceras, 2) undersöka en bredare panel av cytokiner eller effektormolekyler, och 3) utvärdera effekten av cytokiner som produceras av HIV-specifika CD4 T-celler på andra cellgrupper. Vi stimulera CD8-utarmade PBMC med en HIV-1 Gag-peptid-poolen i närvaro av blockerande antikroppar för immunreglerande reaktionsvägen av intresse. Efter önskad tid för inkubation, oftast 48 timmar, vi samlar supernatanterna att mäta cytokinutsöndring med pärla arrayer och samla cellen pellets antingen för fenotypisk analys av de olika cellgrupper eller för transkriptionsanalys. Av notera, vid thans 48 h tidspunkt, behöver vi inte upptäcka en stor population av prolifererande T-celler ^12. Detta är en flexibel hållning och flera anpassningar av denna design kan tillämpas på de olika hypoteser. Till exempel kan de enskilda cellgrupper (till exempel HIV-specifika CD4 T-celler eller PD-1 höga CD4 T-celler, etc.) Sorteras efter 12 timmar av inkubation innan ytterligare inkubation under 36 timmar följt av uppsamling av supernatanterna och cellpellets att undersöka mer specifikt effekterna av blockadåtgärder på cytokin sekretion av definierade subpopulationer av PBMC.

Protocol

1. Utarmning och isolering av PBMC via Ficoll Separation

1. Utarma CD8 +-T-celler genom tillsats av humant CD8 ^ Utarmning cocktail vid 50 | il / ml av helblod.
2. Blanda väl och inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur (18-25 ° C).
3. Efter inkubering blandas helblod med HBSS (Hanks balanserade saltlösning utan Ca ^{2 +} eller Mg ^{2 +)} och lager över Histopaque. Spin vid 340 RCF i 30 min (ingen broms, långsam acceleration).
4. Samla PBMC och överför till en ny 50 ml konisk. Tvätta 2x med 45 ml RPMI 1640 kompletterat med 50 lU penicillin, 50 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1% HEPES genom spinning i 10 min vid 340 RCF.

2. Antikropps Blockad och antigenspecifika Stimulering av celler

1. Återsuspendera celler vid 2x10 ⁶ per tillstånd i RPMI 1640 innehållande 10% humant serum kompletterat med 50 lU penicillin, 50 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1% HEPES,står för 500 jil per betingelse.
2. Alikvotera 500 l cellsuspension per FACS rör.
3. Beroende på reaktionsvägen undersöktes, till PD-L1, IL-10Rα blockerande antikroppar och / eller isotypkontroller vid 10 | ig / ml och inkubera under 15 min vid 37 ° C, 5% _CO2.
4. Stimulera celler med en HIV-1 Gag-peptid-poolen vid 1 | ig / ml / peptidslutkoncentration. Inkludera även en "no stimulans" kontroll för varje blockering. Inkubera vid 37 ° C, 5% _CO2 under 48 timmar.

3. Insamling och analys av supernatant

1. Efter 48 timmar, spinn ner FACS rör under 7 minuter vid 340 RCF.
2. Samlas försiktigt 2 x 225 | il supernatant i Eppendorf-rör för Luminex bead matriser utan att störa pelleten.
3. Inaktivera virus i den uppsamlade supernatanten med 25 | il 0,5% PBS-Tween för att ge en slutlig koncentration av 0,05% PBS-Tween.
4. Store uppsamlades supernatanterna som inte Immediately används i en -80 ° C frys.
5. Mät önskade cytokin-koncentrationer genom att använda Millipore Luminex kit enligt tillverkarens protokoll.

4. Insamling och fenotypisk analys av celler via flödescytometri

1. Efter att samla in supernatanten, tvätta cellerna i 3 ml PBS. Snurra celler under 7 minuter vid 340 RCF och dekantera överskottet tvätt.
2. Fläcken för viabilitet med användning av en LIVE / DEAD fastställbara Dead Cell Stain Kit enligt tillverkarens protokoll.
3. Tvätta cellerna i PBS under 7 minuter vid 340 RCF och vid 4 ° C. Återsuspendera i 100 pl PBS 1% FBS.
4. Om färgning för monocyter eller andra antigenpresenterande celler, blockera Fc-receptorer genom att tillsätta 1,4 l av FcR blockeringsreagens och skaka för att blanda.
5. Inkubera under 10 minuter vid 4 ° C.
6. Lägg ytan antikroppar, vortexa och inkubera i 20 min vid 4 ° C i mörker.
7. Tvätta cellerna med PBS 1% FBS, dekantera överskottet tvätt, och tillsätt 200 l 4% paraformaldehyd. Inkuberavid rumstemperatur under 20 minuter i mörker.
8. Tvätta cellerna med PBS 1% FBS, resuspendera i 250 pl PBS 1% FBS, och få på en multilaser flödescytometer (t.ex. BD LSRII eller Fortessa).

5. Analys av celler via QRT-PCR

1. För celler som inte analyseras via flödescytometri: efter överstående samling, lyserar celler i 300 pl Qiagen Buffer RLT innehållande 1% beta-merkaptoetanol. Om inte fortsätter med protokollet kan celler frysas vid -80 ° C efter denna punkt.
2. Isolera RNA med användning av ett RNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll.
3. Syntetisera cDNA från RNA med användning av ett cDNA-synteskit enligt tillverkarens protokoll.
4. Utför kvantitativ PCR med hjälp av SYBR Green-teknik.
5. Skapa en primer mix för varje primer som användes inklusive housekeeping-gener (t.ex. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) genom tillsats av primrar för att nukleasfritt vatten till att ge en slutlig koncentration av 10pM. Håll på is.
6. Skapa en Master Mix för varje grundfärg genom att tillsätta 10,5 l nukleasfritt vatten, 12,5 l SYBR grön, och 1 pl primer mix per platta också. Håll på is.
7. Pipettera 24 pl Master Mix till varje brunn i plattan som kommer att användas.
8. Tillsätt 1 l cDNA till varje brunn enligt mall.
9. Cap brunnar och centrifugera Platta för 3 minuter vid 800 RCF.
10. Kör plattan på en QRT-PCR-maskin, t.ex. en Strata MX3005P instrument.

6. Anpassning för intracellulär cytokin färgning på 48 timmar

Lägg Brefeldin och Monensin 6 timmar före intracellulär cytokin färgning. Brefeldin tillsätts i en koncentration av 10 | ig / ml medan Monensin tillsätts i enlighet med tillverkarens instruktioner. För bekvämlighets skull kan Brefeldin sättas 12 h före fläcka i en koncentration av 5 pg / ml.

1. Efter ytan fläck, tvätta cellerna med PBS 1% FBS och fläcken itracellular cytokiner såsom IL-12, IFN-γ, och TNF-α använder ett Fixering / Permeabilization Lösning kit och protokoll.
2. Tvätta celler, återsuspendera i 250 pl PBS 1% FBS, och kördes på en multilaser flödescytometer (t.ex. BD LSR II eller Fortessa).

7. Anpassning för Sortering Cells

1. 16 h efter stimulering, bets för viabilitet med användning av LIVE / DEAD fastställbara Dead Cell Stain Kit enligt tillverkarens protokoll. Håll celler på is under hela proceduren.
2. Tvätta cellerna med PBS under 7 minuter vid 340 RCF och vid 4 ° C. Återsuspendera i 100 pl PBS 1% FBS.
3. Lägg yta antikroppar, virvel för att blanda och inkubera celler på is i mörker under 20 minuter.
4. Tvätta cellerna med PBS, 1% FBS vid 340 RCF och vid 4 ° C och återsuspendera i 500 pl kall RPMI 1640 innehållande 10% fetalt bovint serum kompletterat med 50 lU penicillin, 50 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1% HEPES.
5. Filtrera celler med användning av 5 ml Bansrene rundbottnad Tube med Cell-sil lock.
6. Förbered uppsamlingsrör för sortering sätta 200 | il RPMI 1640 innehållande 10% fetalt bovint serum kompletterat med 50 lU penicillin, 50 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1% HEPES till varje rör. Håll alla rören på is under slag.
7. Live sortera cellgrupper av intresse på ett instrument (till exempel BD FACS Aria II) som ligger i en anläggning som är utrustad för biologiskt material.
8. Efter att cellerna har sorterats, placera celler tillbaka i inkubatorn för önskad tid och följa med överstående samling / Luminex analys och cellpellet insamling / PCR-analys.

Representative Results

Vid utförande av cytokin mätningar med hjälp av denna in vitro-system, är det viktigt att kunna skilja de antigenspecifika svar jämfört med ingen stimulans kontroll. I allmänhet ansåg vi positiva reaktioner som alla värden på antigen stimulering som ger åtminstone tre-faldig ökning av cytokin-nivåer jämfört med ingen stimulering kontroll och som var inom det linjära intervallet av analysen. Vi använder hög känslighet bead array-analyser som kan upptäcka koncentrationer av cytokiner så låga som 0,16 pg / ml, så att vi kan observera svaga antigen-specifika CD4 T-cellsvar. Prover kördes i duplikat för att säkerställa att korrekta värden erhålls. Figur 2A visar att för IFN-γ produktion kan analysen detektera en median på 800-faldig ökning jämfört med ingen stimulering. Dessa värden beror på de testade eftersom för vissa av dem cytokiner, såsom IL-13 och IL-2, lägre värden jämfört med ingen stimulering kommerobserveras. Ett liknande tillvägagångssätt gäller för transkriptionell profilering av mRNA av olika cytokiner tester. Figur 2B visar nivån av mRNA för IFN-γ som ökas signifikant (mer än tre gånger) efter stimulering. Med denna analys, det finns en stark korrelation mellan IFN-γ proteinutsöndring och IFN-γ-mRNA-nivåer (figur 2C). Även om vi utvecklat denna in vitro metod för att studera HIV-specifik cellfunktion CD4 T, har vi också framgångsrikt använt denna metod för att utvärdera effekterna av PD-L1 och / eller IL-10Rα blockad på CD4 T-cellssvar efter stimulering med SEB, anti-CD3/CD28, CMV-lysat och RD-1 peptider från Mycobacterium tuberculosis (data ej visade). Denna metod kan användas för att bedöma svar på bakteriella antigener, inklusive vaccininducerade svar, lika bra. Figur 2D visar att stimulering med HIV-Gag resulterar i ökad IFN-γ-utsöndring medan stimulering med Tetanus toxoid ger högre IL-13 sekretion, som visar olika cytokinprofilen av HIV och stelkramp-specifika cellsvar CD4 T.

En stor styrka av denna analys är möjligheten att upptäcka skillnader i cytokinutsöndring efter antikropps manipulering av hämmande vägar som inte upptäcks av andra in vitro-tester som ICS. Det bör noteras att vissa cytokiner, såsom IL-2, som kan konsumeras av cellerna så mätningar i supernatanten potentiellt kan underskatta de cytokinnivåer produceras. Därför bör eventuella skillnader i cytokin sekre observerats efter antikropps blockad vara också bekräftas på mRNA-nivå för att utvärdera om observerade skillnader beror på förändringar i en per cell produktion. Figur 3A visar effekten av en PD-L1 blockerande antikropp på IFN -γ-och IL-2-sekretion av HIV-specifika CD4 T-celler efter 48 h av stimulering med det besläktade antigenet. Blockad av PD-1-vägen i allmänhet inte har enbetydande inverkan på cytokinutsöndring utan antigenstimulering men förhöjer IFN-γ-och IL-2-sekretion när cellerna stimuleras med HIV-1 Gag-peptidpoolerna. När CD3-celler utarmade från PBMC, finns det ingen IFN-γ-eller IL-2 som produceras som svar på antigenstimulering (fig 3B), vilket indikerar att utsöndringen av IFN-γ-och IL-2 induceras som svar på HIV-specifika CD4 T cellantigenspecifik stimulering. För vissa cytokiner såsom IL-21, gör känslighet pärla arrayer inte tillåter detektion av proteinnivåer efter svaga antigensvar som hiv. För dessa cytokiner, kan kvantifiering av mRNA utföras istället ^12.

Vissa cytokiner, såsom IFN-γ och TNF-α, kan framställas genom en mängd olika cellundergrupper. Vid utförande av försök på CD8-utarmade PBMC, är det ibland svårt att identfy källan till proteinsekretion, och därför är det svårt att identifiera den cell delmängd som ansvarigtded till blockad av de hämmande molekylerna. Därför har vi tagit fram en variant av denna metod för att utföra en grundligare undersökning av effekterna av att blockera hämmande molekyler på cytokin sekretion genom att sortera olika cellgrupper enligt deras fenotypiska egenskaper. Figur 4 visar effekten av PD-1 blockad på IFN -γ och IL-2 utsöndrad av sorterade CD4-T-celler. För detta experiment var CD8-utarmade PBMC stimulerades under 12 h i närvaro av en blockerande PD-L1-antikropp eller en isotyp kontroll. Efter 12 timmar, celler yta färgas med fluorescerande antikroppar och CD4 T-celler var sorteras med hjälp av en flödescytometer cellsorterare. Sorterat CD4-T-celler inkuberades sedan i ytterligare 36 h och cytokiner mättes i supernatanten med användning av däckfots arrayer såsom beskrivits ovan. Vi har framgångsrikt använt denna metod i det förflutna för att sortera CD4 T-celler enligt deras nivåer av PD-1 uttryck och har visat att PD-L1 blockad kan återställa funktionen hos HIV-sp ecific CD4 T-celler som uttrycker höga nivåer av PD-1 ^12.

Antalet immunvägar som identifierats som styrande T-cellsfunktion i HIV-infektion ökar ständigt. Vi har framgångsrikt använt denna analys i det förflutna för att visa effekten av IL-10 blockad på IFN-γ och IL-2-sekretion av HIV-1-specifika CD4 T-celler ^8,13. En av fördelarna med denna metod är förmågan att bedöma hur immunoreglerande molekyler reglera samspelet av HIV-specifika CD4 T-celler med antigenpresenterande celler (APC). Figur 5A visar effekten av IL-10 blockaden av återställande IL-12-utsöndring från antigenpresenterande celler. Med en anpassning av denna teknik, genom att utföra ICS på 48 timmar efter stimulering, kunde vi visa att monocyter är den primära källan för IL-12 efter stimulering med HIV-1 Gag peptidpooler (Figur 5B).

e 1 "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk bild av metoden. Isolerad CD8-utarmade PBMC från HIV-infekterade individer inkuberas i 15 min antingen med isotypkontroll antikroppar eller blockerande antikroppar mot PD-L1 eller IL-10Rα. Efter en 48 timmars stimulering med en HIV-1 Gag-peptid pool, är supernatanterna samlas in för mätning av cytokin sekre med pärla arrayer och cellpellets samlas antingen för fenotypisk analys med flödescytometri eller transkription analys av mRNA-nivåer med QRT-PCR.

Figur 2. Detektion av antigen-specifika T-cellsvar med mRNA eller proteinutsöndring. A: CD8-utarmade PBMC stimuleras med en HIV-1 Gag-peptid pool. IFN-γ utsöndring mättes vid 48 h efter stimulering B:. IFN-γ-mRNA-nivåermättes med QRT-PCR i cellpelletar vid 48 h efter stimulering C:. Korrelation av IFN-γ-koncentrationen i supernatanterna med IFN-γ-mRNA-nivåer. D:. Jämförelse av IFN-γ och IL-13 proteinnivåer mellan CD8-utarmade PBMC stimuleras med HIV-1 Gag-peptid poolen eller tetanustoxoid Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Förändringar av cytokin sekre efter manipulering av hämmande vägar är CD4 T-cellsberoende A och B:. CD8 utarmat eller CD3 utarmat PBMC stimuleras med en HIV-1 Gag-peptid pool i närvaro av isotypkontroll eller PD-L1 blockerande antikropp. IFN-γ-och IL-2-sekretion mättes vid 48 h efter stimulering.

Figur 4. Sortering CD4 T-celler för att upptäcka cytokinutsöndring efter manipulation av PD-1 blockad. AB: CD8-utarmade PBMC från tre kroniskt infekterade, obehandlade försöks inkuberades med en HIV-1 Gag-peptid-poolen eller vänster ostimulerad under 12 h i närvaro av isotypisk kontroll-eller PD-L1-blockerande antikropp. CD4 T-celler då negativt utvalda av härstamning uteslutning lymfocyterna och odlades vidare under 36 timmar.

Figur 5. Samspel mellan CD4-T-celler och antigenpresenterande celler. A: CD8-utarmade PBMC stimulerades med en HIV-1 Gag-peptid-poolen i närvaro av isotypisk kontroll-eller IL-10Rα blockerande antikropp. IL-12 nivåer i supernatanten mättes vid 48 timmar efter stimulering B.:CD8-utarmade PBMC stimuleras med en HIV-1 Gag-peptid pool. IL-12-utsöndring på monocyter mättes med ICS på 48 timmar efter stimulering.

Discussion

Supernatant samling är en viktigt del av detta experimentella designen. Vid skörd av supernatanterna för Luminex assay alikvoter och förvaras vid -80 ° C för att förhindra proteinnedbrytning på grund av frysning-upptiningscykler. Frysning och upptining kan vara hårda processer för proteiner, och genom att minimera frys-tinar, kommer signalen maximeras i analyser. Därför är det lättare att få repeterbara och noggrannare uppgifter vid arbete från alikvoter som har frys tinade lika många gånger.

Vi har tidigare utfört kinetisk analys av cytokin sekretion och mRNA-nivåer efter stimulering med HIV-Gag peptidpooler ^12. Baserat på dessa kinetik, valde vi den 48 hr tidpunkt att utföra sekremätningar cytokin. Med hänsyn till de observerade skillnaderna mellan mRNA och proteinsekretion såväl som mellan olika stimuli, är det viktigt att forskare utföra sina egna kinetiska analyser beroende på stimulide använder och huruvida de mäter mRNA-expression eller protein cytokinutsöndring.

När cellgrupper sorteras (använder den metod som visas i figur 3), är det viktigt att justera volymen av kulturen enligt den cell nummer sortering. I standardanalysen, inkubera vi vanligtvis 1 miljon CD8-utarmade PBMC i 500 l av medium. Men när vi sortera cellundergrupper, såsom CD4-T-celler, som vi vanligtvis sortera upp till 100000 celler. Därför vi minska volymen av mediet till 200 ^ för att hålla från att späda cellerna och för att uppnå en cytokin koncentration som kan detekteras med pärlan array. För varje experiment bör volymen av cellkulturerna experimentellt testats, med hänsyn till den celltyp, cellnumren sorteras, cytokin av intresse, och känsligheten av detektionssats.

En annan viktig aspekt när du utför Luminex analysen är virus inactivatividare. Virus måste inaktiveras för att kunna säkert köra prover på instrumentet. Tween-20 användes av detta skäl. Tidigare hade andra detergenter testats för detta ändamål. Olika spädningar av 0,5% Tween, 5 till 10% Triton, och tvättbuffert sattes till HIV-infekterade celler och testades mot noninactivated celler. Tween befanns inaktivera viruset bäst samtidigt störa den minsta med analyserna utförda.

Vid utförande av flödescytometri, är ett väsentligt steg vid färgning av monocyter för att blockera Fc-receptor med en Fc-blockerande reagens för att förhindra ospecifik bindning av monoklonala antikroppar. Fc-receptorn är närvarande på ytan av antigenpresenterande celler och binder till Fc-regionen i antikroppar. Om denna receptor inte är blockerad innan färgning, kan monoklonala antikroppar som tillsätts för att rikta specifika markörer istället binda till denna receptor, alltså ge ett falskt positivt resultat. Detta är särskilt viktigt för att undvika när man analyserarcytokiner som härstammar från en viss celltyp, som inte blockerar denna receptor kan vara skadligt för resultat. Inkubera celler i media som innehåller humant serum kan också hjälpa till med denna fråga, eftersom det finns stora mängder IgG i serum som binder till Fc-receptorn.

Även Luminex-analyser ger mer känslig detektion än ICS-analyser, vissa effektormolekyler såsom IL-21 eller perforin fortfarande är svåra att upptäcka med denna metod. Detta vitro tillvägagångssätt möjliggör transkriptionell analys med QRT-PCR som ger större känslighet i att upptäcka andra effektormolekyler.

En begränsning av vår experimentella tillvägagångssätt är att tolka resultaten är svårt när det cytokin av intresse produceras av olika cellgrupper från den heterogena blandningen av leukocyter som finns i hela PBMC eller CD8-utarmade PBMC. Exempelvis är detta fallet för cytokinet IL-10, som är uppreglerad i olika cell types i inställningen av progressiva HIV-sjukdom ^8. Sortering av befolkningen av intresse innan ytterligare inkubation och insamling av supernatanter är en alternativ metod som vi har med framgång använts i detta sammanhang.

Sammanfattningsvis, de tekniker som presenteras i det här dokumentet ger ett tillförlitligt sätt mäta restaurering av cytokinproduktion av HIV-specifika CD4 eller CD8 T-celler i närvaro av blockaden av PD-L1 och IL-10 immunvägar. Dessa tekniker kan tillämpas i fall där cytokiner är inte enkelt kan upptäckas med flödescytometri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Human Serum AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30 001 CI
L-glutamine	Mediatech	25 005 CI
HEPES buffer	Mediatech	25060CI
FcR blocking reagent, human	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail	Stem Cell	15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ primer	Invitrogen		FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG