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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.

Abstract

T-Zell-Erschöpfung ist ein wichtiger Faktor in gescheiterten Erreger Freiheit während der chronischen Virusinfektionen. Immunwege, wie PD-1 und IL-10 sind bei dieser laufenden Antigenexposition hochreguliert und tragen zum Verlust von Proliferation, cytolytische Funktion reduziert und durch CD4-und CD8-T-Zellen-Cytokinproduktion beeinträchtigt. Im Mausmodell der LCMV-Infektion, die Verwaltung der blockierenden Antikörper gegen diese beiden Wege erweitert T-Zellantworten. Allerdings gibt es noch keine in vitro Assay, um die Auswirkungen dieser Blockade Zytokinsekretion in Zellen aus menschlichen Proben zu messen. Unser Protokoll und experimentellen Ansatz ermöglichen es uns, genau und effizient zu quantifizieren, die Wiederherstellung der Zytokin-Produktion von HIV-spezifischen CD4-T-Zellen von HIV-infizierten Patienten.

Hier wird ein in vitro-Versuchsanordnung, die Messungen der Cytokin-Sekretion kann durch HIV-spezifische CD4 + T-Zellen und deren Auswirkungen auf andere cel zeigen wirl Teilmengen. CD8-T-Zellen wurden aus Vollblut erschöpft und Rest PBMCs wurden über Ficoll-Trennverfahren isoliert. CD8-abgereicherten PBMC wurden dann mit blockierenden Antikörpern gegen PD-L1 und / oder IL-10Rα und nach Stimulation mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool wurden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. Nach 48 Stunden Überstand wurde für die Zytokin-Analyse durch Perlen-Arrays und Zellpellets gesammelt wurden, entweder für phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder Transkriptionsanalyse mittels qRT-PCR gesammelt. Für weitere detaillierte Analyse wurden verschiedene Zellpopulationen durch selektive Depletion Teilmenge aus PBMCs oder durch Sortieren mit Durchflusszytometrie, bevor sie in den gleichen Tests untersucht erhalten. Diese Verfahren stellen eine sehr empfindliche und spezifische Ansatz zur Modulation der Cytokin-Produktion durch Antigen-spezifische T-Helferzellen zu bestimmen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Populationen von Immunzellen zu bestimmen.

Introduction

Während der anhaltenden viralen Infektionen, Virus-spezifischen T-Zellen-erwerben Funktionsstörungen in einem Prozess als T-Zell-Erschöpfung bekannt. Früh in-vivo-Studien im murinen Modell der LCMV chronische Virusinfektion angegeben, dass erschöpft Virus-spezifische T-Zellen gegen zytolytische Funktion viral infizierte Zellen reduziert, verlieren ihre Fähigkeit zu vermehren und haben Fähigkeit, Zytokine wie IL-2, TNF-produzieren reduziert α und IFN-γ 1,2. Ein komplexes Netzwerk von immunWege, wie PD-1 und IL-10, während chronische Infektionen hochreguliert und zur T-Zell-Funktionsstörung (in 3,4 bewertet). In vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörpern gegen diese hemmenden Bahnen in der LCMV-Maus Modell restauriert Funktion erschöpft virusspezifischen T-Zellen und eine verbesserte Virenfreiheit, die anzeigt, dass T-Zell-Erschöpfung ist ein Phänomen teilweise reversibel (in 5 Bewertung).

Erkenntnisse über thE LCMV-Modell wurden schnell die menschliche chronische Virusinfektionen wie HBV, HCV und HIV 5 verlängert. Bei der chronischen HIV-1-Infektion, sind PD-1 und IL-10 Wege in infizierten Patienten hochreguliert und korrelieren mit den Parametern der Krankheitsprogression, direkt mit der Viruslast und umgekehrt mit der CD4-Zellzahl 6-8. Antikörper Blockade der PD-1 oder IL-10 in vitro Wege wiederhergestellt Proliferation von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen, was anzeigt, dass, ähnlich der LCMV-Maus-Modell, ist T-Zell-Erschöpfung bei Menschen eine teilweise reversible Phänomen. Aufgrund der empfindlichen Natur von Experimenten an menschlichen Proben sowie Einschränkungen in der Empfindlichkeit der in-vitro-Assays, gründliche Untersuchung der funktionellen Wiederherstellung von Profilen dieser Interventionen erreicht wird, ist jedoch auffallend abwesend. Proliferationsassays wurden, so weit, die einzige zuverlässige in-vitro-Test in den meisten Studien getestet, aber es ist ein bemerkenswerter Mangel an Beweisen über die Auswirkungen dieser interInterventionen auf: 1) die Tötung Kapazität von zytotoxischen T-Zellen, 2) die antivirale Wirkung von T-Zellen auf die virale Replikation, 3) die Zytokinsekretion Profil und 4) die Wirkung auf CD4-T-Zell-Hilfe für andere Zell-Untergruppen.

Intrazelluläre Cytokin-Färbung (ICS) ist eine sehr nützliche und weit verbreitet Durchflusszytometrie basierenden Assay, der verwendet wird, um die Produktion von Zytokinen in verschiedenen Zelltypen sowohl in Mäusen und Menschen zu erkennen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung der Antikörperblockade hemmenden Bahnen zu untersuchen. In ICS Assays wird Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin und / oder Monensin blockiert. Zytokine in den Zellen eingeschlossen werden dann mit fluoreszierenden Antikörpern mit polychromatischen Durchflusszytometrie detektiert. Die Dauer des Tests wird in der Regel 6 oder 12 Stunden nach der Antigen-Stimulation beschränkt, da sowohl Brefeldin und Monensin, die typischerweise innerhalb von 2 h von Antigen Zugabe zugegeben werden, sind für die Zellen toxisch. Das ICS-Assay ist eine leistungsfähige Technik, die sich als nützlich erwiesen hat in die Untersuchung der Wirkung der in vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörper Eingriff mit Mäusen, wurden die Zellen nach einer gewissen Zeit nach der Antikörper-Belichtungs 9 extrahiert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen bei der Anwendung dieser experimentellen Ansatz, die Auswirkungen der Blockade der inhibitorischen Rezeptoren im menschlichen Proben auszuwerten. Bei der Durchführung von Antikörper Eingriffe hemmenden Bahnen in einer 6 oder 12 h in-vitro-Stimulation (typischerweise der Fall bei humanen Proben), wird die Blockade der hemmenden Rezeptoren in den meisten Fällen die Frequenz reagiert Antigen-spezifischen T-Zellen nicht zu ändern, wie durch Standardassays gemessen ICS 6, 7. Messungen pro Zelle Zytokinproduktion durch Mittelwert oder Median der Fluoreszenzintensität gemessen, haben widersprüchliche Ergebnisse 6, 7, 10 angegeben. Andererseits, wenn ICS zu einem späten Zeitpunkt nach der Stimulierung durchgeführt (dh 6 Tage), Veränderungen in der Anzahl der Cytokin-sezer cEllen beobachtet werden. Die Unterschiede sind ein kombinierter Effekt der veränderten Proliferation, das Überleben und Veränderungen in Effektor-Funktion, die über den angegebenen Zeitraum 6 ansammeln. Eine Möglichkeit, diese Beschränkungen teilweise zu überwinden, ist für längere Zeiträume (z. B. 36 h, 60 h, etc.) Mit dem Antigen vor der Zugabe der Zytokinsekretion Blocker, ohne auf die Proliferation auftritt inkubieren. Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um die Kinetik der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen zu bestimmen, 11,12, jedoch ist dieser Ansatz nicht in der Lage, kleine Antworten detektieren und ein integriertes Ergebnis die Gesamt Zytokinsekretion vorkommenden nicht geben seit Stimulation. Daher ist ICS nicht ausreichend empfindliches Verfahren, um die Auswirkungen der Blockade der hemmenden Bahnen auf der Anzahl von Zytokinen durch aktivierte T-Zellen produziert, verglichen mit Zytokin-mRNA-Quantifizierung oder Messungen der Cytokin-Sekretion im supernatan erkennent in den gleichen Zeitpunkten. Zusätzlich wirken die meisten der von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine in autokriner Weise durch einen Beitrag zur positiven oder negativen Rückkopplungsschleifen durch die Interaktion mit Antigen-präsentierenden Zellen. Daher Zugabe von Monensin oder Brefeldin im ICS Assay verhindert Zytokinsekretion und somit Stimulation von T-Zellen nicht optimal ist. Schließlich wird die Detektion von mehreren Cytokinen mit ICS durch die Verfügbarkeit und die Empfindlichkeit der Antikörper zum Nachweis von Zytokinen mit Durchflusszytometrie als auch durch Beschränkungen in der Anzahl von Fluorochromen, die gleichzeitig in einem gegebenen Panel verwendet werden können, begrenzt.

Wir entwickelten ein hochempfindliches in vitro-Versuchsansatz, um die Auswirkungen von immun Wege der Regulierung der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen und CD4 Hilfe anschließend auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zu bewerten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die impa evaluierenct Blockade von inhibitorischen Moleküle auf CD8-T-Zellfunktion durch abbau die CD4-T-Zellen aus PBMCs oder durch Stimulation mit optimalen Peptide, die nur von CD8-T-Zellen erkannt werden. Im Gegensatz zu intrazellulären Zytokinfärbung Assays haben wir beschlossen, nicht mit der Cytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen, um in der Lage zu sein, beeinträchtigt: 1) führen eine genauere Quantifizierung der produzierten Zytokinspiegel, 2) Untersuchung eine breitere Platte von Cytokinen oder Effektormoleküle, und 3) die Auswirkungen von von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen auf andere Zellen-Untergruppen produzierten Zytokine. Wir stimulieren CD8 abgereicherten PBMC mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool in Gegenwart von blockierenden Antikörpern für die immun Weg von Interesse. Nach der gewünschten Inkubationszeit, in der Regel 48 Stunden, sammeln wir die Überstände Zytokinsekretion mit Perlenanordnungen messen und sammeln die Zellpellets entweder für phänotypische Analyse der verschiedenen Zelluntergruppen oder für die Transkriptionsanalyse. Von beachten Sie, dass bei tseine 48 h Zeitpunkt haben wir nicht eine bedeutende Population von proliferierenden T-Zellen 12 zu erfassen. Dies ist ein flexibler Ansatz und mehrere Anpassungen dieser Konstruktion kann angewendet werden, um verschiedene Hypothesen zu adressieren. Zum Beispiel können die einzelnen Zelluntergruppen (z. B. HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen oder PD-1 Hoch CD4-T-Zellen, etc..) Nach 12 h Inkubation vor der weiteren Inkubation für 36 Stunden, gefolgt vom Sammeln der Überstände und Zellpellets sortiert um genauer zu untersuchen die Auswirkungen der Blockade auf Interventionen Zytokinsekretion durch definierte Subpopulationen von PBMCs.

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Protocol

1. Entleerung und Isolierung von PBMCs durch Ficoll-Trennung

  1. Abbau CD8 + T-Zellen durch Zugabe von Menschen CD8 +-Depletion Cocktail bei 50 ul / ml Vollblut.
  2. Gut mischen und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur (18-25 ° C).
  3. Nach der Inkubation mischen Vollblut mit HBSS (Hanks Balanced Salt Solution ohne Ca 2 + oder Mg 2 +) und Schicht über Histopaque. Spin bei 340 rcf für 30 min (keine Bremse, langsame Beschleunigung).
  4. Sammeln PBMCs und Transfer zu einem neuen 50 ml konisch. Wasch 2x mit 45 ml RPMI 1640 mit 50 IE Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES durch Schleudern für 10 min bei 340 rcf ergänzt.

2. Antikörper-Blockade und Antigen-spezifische Stimulation der Zellen

  1. Die Zellen in 2x10 6 pro Bedingung in RPMI 1640 mit 10% Humanserum und 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES,Anteil von 500 ul pro Zustand.
  2. Aliquot 500 ul Zellsuspension pro FACS-Röhrchen.
  3. Abhängig von der Bahn untersucht, fügen PD-L1, IL-10Rα-blockierende Antikörper und / oder Isotyp-Kontrollen bei 10 ug / ml und Inkubation für 15 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Stimulierung von Zellen mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool bei 1 &mgr; g / ml / Peptid-Endkonzentration. Auch eine "keine Stimulation"-Steuerung für jede Sperrung Zustand. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden.

3. Sammlung und Analyse der Überstand

  1. Nach 48 Stunden, Spin-down FACS-Röhrchen für 7 min bei 340 rcf.
  2. 2 x 225 ul Überstand in Eppendorf-Röhrchen für Luminex Bead Arrays sorgfältig sammeln, ohne das Pellet zu stören.
  3. Inaktivierung von Viren im Überstand gesammelt mit 25 ul 0,5% PBS-Tween, um eine Endkonzentration von 0,05% Tween-PBS zu ergeben.
  4. Shop gesammelten Überstände, die nicht immed sindiately in einem -80 ° C Gefrierschrank eingesetzt.
  5. Messen gewünschten Cytokin-Konzentrationen unter Verwendung von Millipore Luminex-Kit nach Herstellerprotokoll.

4. Sammlung und phänotypische Analyse von Zellen via Durchflusszytometrie

  1. Nach dem Sammeln der Überstand, waschen Sie die Zellen in 3 ml PBS. Spin-Zellen für 7 min bei 340 rcf und dekantieren überschüssigen Wasch.
  2. Stain für die Lebensfähigkeit mit einem LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit nach Herstellerprotokoll.
  3. Waschen der Zellen in PBS für 7 Minuten bei 340 RCF und bei 4 ° C. Resuspendieren in 100 &mgr; l PBS, 1% FBS.
  4. Wenn Färbung auf Monozyten oder anderen Antigen-präsentierenden Zellen, Block-Fc-Rezeptoren durch Zugabe von 1,4 ul FcR Blockingreagenz und Wirbel zu mischen.
  5. Inkubation für 10 min bei 4 ° C.
  6. In Oberfläche Antikörper, Vortex, und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  7. Waschen der Zellen mit PBS 1% FBS, dekantieren überschüssigen Wasch, und mit 200 ul 4% Paraformaldehyd. Bebrütenbei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln.
  8. Waschen der Zellen mit PBS 1% FBS, Resuspendieren in 250 ul PBS 1% FBS und erwerben auf einer Vielfach Durchflusszytometer (zB BD LSRII oder Fortessa).

5. Die Analyse der Zellen über qRT-PCR

  1. Für Zellen, die nicht über Durchflusszytometrie analysiert: Nach der Überstand Sammlung, lysieren Zellen in 300 ul Qiagen Buffer RLT mit 1% beta-Mercaptoethanol. Wenn nicht mit dem Protokoll weiter, können die Zellen bei -80 ° C nach diesem Zeitpunkt eingefroren werden.
  2. Isolieren RNA unter Verwendung einer RNA Isolation Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
  3. Synthetisieren von cDNA aus RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kit nach Herstellerprotokoll.
  4. Führen quantitative PCR mit SYBR Green Technologie.
  5. Erstellen einer Primer-Gemisch für jeden Primer durch Zugabe von Primern, um Nuklease-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 10 geben, verwendet werden, einschließlich Haushaltsgene (z. B. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH)uM. Halten Sie auf dem Eis.
  6. Erstellen Sie ein Master-Mix für jeden Primer durch Zugabe von 10,5 ul Nuklease-freies Wasser, 12,5 ul SYBR Grün und 1 ul Primer-Mix pro Platte auch. Halten Sie auf dem Eis.
  7. Pipette 24 ul Master-Mix in jede Vertiefung der Platte, die verwendet werden.
  8. 1 ul cDNA in jede Vertiefung nach Vorlage.
  9. Cap Brunnen und Zentrifugenplatte für 3 min bei 800 rcf.
  10. Führen Platte auf einem qRT-PCR-Maschine, zB eine Stratagene Mx3005P Instrument.

6. Die Anpassung für die intrazelluläre Zytokin-Färbung bei 48 h

In Brefeldin und Monensin 6 Stunden vor der intrazellulären Zytokin-Färbung. Brefeldin in einer Konzentration von 10 ug / ml zugegeben, während Monensin wird gemäß den Anweisungen des Herstellers zugegeben. Der Einfachheit halber können Brefeldin 12 Stunden vor in einer Konzentration von 5 ug / ml Fleck hinzugefügt werden.

  1. Nach der Oberflächen Fleck, waschen Sie die Zellen mit PBS 1% FBS und Fleck inzellulären Zytokinen wie IL-12, IFN-γ und TNF-α unter Verwendung einer Fixierung / Permeabilisierung Lösung Satz und Protokoll.
  2. Waschen der Zellen, Resuspendieren in 250 ul PBS 1% FBS, und auf einer Vielfach Durchflusszytometer (zB BD LSR II oder Fortessa).

7. Anpassung zum Sortieren Cells

  1. 16 Stunden nach der Stimulation, Flecken für die Lebensfähigkeit mit LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit nach Herstellerprotokoll. Halten Zellen auf Eis während der gesamten Prozedur.
  2. Waschen der Zellen mit PBS für 7 Minuten bei 340 RCF und bei 4 ° C. Resuspendieren in 100 &mgr; l PBS, 1% FBS.
  3. In Oberfläche Antikörper, Vortex zu mischen, und Inkubation Zellen auf Eis im Dunkeln für 20 min.
  4. Waschen der Zellen mit PBS, 1% FBS bei 340 RCF und bei 4 ° C und Resuspension in 500 &mgr; l kaltem RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum mit 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES.
  5. Filterzellen unter Verwendung von 5 ml Polystyrolrene-Rundrohr mit den Cell-Sieb Kappe.
  6. Vorbereitung Röhrchen für Sortier durch Zugabe von 200 &mgr; l RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Rinderserum, ergänzt mit 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES in jedes Röhrchen. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis beim Sortieren.
  7. Sortieren Sie die Live-Zell-Untergruppen von Interesse an einem Instrument (zB BD FACS Aria II) in einer Einrichtung für biologische Gefahrenstoffe ausgestattet entfernt.
  8. Nachdem die Zellen wurden sortiert, Ortszellen zurück in den Inkubator für die gewünschte Menge an Zeit und folgen mit Überstand Sammlung / Luminex Analyse und Zellpellet Sammlung / PCR-Analyse.

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Representative Results

Bei der Durchführung von Messungen unter Verwendung dieses Zytokin in vitro-System, ist es wichtig, in der Lage, das Antigen-spezifische Reaktionen gegenüber der Kontrolle ohne Stimulation zu unterscheiden. Im allgemeinen betrachtet man positive Reaktionen wie alle Werte der antigenen Stimulation, die mindestens dreifache Zunahme in Zytokinspiegel Vergleich zu der Kontrolle ohne Stimulierung und davon waren innerhalb des linearen Bereichs des Assays zu ergeben. Wir sind mit hoher Empfindlichkeit Bead-Assays, die Konzentrationen von Zytokinen so niedrig wie 0,16 pg / ml nachweisen können, so dass wir schwache Antigen-spezifischen CD4-T-Zellreaktionen zu beobachten. Die Proben werden in zweifacher Ausfertigung, um sicherzustellen, dass genaue Werte erhalten werden ausgeführt. 2A zeigt, dass für die Produktion von IFN-γ, kann der Test ein Median von 800-fache Steigerung zu erkennen im Vergleich zu keiner Stimulation. Diese Werte hängen von den Cytokinen, weil einige von ihnen getestet, wie IL-13 und IL-2, niedrigere Werte im Vergleich zu der ohne Stimulationbeobachtet werden. Ein ähnliches Konzept gilt für Transkriptionsprofilierung der mRNA verschiedener Zytokine Tests. 2B zeigt das Niveau der mRNA für IFN-γ, die wesentlich erhöht wird (mehr als das Dreifache) nach Stimulation. Bei diesem Test gibt es eine starke Korrelation zwischen der IFN-γ-Protein-Sekretion und IFN-γ-mRNA-Spiegel (Fig. 2C). Auch wenn wir dieses in vitro Ansatz zur HIV-spezifischen CD4-T-Zellfunktion zu untersuchen entwickelt, haben wir auch erfolgreich dieser Ansatz verwendet werden, um die Auswirkungen der PD-L1 und / oder IL-10Rα Blockade auf die CD4-T-Zellantworten nach Stimulation mit SEB bewerten, anti-CD3/CD28, CMV-Lysat und RD-1 Peptide von Mycobacterium tuberculosis (Daten nicht gezeigt). Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Reaktionen auf bakterielle Antigene, einschließlich Impfstoff-induzierten Reaktionen, gleich gut. 2D zeigt, dass die Stimulation mit HIV-Gag führt zu einer höheren IFN-γ-Sekretion zu bewerten, während die Stimulation mit Tetanus toxoid ergibt höhere IL-13-Sekretion, was die verschiedenen Zytokin-Profil von HIV und Tetanus-spezifischen CD4-T-Zellantworten.

Eine Stärke dieses Assays ist die Fähigkeit, Unterschiede in der Zytokinsekretion nach der Antikörper-Manipulation hemmende Wege, die nicht durch andere in vitro-Tests nachgewiesen werden, wie ICS erfassen. Es sei darauf hingewiesen, dass einige Cytokine, wie IL-2 kann durch die Zellen verbraucht, so Messungen im Überstand kann möglicherweise unterschätzt die erzeugten Cytokinspiegel werden. Aus diesem Grund sollten die Unterschiede in Antikörper nach Blockade beobachtet Zytokinsekretion auch auf mRNA-Ebene bestätigt werden, um zu beurteilen, ob die beobachteten Unterschiede aufgrund von Änderungen in eine Produktion pro Zelle. 3A zeigt die Auswirkung einer PD-L1-blockierenden Antikörper zu IFN -γ und IL-2-Sekretion durch HIV-spezifische CD4 + T-Zellen nach 48 h Stimulation mit dem verwandten Antigen. Blockade der PD-1-Weg in der Regel nicht über einerhebliche Auswirkungen auf die Zytokinsekretion ohne Antigenstimulation sondern erhöht IFN-γ und IL-2-Sekretion, wenn die Zellen mit HIV-1 Gag-Peptid-Pools stimuliert. Wenn CD3-Zellen aus PBMCs erschöpft ist, gibt es keine IFN-γ oder IL-2 in Reaktion auf die Stimulation erzeugt (Fig. 3B), die anzeigt, daß die Sekretion von IFN-γ und IL-2 in Reaktion auf HIV-spezifische CD4-Antigen-induzierten Zell-Antigen-spezifische Stimulation. Für einige Cytokine, wie IL-21, ist die Empfindlichkeit des Perlenanordnungen nicht den Nachweis von Protein-Spiegel nach schwache Antigen-Reaktionen, wie HIV. Für jene Cytokine kann Quantifizierung der mRNA statt 12 durchgeführt werden.

Einige Zytokine, wie IFN-γ und TNF-α kann durch eine Vielzahl von Zell-Untergruppen hergestellt werden. Bei der Durchführung von Experimenten an CD8-abgereicherten PBMC, ist es manchmal schwierig, die Quelle der Proteinsekretion identfy, und daher ist es schwierig, den Zellenteilsatz zu identifizieren, die Verantwortungded Blockade der inhibitorischen Moleküle. Aus diesem Grund haben wir eine Variante dieser Methode entwickelt, um eine gründlichere Untersuchung der Auswirkungen der Sperrung inhibitorische Moleküle auf Zytokin-Sekretion durch verschiedene Sortier-Zell-Untergruppen nach ihren typischen Merkmalen durchzuführen. Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen der PD-1-Blockade auf IFN -γ und IL-2 von sortierten CD4-T-Zellen sezerniert. Für dieses Experiment wurden CD8 abgereicherten PBMC für 12 h in Gegenwart eines blockierenden PD-L1-Antikörper oder einem Isotyp-Kontrolle stimuliert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern Oberfläche und CD4-T-Zellen angefärbt wurden mit einem Durchflusszytometer Zellsortierer sortiert. Sortierten CD4 T-Zellen wurden dann für 36 Stunden inkubiert und Cytokine wurden im Überstand unter Verwendung von Perlenanordnungen, wie oben beschrieben, gemessen. Wir haben erfolgreich dieses Konzept in der Vergangenheit verwendet, um CD4-T-Zellen sortieren nach ihren Ebenen der PD-1-Expression und haben gezeigt, dass PD-L1-Blockade-Funktion kann der HIV-sp wiederherstellen ecific CD4-T-Zellen, die ein hohes Maß an PD-1 12 auszudrücken.

Die Zahl der immunWege als Regierungs T-Zellfunktion der HIV-Infektionen identifiziert nimmt ständig zu. Wir haben erfolgreich diesen Test in der Vergangenheit verwendet, um die Auswirkungen von IL-10-Blockade auf IFN-γ und IL-2-Sekretion von HIV-1-spezifischen CD4-T-Zellen 8,13 zeigen. Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, zu beurteilen, wie immunregulatorische Moleküle regulieren die Wechselwirkung von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). 5A zeigt die Wirkung von IL-10-Blockade auf die Wiederherstellung IL-12-Sekretion aus Antigen-präsentierende Zellen. Mit einer Anpassung dieser Technik, indem ICS bei 48 h nach der Stimulation, konnten wir zeigen, dass Monozyten sind die Hauptquelle von IL-12 nach Stimulation mit HIV-1 Gag-Peptid-Pools (Fig. 5B).

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Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Methodik. Isolated CD8-verarmten PBMCs von HIV-infizierten Personen werden für 15 min entweder mit Isotypenkontrolle Antikörper oder blockierende Antikörper gegen PD-L1 oder IL-10Rα inkubiert. Nach 48 h Stimulation mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool werden die Überstände für die Messung von Cytokin-Sekretion mit Perlenanordnungen und Zellpellets gesammelt werden entweder für phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder Transkriptionsanalyse von mRNA-Spiegeln unter Verwendung qRT-PCR gewonnen.

Figur 2
2. Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen mit mRNA oder Protein-Sekretion. A: CD8-verarmt PBMCs mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool stimuliert. IFN-γ-mRNA-Spiegel: IFN-γ-Sekretion wurde bei 48 h nach Stimulation B gemessen.wurden mit qRT-PCR in Zellpellets bei 48 h nach der Stimulation gemessen C:. Korrelation von IFN-γ-Konzentration in den Überständen mit IFN-γ mRNA-Spiegel. D:. Vergleich von IFN-γ und IL-13 Protein-Ebene zwischen CD8-verarmten PBMCs mit HIV-1 Gag-Peptid-Pool oder Tetanustoxoid stimuliert Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 3
3. Änderungen der Cytokin-Sekretion nach Manipulation der hemmenden Bahnen CD4 T-Zell-abhängige A und B:. CD8 verarmt oder CD3-abgereicherten PBMC mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool in Gegenwart von Isotyp-Kontroll-oder PD-L1-blockierenden Antikörper stimuliert. IFN-γ und IL-2-Sekretion wurde nach 48 h nach der Stimulation gemessen.


4. Sortieren von CD4-T-Zellen, die Cytokin-Sekretion nach Manipulation von PD-1-Blockade zu erkennen. AB: CD8-verarmt PBMCs von drei chronisch infizierten, unbehandelten Patienten wurden mit einer HIV-1-Gag-Peptid-Pool inkubiert oder unstimuliert belassen für 12 h in Gegenwart von Isotyp-Kontroll-oder PD-L1-blockierenden Antikörper. CD4-T-Zellen wurden dann negativ durch Ausschluss Linie auf den Lymphozyten ausgewählt und weitere 36 Stunden inkubiert.

Figur 5
5. Zusammenspiel von CD4 T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. A: CD8-verarmt PBMCs wurden mit einer HIV-1-Gag-Peptid-Pool in Gegenwart von Isotyp-Kontrolle oder IL-10Rα-blockierenden Antikörper stimuliert. . IL-12-Spiegel im Überstand wurden bei 48 h nach Stimulation B gemessen:CD8-abgereicherten PBMC mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool stimuliert. IL-12-Sekretion auf Monozyten wurde mit ICS bei 48 Stunden nach der Stimulation gemessen.

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Discussion

Der Überstand Sammlung ist ein Imperativ Teil dieser experimentellen Design. Bei der Ernte der Überstände zur Luminex-Assay wurden Aliquote hergestellt und bei -80 ° C gehalten, um den Proteinabbau durch Zyklen Einfrieren-Auftauen zu verhindern. Einfrieren und Auftauen kann hart Verfahren für Proteine ​​und durch Gefrier taut minimiert sein, werden in Tests Signal maximiert werden. Daher ist es einfacher, wiederholbare und genaue Daten beim Arbeiten von Aliquots, die gefriertaut die gleiche Anzahl von Zeiten zu erhalten.

Wir haben zuvor eine kinetische Analyse der Zytokinsekretion und mRNA-Spiegel nach Stimulation mit HIV-Gag-Peptid-Pools 12 durchgeführt. Auf der Basis dieser Kinetik, wählten wir die 48 Stunden Zeitpunkt, um die Zytokinsekretion Messungen durchzuführen. Angesichts der zwischen mRNA-und Protein-Sekretion sowie zwischen verschiedenen Stimuli beobachteten Unterschiede ist es unerlässlich, dass die Forscher führen abhängig von den Stimuli eigene kinetische Analysensie verwenden, und ob sie die Messung der mRNA-Expression oder Protein Zytokinsekretion.

Wenn Zell-Untergruppen sortiert werden (unter Verwendung des in Fig. 3 gezeigten Vorgehensweise), ist es wichtig, das Volumen der Kultur nach der Zellzahl sortiert einzustellen. In der Standard-Assay inkubiert wir typischerweise 1 Million CD8 abgereicherte PBMC in 500 &mgr; l Medium. Wenn wir jedoch Art Zell-Untergruppen, wie CD4-T-Zellen, die wir normalerweise zu sortieren bis zu 100.000 Zellen. Aus diesem Grund verringern wir das Volumen des Mediums auf 200 ul, um von Verdünnen der Zellen zu halten und einen Cytokin-Konzentration, die mit der Perlenanordnung detektierbar ist, zu erreichen. Für jedes Experiment sollte das Volumen der Zellkulturen experimentell getestet werden, unter Berücksichtigung des Zelltyps, die Zellnummern sortiert, das Zytokin von Interesse, und die Empfindlichkeit der Nachweissatz.

Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Durchführung der Luminex Assay ist viren inactivatiauf. Virus inaktiviert, muss in der Lage sein, um sicher zu laufen Proben auf dem Instrument werden. Tween-20 wurde aus diesem Grund verwendet. Zuvor hatten andere Reinigungsmittel für diesen Zweck getestet. Verschiedene Verdünnungen von 0,5% Tween, 5-10% Triton und Waschpuffer wurden in HIV-infizierten Zellen gegeben und gegen noninactivated Zellen getestet. Tween gefunden wurde, um das Virus zu inaktivieren, während störende besten die mindestens mit den Assays durchgeführt.

Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie ist ein wesentlicher Schritt bei der Färbung für Monozyten an den Fc-Rezeptor mit einem Fc-Blockierungsreagenz unspezifische Bindung von monoklonalen Antikörpern, um zu verhindern, zu blockieren. Der Fc-Rezeptor vorhanden ist auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen und bindet an die Fc-Region von Antikörpern. Wird dieser Rezeptor nicht blockiert vor der Färbung können monoklonale Antikörper, die hinzugefügt werden, um spezifische Marker Ziel anstelle an diesen Rezeptor binden, was somit ein falsches positives Ergebnis. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse zu vermeiden,Zytokine, die von einem bestimmten Zelltyp abgeleitet, da nicht eine Blockierung dieses Rezeptors könnte sich nachteilig auf Ergebnissen. Inkubieren der Zellen in Medium, enthaltend Humanserum kann auch mit diesem Problem zu helfen, da es reichlich IgG im Serum, die an den Fc-Rezeptor zu binden.

Obwohl Luminex-Assays bereitzustellen empfindlicheren Nachweis als ICS Assays sind bestimmte Effektormoleküle, wie IL-21 oder Perforin immer noch schwierig, mit diesem Verfahren zu erkennen. Diese in vitro-Ansatz ermöglicht eine Transkriptionsanalyse mittels qRT-PCR, die eine höhere Empfindlichkeit bei der Erkennung anderer Effektor-Molekülen liefert.

Eine Einschränkung unserer experimentellen Ansatz ist, dass die Auslegung der Ergebnisse ist schwierig, wenn das Zytokin von Interesse wird von verschiedenen Zell-Untergruppen aus dem heterogenen Mischung aus ganz PBMCs oder CD8-verarmten PBMCs vorhanden Leukozyten produziert. Beispielsweise der Fall für das Cytokin IL-10, die in verschiedenen Zell ty hochreguliert wird, ist diespes in der Einstellung der HIV-Erkrankung progressive 8. Sortierung der Bevölkerung von Interesse, bevor weitere Inkubation und Sammlung von Überständen ist ein alternativer Ansatz haben wir erfolgreich in diesem Zusammenhang verwendet.

Zusammenfassend sind die Techniken, die in diesem Papier ein zuverlässiges Mittel zum Messen Wiederherstellung der Cytokin-Produktion durch HIV-spezifische CD4-oder CD8-T-Zellen in Gegenwart von Blockade der PD-L1-und IL-10 immunWege. Diese Techniken können in Fällen, in denen Zytokine sind nicht mittels Durchflusszytometrie leicht nachweisbar angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Gordon Freeman für die Bereitstellung des anti-PD-L1 blockierenden Antikörpers. Wir danken der klinischen und Laborpersonal am Massachusetts General Hospital und allen Studienteilnehmern für ihre unschätzbare Rolle in diesem Projekt.

, National Heart Lung and Blood Institute der National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK) Diese Studie wurde durch das Nationale Institut für Allergie und Infektionskrankheiten der National Institutes of Health (DEK PA1 AI-080192) gefördert. DEK ist von einem Research Scholar Career Award der Quebec Health Research Fund (FRQS) unterstützt. FP wird durch ein Stipendium Erteilung des Massachusetts General Hospital Vorstand für Forschung und der Harvard Global Health Institute (HGHI) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

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References

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Tags

Immunologie Viruskrankheiten Immunsystem-Krankheiten HIV CD4-T-Zellen CD8-T-Zellen Antigen-präsentierende Zellen Zytokine immun Netzwerke PD-1: IL-10 Erschöpfung Monozyten
<em>In vitro-Test,</em> um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten
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Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, … More

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

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