Summary
Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.
Abstract
Esaurimento delle cellule T è un fattore importante nella riuscita di liquidazione patogeno durante le infezioni virali croniche. Percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated su questa esposizione all'antigene corso e contribuiscono alla perdita della proliferazione, riduzione della funzione citolitica e compromessa produzione di citochine da parte di cellule T CD4 e CD8. Nel modello murino di infezione LCMV, somministrazione di bloccare anticorpi contro queste due vie aumentata risposte delle cellule T. Tuttavia, attualmente non vi è prova in vitro per misurare l'impatto di tale blocco sulla secrezione di citochine in cellule da campioni umani. Il nostro protocollo e approccio sperimentale ci consentono di quantificare con precisione e in modo efficiente il ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 da soggetti infetti da HIV.
Qui, ci raffiguriamo un disegno sperimentale in vitro che consente misurazioni della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e il loro impatto su altri celsottoinsiemi l. Cellule T CD8 erano esaurite dal sangue intero e che restano PBMC sono state isolate tramite metodo di separazione Ficoll. PBMC CD8-impoverito sono state poi incubate con anticorpi bloccanti contro PD-L1 e / o IL-10Rα e, dopo stimolazione con HIV-1 piscina Gag peptide, le cellule sono state incubate a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo 48 ore, il surnatante è stato raccolto per l'analisi di citochine da perline array e pellet cellulari sono stati raccolti sia per l'analisi fenotipica mediante citometria a flusso o l'analisi trascrizionale mediante qRT-PCR. Per un'analisi più dettagliata, diverse popolazioni cellulari sono stati ottenuti selettiva sottoinsieme esaurimento da PBMC o di classificare mediante citometria a flusso, prima di essere valutato negli stessi dosaggi. Questi metodi forniscono un approccio altamente sensibile e specifico per determinare la modulazione della produzione di citochine da parte di cellule T-helper antigene-specifiche e determinare interazioni funzionali tra diverse popolazioni di cellule immunitarie.
Introduction
Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l'esaurimento delle cellule T. All'inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in 3,4). Nella somministrazione in vivo di bloccare anticorpi contro queste vie inibitorie nel topo LCMV modello di funzione delle cellule T virus-specifici esaurite e la clearance virale maggiore restaurato, indicando che l'esaurimento delle cellule T è un fenomeno parzialmente reversibile (recensito in 5).
Giudizio su °e modello LCMV sono stati rapidamente estesa a infezioni virali croniche umani quali HBV, HCV e HIV 5. In cronica da HIV-1, PD-1 e IL-10 percorsi sono upregulated in soggetti infetti e correlano con parametri di progressione della malattia, direttamente con la carica virale e inversamente con la conta CD4 6-8. Anticorpo blocco dei PD-1 o IL-10 percorsi in vitro restaurato proliferazione di HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 indicano che, simile al modello di topo LCMV, esaurimento delle cellule T nell'uomo è un fenomeno parzialmente reversibile. Tuttavia, a causa della natura delicata di esperimenti su campioni umani nonché limitazioni nella sensibilità dei saggi in vitro, un'indagine approfondita dei profili ripristino funzionale ottenuti da questi interventi è sorprendentemente assente. Saggi di proliferazione sono stati, finora, l'unico test affidabile in vitro testato in maggior parte degli studi, ma vi è una notevole mancanza di prove sull'impatto di questi, tra l'interventi su: 1) la capacità di uccisione delle cellule T citotossiche, 2) l'effetto antivirale di cellule T sulla replicazione virale, 3) il profilo secrezione di citochine, e 4) l'effetto su aiuto delle cellule T CD4 su altri sottogruppi di cellule.
Intracellulare di citochine colorazione (ICS) è un flusso molto utile e ampiamente utilizzati saggio basato citometria che viene utilizzato per rilevare la produzione di citochine in vari tipi di cellule, sia nei topi e nell'uomo. E 'stato anche utilizzato per studiare l'effetto di anticorpi blocco di vie inibitorie. In saggi ICS, secrezione di citochine è bloccata con l'aggiunta di brefeldina e / o Monensina. Le citochine intrappolati all'interno delle cellule sono poi rilevate con anticorpi fluorescenti con citometria a flusso policromo. La durata del test è solitamente limitato a 6 o 12 ore dopo la stimolazione antigene poiché sia brefeldina e monensina, che sono tipicamente aggiunti in 2 ore di antigene indicato, sono tossici per le cellule. Il saggio ICS è una potente tecnica che è stata i utilen l'indagine l'effetto della somministrazione in vivo di bloccare intervento anticorpo nei topi in cui le cellule sono state estratte dopo un certo periodo di tempo dopo l'esposizione anticorpo 9. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni per l'applicazione di questo approccio sperimentale per valutare l'impatto del blocco dei recettori inibitori in campioni umani. Durante l'esecuzione di interventi di anticorpi vie inibitorie in un hr stimolazione 6 o 12 in vitro (tipicamente il caso con campioni umani), il blocco dei recettori inibitori in molti casi non modifica la frequenza di rispondere cellule T antigene-specifiche come misurata mediante saggi circuiti integrati standard 6, 7. Le misurazioni della produzione di citochine per cella misurati mediante media o la mediana intensità di fluorescenza hanno dato risultati inconsistenti 6, 7, 10. D'altra parte, quando ICS viene eseguita in un punto temporale in ritardo dopo la stimolazione (ovvero sei giorni), le variazioni del numero di citochina-secernente cells possono essere osservati. Le differenze sono un effetto combinato della proliferazione alterata, sopravvivenza, e cambiamenti nella funzione effettrice che si accumulano durante il periodo di tempo specificato 6. Un modo per superare in parte questi limiti è quello di incubare per lunghi periodi di tempo (ad esempio 36 hr, 60 hr, ecc.) Con l'antigene prima l'aggiunta del bloccante secrezione di citochine senza attendere la proliferazione si verifichi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per determinare la cinetica di secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 11,12, tuttavia, questo approccio non è in grado di rilevare piccole risposte e non dia un risultato integrata della secrezione di citochine totale verificano poiché la stimolazione. Pertanto, ICS non è un metodo abbastanza sensibile per rilevare l'impatto del blocco di vie inibitorie sulla quantità di citochine prodotte dalle cellule T attivate rispetto a mRNA quantitativa o misure di secrezione di citochine nel supernatant agli stessi punti temporali. Inoltre, la maggior parte delle citochine prodotte dalle cellule T attivate agire in maniera autocrina contribuendo al feedback positivo o negativo passanti attraverso l'interazione con le cellule presentanti l'antigene. Pertanto, l'aggiunta di brefeldina o Monensina durante il saggio ICS impedisce la secrezione di citochine e quindi la stimolazione delle cellule T non è ottimale. Infine, il rilevamento di citochine multiple con ICS è limitata dalla disponibilità e sensibilità di anticorpi per il rilevamento di citochine mediante citometria a flusso, nonché da vincoli nel numero di fluorocromi che possono essere utilizzati contemporaneamente in un dato pannello.
Abbiamo sviluppato un approccio altamente sensibile in vitro sperimentale per valutare l'impatto delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e successivamente CD4 contribuiscono a cellule presentanti l'antigene (APC) e le cellule natural killer (cellule NK). Questo metodo può anche essere utilizzato per valutare l'impact del blocco di molecole inibitori sulla funzione delle cellule T CD8 mediante deplezione delle cellule T CD4 da PBMC o stimolando con peptidi ottimali che vengono riconosciuti solo dalle cellule T CD8. In contrasto intracellulari saggi citochina colorazione, abbiamo deciso di non interferire con la secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 per essere in grado di: 1) effettuare una quantificazione più accurata dei livelli di citochine prodotte; 2) indagare un pannello più ampio di citochine o molecole effettrici e 3) valutare l'impatto delle citochine prodotte da HIV-specifiche cellule T CD4 su altri sottoinsiemi di cellule. Stimoliamo CD8 PBMC impoverito a HIV-1 Gag piscina peptide in presenza di anticorpi bloccanti per la via immunoregolatorio di interesse. Dopo il tempo desiderato di incubazione, di solito 48 ore, raccogliamo il surnatante per misurare la secrezione di citochine con array di perline e raccogliere i pellet cellulari sia per l'analisi fenotipica delle diverse sottopopolazioni cellulari o per l'analisi trascrizionale. Da segnalare, al tempo til suo 48 punto di tempo hr, noi non rileva una significativa popolazione di cellule proliferanti T 12. Questo è un approccio flessibile e diversi adattamenti di questo motivo può essere applicato per affrontare diverse ipotesi. Per esempio, i singoli sottogruppi di cellule (come HIV-specifiche cellule T CD4 o PD-1 le cellule T CD4 elevati, ecc.) Possono essere scelti dopo 12 ore di incubazione prima ulteriore incubazione per 36 ore seguita da collezione di supernatanti e pellet cellulari indagare più specificamente l'impatto degli interventi del blocco sulla secrezione di citochine da sottopopolazioni definite di PBMC.
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Protocol
1. Impoverimento e isolamento delle PBMC mediante Ficoll Separazione
- Deplezione delle cellule T CD8 +, aggiungendo umano CD8 + Depletion Cocktail a 50 microlitri / ml di sangue intero.
- Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C).
- Dopo l'incubazione, mescolare sangue intero con HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca 2 + o Mg 2 +) e strato sopra Histopaque. Spin a 340 rcf per 30 minuti (senza freni, accelerazione lenta).
- Raccogliere PBMC e trasferire in un nuovo conico 50ml. Lavare 2x con 45 ml RPMI 1640 supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES facendo girare per 10 min a 340 rcf.
2. Anticorpo Blockade e stimolazione antigene-specifica delle cellule
- Risospendere le cellule a 2x10 6 per condizione in RPMI 1640 contenente il 10% di siero umano supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES,pari a 500 microlitri per ogni condizione.
- Aliquota 500 microlitri di sospensione cellulare per provetta FACS.
- A seconda del percorso studiato, aggiungere PD-L1, IL-10Rα anticorpi bloccanti e / o controlli isotipo a 10 pg / ml e incubare per 15 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Stimolare le cellule con una piscina peptide HIV-1 Gag ad una concentrazione finale di 1 mg / ml / peptide. Includono anche un controllo "nessuno stimolo" per ogni condizione di blocco. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
3. Raccolta e analisi del surnatante
- Dopo 48 ore, centrifugare tubi FACS per 7 minuti a 340 rcf.
- Raccogliere accuratamente 2 x 225 microlitri surnatante in provette Eppendorf per gli array di perline Luminex senza disturbare il pellet.
- Inattivare virus nel supernatante raccolto con 25 microlitri 0,5% Tween-PBS per ottenere una concentrazione finale di 0,05% PBS-Tween.
- Il negozio di raccolta surnatanti che non sono immediately utilizzato in un -80 ° C freezer.
- Misurare le concentrazioni di citochine desiderati utilizzando il kit di Millipore Luminex secondo il protocollo del produttore.
4. Raccolta e analisi fenotipica delle cellule tramite Citometria a Flusso
- Dopo aver raccolto il surnatante, lavare le cellule in 3 ml di PBS. Spin le cellule per 7 minuti a 340 rcf e decantare lavaggio in eccesso.
- Stain per la redditività con un LIVE / DEAD fissabile Morto Kit Stain cellulare secondo il protocollo del produttore.
- Lavare le cellule in PBS per 7 minuti a 340 rcf e a 4 ° C. Risospendere in 100 microlitri di PBS 1% FBS.
- Se la colorazione per i monociti o altre cellule presentanti l'antigene, i recettori Fc blocco con l'aggiunta di 1,4 ml di FcR blocco reagenti e vortex per miscelare.
- Incubare per 10 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere anticorpi di superficie, vortex e incubare per 20 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con PBS 1% FBS, decantare lavaggio in eccesso, e aggiungere 200 microlitri paraformaldeide al 4%. Covarea temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
- Lavare le cellule con PBS 1% FBS, risospendere in 250 microlitri di PBS 1% FBS, e di acquisire una multilaser citofluorimetro (es. BD LSRII o Fortessa).
5. Analisi delle celle tramite qRT-PCR
- Per le cellule non analizzato mediante citometria a flusso: dopo la raccolta surnatante, Lisare le cellule in 300 microlitri Qiagen Buffer RLT contenente 1% di beta-mercaptoetanolo. Se non continuando con protocollo, le cellule possono essere congelati a -80 ° C dopo questo punto.
- Isolare l'RNA utilizzando un kit di isolamento di RNA seguendo il protocollo del produttore.
- Sintetizzare cDNA da RNA utilizzando un kit di sintesi di cDNA seguendo il protocollo del produttore.
- Eseguire la PCR quantitativa utilizzando la tecnologia SYBR Green.
- Creare una miscela di innesco per ciascun primer utilizzati compresi geni housekeeping (ad esempio IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) aggiungendo primer per priva di nucleasi acqua per ottenere una concentrazione finale di 10pM. Tenere su ghiaccio.
- Creare un master mix per ogni primer con l'aggiunta di 10,5 microlitri di acqua priva di nucleasi, 12,5 microlitri SYBR green, e 1 microlitri miscela di primer per piastra bene. Tenere su ghiaccio.
- Pipettare 24 microlitri master mix in ogni pozzetto della piastra che verrà utilizzato.
- Aggiungere 1 ml di cDNA a ciascun pozzetto secondo il modello.
- Cap pozzi e piatto di centrifuga per 3 minuti a 800 rcf.
- Eseguire piastra su una macchina qRT-PCR, ad esempio, uno strumento Stratagene Mx3005P.
6. Adattamento per intracellulare di citochine colorazione a 48 ore
Aggiungi brefeldina e Monensin 6 ore prima intracellulare di citochine colorazione. Brefeldina viene aggiunto ad una concentrazione di 10 ug / ml mentre Monensina viene aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Per comodità, brefeldina può essere aggiunto 12 hr prima di macchiare ad una concentrazione di 5 mg / ml.
- Dopo macchia di superficie, lavare le cellule con PBS 1% FBS e macchia nelextracellulare citochine come IL-12, IFN-γ e TNF-α utilizzando un kit di fissaggio / Permeabilization soluzioni e protocollo.
- Lavare le cellule, risospendere in 250 microlitri di PBS 1% FBS, ed eseguito su un multilaser citofluorimetro (es. BD LSR II o Fortessa).
7. Adattamento per ordinamento celle
- 16 ore dopo la stimolazione, macchia per la vitalità usando LIVE / DEAD fissabile Morto Kit Stain cellulare secondo il protocollo del produttore. Mantenere le cellule in ghiaccio durante tutta la procedura.
- Lavare le cellule con PBS per 7 minuti a 340 rcf e a 4 ° C. Risospendere in 100 microlitri di PBS 1% FBS.
- Aggiungi anticorpi di superficie, vortex per miscelare e incubare cellule sul ghiaccio al buio per 20 min.
- Lavare le cellule con PBS 1% FBS a 340 rcf e a 4 ° C e risospendere in 500 ml RPMI freddo 1640 contenente il 10% di siero fetale bovino supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES.
- Celle filtranti con 5 ml di polistirolorene tubo a fondo rotondo con tappo Cell-Strainer.
- Preparare le provette di raccolta per l'ordinamento con l'aggiunta di 200 ml RPMI 1640 contenente il 10% siero fetale bovino integrata con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES a ciascun tubo. Tenere tutte le provette in ghiaccio durante ordinamento.
- In diretta ordinare i sottoinsiemi di cellule di interesse su uno strumento (ad es BD FACS Aria II) che si trova in una struttura attrezzata per materiale a rischio biologico.
- Dopo celle sono state filtrate, posto celle torna in incubatrice per quantità desiderata di tempo e di seguire con l'analisi collezione surnatante / Luminex e analisi collezione pellet di cellule / PCR.
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Representative Results
Per effettuare le misurazioni di citochine tramite questo sistema in vitro, è essenziale essere in grado di distinguere le risposte antigene-specifiche rispetto al controllo senza stimolazione. In generale, abbiamo preso in considerazione le risposte positive da tutti i valori della stimolazione antigenica che danno almeno tre volte aumento dei livelli di citochine rispetto al controllo nessuno stimolo e che erano all'interno della gamma lineare del test. Stiamo usando ad alta sensibilità saggi di matrice tallone in grado di rilevare le concentrazioni di citochine a partire da 0,16 pg / ml, che ci permette di osservare deboli le risposte delle cellule CD4 T antigene-specifiche. I campioni vengono analizzati in duplicato per garantire che i valori accurati sono ottenuti. Figura 2A mostra che per la produzione di IFN-γ, il saggio può rilevare una mediana di 800 volte superiore rispetto a nessuno stimolo. Questi valori dipendono dalle citochine testate perché per alcuni di essi, come IL-13 e IL-2, valori inferiori rispetto alla stimolazione non saràessere osservate. Un approccio simile vale per profilatura trascrizionale del mRNA di vari test citochine. Figura 2B mostra il livello di mRNA per IFN-γ che è aumentato significativamente (più di tre volte) dopo stimolazione. Con questo test, vi è una forte correlazione tra la secrezione della proteina IFN-γ e livelli di mRNA IFN-γ (Figura 2C). Anche se abbiamo sviluppato questo approccio in vitro per studiare la funzione delle cellule CD4 T specifici per HIV, abbiamo anche utilizzato con successo questo approccio per valutare l'impatto di PD-L1 e / o IL-10Rα blocco sulle risposte delle cellule T CD4 dopo stimolazione con SEB, anti-CD3/CD28, CMV lisato e RD-1 peptidi da Mycobacterium tuberculosis (dati non mostrati). Questo metodo può essere utilizzato per valutare le risposte agli antigeni batterici, comprese le risposte indotte dai vaccini, ugualmente bene. Figura 2D mostra che la stimolazione con HIV-Gag traduce in una maggiore secrezione di IFN-γ mentre la stimolazione con Tetano toxoid risultati in una maggiore secrezione di IL-13, dimostrando il profilo delle citochine diverso di HIV e tetano-specifiche risposte delle cellule T CD4.
Un punto di forza di questo test è la capacità di rilevare differenze nella secrezione di citochine dopo manipolazione anticorpo di vie inibitorie che non sono rivelati da altri saggi in vitro come ICS. Va notato che alcune citochine come IL-2, possono essere utilizzati da cellule così misurazioni nel surnatante possono potenzialmente sottovalutare i livelli di citochine prodotte. Per questo motivo, eventuali differenze di secrezione di citochine osservato dopo anticorpo blocco dovrebbero essere anche confermata a livello di mRNA per valutare se le differenze osservate sono dovute alle variazioni di una cella per la produzione. Figura 3A mostra l'impatto di un anticorpo bloccante PD-L1 su IFN -γ e IL-2 secrezione da HIV-specifiche cellule T CD4 dopo 48 ore di stimolazione con l'antigene affine. Blocco del PD-1 percorso generalmente non ha unimpatto significativo sulla secrezione di citochine senza stimolazione antigenica ma migliora IFN-γ e IL-2 secrezione quando le cellule sono stimolate con piscine HIV-1 Gag peptidici. Quando le cellule CD3 sono esaurite dalla PBMC, non c'è IFN-γ o IL-2 prodotta in risposta alla stimolazione antigene (Figura 3B) che indica che la secrezione di IFN-γ e IL-2 è indotta in risposta a HIV-specifica CD4 T cella stimolazione antigene-specifica. Per alcune citochine come IL-21, la sensibilità di matrici tallone non consente il rilevamento dei livelli della proteina dopo deboli reazioni antigene come l'HIV. Per tali citochine, quantificazione di mRNA può essere eseguita invece 12.
Alcune citochine, come IFN-γ e TNF-α, possono essere prodotti da una varietà di sottogruppi di cellule. Durante l'esecuzione di esperimenti su PBMC CD8-impoverito, è talvolta difficile identfy la fonte della secrezione di proteine, e, pertanto, è difficile identificare il sottoinsieme cella responded al blocco delle molecole inibitrici. Per questo motivo abbiamo sviluppato una variante di questo metodo per eseguire un'indagine più approfondita dell'impatto di bloccare molecole inibitori sulla secrezione di citochine di classificare le diverse sottopopolazioni di cellule in base alle loro caratteristiche fenotipiche. Figura 4 mostra l'impatto di PD-1 blocco a IFN -γ e IL-2 secreta dalle cellule T CD4 ordinati. Per questo esperimento, PBMC CD8-impoverito sono state stimolate per 12 ore in presenza di un anticorpo bloccante PD-L1 o un controllo isotipico. Dopo 12 ore, le cellule sono state superficie macchiata con anticorpi fluorescenti e le cellule T CD4 sono stati ordinati utilizzando un citofluorimetro cell sorter. Cellule T CD4 filtrate sono state poi incubate per ulteriori 36 ore e citochine sono stati misurati nel supernatante usando array tallone come descritto sopra. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio in passato per ordinare cellule T CD4 secondo i loro livelli di PD-1 e dimostrato che PD-L1 blocco può ripristinare la funzione di HIV-sp ecific cellule CD4 T che esprimono alti livelli di PD-1 12.
Il numero di percorsi immunomodulanti identificati come la funzione delle cellule T governo di infezione da HIV è in costante aumento. Abbiamo utilizzato con successo questo test in passato per mostrare l'effetto di IL-10 blocco a IFN-γ e IL-2 secrezione da HIV-1-specifiche cellule T CD4 8,13. Uno dei vantaggi di questo metodo è la capacità di valutare come molecole immunomodulanti regolano l'interazione di HIV-specifiche cellule T CD4 con cellule presentanti l'antigene (APC). Figura 5A illustra l'effetto di IL-10 blocco sul ripristino IL-12 secrezione cellule presentanti l'antigene. Con un adattamento di questa tecnica, effettuando ICS a 48 ore dopo la stimolazione, siamo stati in grado di dimostrare che i monociti sono la fonte primaria di IL-12 dopo stimolazione con piscine HIV-1 Gag peptide (Figura 5B).
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Figura 1. Rappresentazione schematica della metodologia. Isolato CD8-impoverito PBMC da soggetti infetti da HIV sono incubate per 15 minuti o con anticorpi di controllo isotipo o bloccando gli anticorpi contro PD-L1 o IL-10Rα. Dopo un hr stimolazione 48 con HIV-1 Piscina Gag peptide, surnatanti sono raccolti per le misure di secrezione di citochine con array di perline e pellet cellulari sono raccolti sia per l'analisi fenotipica citometria a flusso o l'analisi trascrizionale dei livelli di mRNA mediante qRT-PCR.
Figura 2. Rilevamento di risposte delle cellule T antigene-specifiche con mRNA o proteina secrezione. A: PBMC CD8-impoverito stimolati con HIV-1 Piscina Gag peptide. Secrezione di IFN-γ è stata misurata a 48 ore dopo la stimolazione B:. Livelli di IFN-γ mRNAsono stati misurati con qRT-PCR in pellet cellulari a 48 ore dopo la stimolazione C:. correlazione concentrazione di IFN-γ in surnatanti con livelli di IFN-γ mRNA. D:. Confronto di IFN-γ e IL-13 livelli di proteina tra PBMC CD8-impoverito stimolate con HIV-1 Gag piscina peptide o tossoide tetanico Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Modifiche di secrezione di citochine dopo manipolazione di vie inibitorie è CD4 T dipendente dalle cellule A e B:. CD8 esaurita o CD3 PBMC stimolate con un impoverito HIV-1 Gag piscina peptide in presenza del controllo isotipico o anticorpo bloccante PD-L1. IFN-γ e IL-2 secrezione è stata misurata a 48 ore dopo la stimolazione.
Figura 4. Ordinamento cellule T CD4 per rilevare la secrezione di citochine dopo la manipolazione di PD-1 blocco. AB: PBMC CD8-esauriti di tre cronicamente infette, soggetti non trattati sono stati incubati con HIV-1 Gag piscina peptide o lasciati non stimolate per 12 ore in presenza del controllo isotipico o anticorpo bloccante PD-L1. Cellule T CD4 sono stati selezionati negativamente esclusione lignaggio sui linfociti e incubate per ulteriori 36 ore.
Figura 5. Interazione tra cellule CD4 T e cellule presentanti l'antigene. A: PBMC CD8-impoverito sono state stimolate con HIV-1 Gag piscina peptide in presenza del controllo isotipico o anticorpo bloccante IL-10Rα. IL-12 livelli nel surnatante sono stati misurati a 48 ore dopo la stimolazione B.:PBMC CD8-impoverito stimolati con una piscina peptide HIV-1 Gag. Secrezione di IL-12 nei monociti è stata misurata con ICS a 48 ore dopo la stimolazione.
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Discussion
Collezione surnatante è una parte fondamentale di questo progetto sperimentale. Durante la raccolta surnatanti per il dosaggio Luminex, sono state fatte aliquote e conservati a -80 ° C per evitare la degradazione della proteina causa gelo-disgelo. Congelamento e scongelamento può essere processi dure per le proteine, e riducendo al minimo freeze-disgelo, il segnale sarà massimizzata in saggi. Pertanto, è più facile ottenere dati ripetibile e preciso quando si lavora da aliquote che sono stati scongelati freeze-lo stesso numero di volte.
Abbiamo precedentemente eseguito analisi cinetica di secrezione di citochine e livelli di mRNA dopo stimolazione con HIV-Gag piscine peptide 12. Sulla base di queste cinetiche, abbiamo scelto il punto di tempo 48 ore per eseguire le misurazioni secrezione di citochine. Date le differenze osservate tra mRNA e la secrezione di proteine, come pure tra differenti stimoli, è imperativo che i ricercatori effettuano analisi proprio cinetica seconda delle condizioni stimoliusano e se stanno misurando l'espressione di mRNA o secrezione di proteine citochine.
Quando sottopopolazioni di cellule sono ordinati (utilizzando l'approccio illustrato nella figura 3), è importante regolare il volume della coltura secondo il numero di cellule filtrate. Nel saggio norma, di solito incubare milione PBMC CD8-impoverito in 500 ml di mezzo. Tuttavia, quando si ordina cella sottoinsiemi, come le cellule T CD4, di solito dividere fino a 100.000 cellule. Per questo motivo, riduciamo il volume del mezzo di 200 microlitri per evitare di diluire le cellule e per ottenere una concentrazione di citochine che è rilevabile con l'array tallone. Per ogni esperimento, il volume delle colture cellulari deve essere sperimentalmente, prendendo in considerazione il tipo di cellula, il numero di cellule filtrate, la citochina di interesse, e la sensibilità del kit di rilevamento.
Un altro aspetto importante quando si esegue il test Luminex è inactivati viruson. Virus deve essere inattivato per poter eseguire in sicurezza campioni nello strumento. Tween-20 è stato usato per questo motivo. In precedenza, altri detergenti erano stati testati per questo scopo. Varie diluizioni dello 0,5% Tween, 5-10% Triton, e tampone di lavaggio sono stati aggiunti alle cellule infette da HIV e sono stati testati contro le cellule noninactivated. Tween è stato trovato per inattivare il virus migliore mentre interferire minimamente con gli esperimenti eseguiti.
Quando si esegue la citometria a flusso, un passo essenziale quando colorazione per monociti è di bloccare il recettore Fc con un reagente bloccante Fc per prevenire il legame non specifico degli anticorpi monoclonali. Il recettore Fc è presente sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene e si lega alla regione Fc degli anticorpi. Se questo recettore non è bloccato prima della colorazione, anticorpi monoclonali che vengono aggiunti per indirizzare marcatori specifici possono invece legarsi a questo recettore, dando così un risultato falso positivo. Ciò è particolarmente importante per evitare quando si analizzacitochine che derivano da un certo tipo di cellula, come non bloccare questo recettore potrebbe essere dannoso per i risultati. Celle di incubazione in terreni contenenti siero umano possono anche aiutare con questo problema, in quanto vi sono abbondanti quantità di IgG nel siero che si legano al recettore Fc.
Anche se i dosaggi Luminex forniscono rilevamento più sensibile rispetto ai dosaggi ICS, alcune molecole effettrici come IL-21 o perforina sono ancora difficili da rilevare con questo metodo. Questo approccio in vitro consente per l'analisi trascrizionale mediante qRT-PCR che fornisce una maggiore sensibilità nel rilevare altre molecole effettrici.
Un limite del nostro approccio sperimentale è che l'interpretazione dei risultati è difficile quando la citochina di interesse è prodotto da diverse sottopopolazioni di cellule del mix eterogeneo di leucociti presenti in PBMC interi o PBMC CD8-impoverito. Per esempio, questo è il caso per la citochina IL-10 che è upregulated in ty cella diversapes in un quadro di malattia progressiva HIV 8. Ordinamento della popolazione di interesse prima ulteriore incubazione e raccolta di surnatanti è un approccio alternativo abbiamo utilizzato con successo in questo contesto.
In sintesi, le tecniche presentate in questo documento definiscono in modo affidabile misurazione ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule CD4 o CD8 T in presenza di blocco dei PD-L1 e IL-10 percorsi immunomodulanti. Queste tecniche possono essere applicate nei casi in cui le citochine non sono facilmente rilevabili mediante citometria a flusso.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Gordon Freeman per fornire l'anticorpo blocco anti-PD-L1. Ringraziamo il personale clinico e di laboratorio presso il Massachusetts General Hospital e tutti i partecipanti di studio per il loro prezioso ruolo in questo progetto.
Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie Infettive dei National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), il National Heart Lung and Blood Institute dei National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK è supportato da un Research Scholar Premio alla Carriera della Salute Research Fund Quebec (FRQS). FP è supportata da una sovvenzione borsa di studio del General Hospital Comitato Esecutivo del Massachusetts per la ricerca e la Harvard Global Institute Salute (HGHI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
References
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