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Immunology and Infection

इन विट्रो परख में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल effector समारोह पर immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

हम एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव के नियमन में immunoregulatory रास्ते की भूमिका की जांच के लिए इन विट्रो परख विकसित की है.

Abstract

टी सेल थकावट क्रोनिक वायरल संक्रमण के दौरान विफल रोगज़नक़ निकासी में एक प्रमुख कारक है. ऐसे पीडी -1 और आईएल -10 के रूप में immunoregulatory रास्ते, चल रहे इस प्रतिजन जोखिम पर upregulated और प्रसार की कमी, कम cytolytic समारोह में योगदान है, और CD4 और CD8 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन प्रभावित कर रहे हैं. LCMV संक्रमण की murine मॉडल में, टी सेल प्रतिक्रिया संवर्धित इन दो रास्ते खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध का प्रशासन. बहरहाल, मानव नमूनों से कोशिकाओं में cytokine स्राव पर ऐसी नाकाबंदी के प्रभाव को मापने के लिए कोई इन विट्रो परख वर्तमान में है. हमारे प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सही और कुशलता से एचआईवी संक्रमित विषयों से एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन की बहाली यों करने के लिए सक्षम.

यहाँ, हम एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं और अन्य सेल पर उनके प्रभाव से cytokine स्राव की माप सक्षम बनाता है कि इन विट्रो में एक प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शातीएल कैंपेन्स. CD8 टी कोशिकाओं पूरे रक्त से समाप्त हो रहे थे और शेष PBMCs Ficoll जुदाई विधि के माध्यम से अलग थे. सीडी 8 समाप्त PBMCs तो एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर incubated रहे थे, पी.डी. एल 1 और / या आईएल 10Rα खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध और साथ incubated रहे थे. 48 घंटा, सतह पर तैरनेवाला मोती सरणियों और सेल छर्रों से साइटोकाइन विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया था के बाद QRT-पीसीआर का उपयोग cytometry या ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण प्रवाह का उपयोग कर प्ररूपी विश्लेषण के लिए या तो एकत्र किए गए थे. अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, अलग सेल आबादी PBMCs से चयनात्मक सबसेट कमी से या एक ही assays में मूल्यांकन किया जा रहा से पहले प्रवाह cytometry का उपयोग छँटाई के द्वारा प्राप्त किया गया. इन विधियों प्रतिजन विशेष टी सहायक कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन की मॉडुलन निर्धारित करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के बीच कार्यात्मक बातचीत निर्धारित करने के लिए एक बेहद संवेदनशील और विशिष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.

Introduction

लगातार वायरल संक्रमण के दौरान, वायरस विशिष्ट-टी कोशिकाओं टी सेल थकावट के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में कार्यात्मक दोष हासिल. प्रारंभिक क्रोनिक वायरल संक्रमण के murine LCMV मॉडल में vivo अध्ययन में समाप्त वायरस विशेष टी कोशिकाओं, virally संक्रमित कोशिकाओं के खिलाफ cytolytic समारोह कम पैदा करना करने की क्षमता खो देते हैं और इस तरह के आईएल -2, TNF-के रूप में साइटोकिन्स का उत्पादन करने की क्षमता को कम कर दिया है कि संकेत α और 1,2 IFN-γ. ऐसे पीडी -1 और आईएल -10 के रूप में immunoregulatory रास्ते में से एक जटिल नेटवर्क, पुराने संक्रमण के दौरान upregulated और (3,4 में समीक्षा) टी सेल रोग के लिए योगदान कर रहे हैं. में LCMV माउस में इन निरोधात्मक रास्ते खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध की विवो प्रशासन मॉडल टी सेल थकावट (5 में समीक्षा) एक आंशिक रूप से प्रतिवर्ती घटना का संकेत है कि, थक वायरस विशेष टी कोशिकाओं के समारोह और बढ़ाया वायरल निकासी बहाल.

वें पर निष्कर्षई LCMV मॉडल जल्दी से ऐसे एचबीवी, HCV और एचआईवी 5 के रूप में मानव क्रोनिक वायरल संक्रमण के लिए बढ़ा दिया गया. पुरानी एचआईवी -1 संक्रमण में, पीडी -1 और आईएल -10 रास्ते संक्रमित विषयों में upregulated हैं और सीडी 4 के साथ विपरीत रूप से वायरल लोड और साथ सीधे, रोग प्रगति के मानकों के साथ सहसंबंधी 6-8 गिनती. LCMV माउस मॉडल के समान, मानव में टी सेल थकावट एक आंशिक रूप से प्रतिवर्ती घटना है, यह दर्शाता है कि एचआईवी विशिष्ट CD4 और CD8 टी कोशिकाओं की इन विट्रो बहाल प्रसार में पीडी -1 या आईएल -10 रास्ते में से एंटीबॉडी नाकाबंदी. हालांकि, नाजुक मानव नमूनों पर प्रयोग की प्रकृति के साथ ही इन विट्रो assays, इन उपायों से हासिल कार्यात्मक बहाली प्रोफाइल के पूरी तरह से जांच की संवेदनशीलता में सीमाओं की वजह से ऊँची अनुपस्थित है. प्रसार assays, अब तक, सबसे अध्ययन में परीक्षण केवल विश्वसनीय में इन विट्रो परख कर दिया गया है, अभी तक इन अंतर के प्रभाव पर सबूत का एक उल्लेखनीय कमी हैपर ventions: साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं की 1) हत्या क्षमता, 2) वायरल प्रतिकृति पर टी कोशिकाओं की antiviral प्रभाव, 3) cytokine स्राव प्रोफाइल, और अन्य सेल सबसेट पर सीडी 4 टी सेल की मदद पर 4) प्रभाव.

Intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) एक बहुत ही उपयोगी और व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रवाह दोनों चूहों और इंसानों में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में साइटोकिन्स का उत्पादन का पता लगाने के लिए किया जाता है कि cytometry आधारित परख है. यह भी निरोधात्मक रास्ते में से एंटीबॉडी नाकाबंदी के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आईसीएस assays में cytokine स्राव Brefeldin और / या Monensin के अलावा द्वारा अवरुद्ध है. कोशिकाओं के अंदर फंस साइटोकिन्स तो अनेक रंगों फ्लो का उपयोग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ पाया जाता है. आम तौर पर प्रतिजन अलावा 2 घंटा के भीतर जोड़ रहे हैं जो Brefeldin और Monensin, दोनों कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं के बाद से परख की अवधि आमतौर पर प्रतिजन उत्तेजना के बाद 6 या 12 घंटे तक ही सीमित है. आईसीएस परख उपयोगी मैं कर दिया गया है कि एक शक्तिशाली तकनीक हैn कोशिकाओं एंटीबॉडी जोखिम 9 के बाद समय की एक निश्चित अवधि के बाद निकाले गए थे जहाँ चूहों में एंटीबॉडी हस्तक्षेप ब्लॉकिंग के vivo प्रशासन के प्रभाव की जांच. बहरहाल, मानव नमूनों में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की नाकाबंदी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के आवेदन के लिए कई सीमाएं हैं. इन विट्रो में एक 6 या 12 घंटा उत्तेजना (मानव नमूनों के साथ आम तौर पर मामले) में निरोधात्मक रास्ते में से एंटीबॉडी हस्तक्षेप करते समय मानक आईसीएस assays के द्वारा मापा के रूप में, ज्यादातर मामलों में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की नाकाबंदी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं जवाब की आवृत्ति को बदल नहीं है 6, 7. मतलब या मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता से मापा के रूप में प्रति सेल cytokine उत्पादन की माप असंगत परिणाम 6, 7, 10 दे दिया है. दूसरी ओर, आईसीएस के बाद एक देर समय बिंदु पर किया जाता है जब उत्तेजना (यानी छह दिन), साइटोकाइन स्रावित ग की संख्या में परिवर्तनएल्स मनाया जा सकता है. मतभेद बदल प्रसार, अस्तित्व, और समय 6 की निर्धारित अवधि में जमा कि effector समारोह में परिवर्तन का एक संयुक्त प्रभाव हैं. आंशिक रूप से इन सीमाओं को पार करने के लिए एक तरह से प्रसार होने के लिए इंतजार कर के बिना cytokine स्राव अवरोधक के अलावा पहले प्रतिजन साथ समय की लंबी अवधि (जैसे 36 घंटा, 60 घंटा, आदि.) के लिए सेते है. हम सफलतापूर्वक एचआईवी विशिष्ट CD4 और CD8 टी कोशिकाओं 11,12 द्वारा cytokine स्राव के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है, लेकिन, इस दृष्टिकोण छोटे प्रतिक्रियाओं पता लगाने में सक्षम नहीं है और कुल cytokine स्राव होने वाली एक एकीकृत परिणाम नहीं देंगे उत्तेजना के बाद से. इसलिए, आईसीएस supernatan में साइटोकाइन mRNA quantitation या cytokine स्राव की माप के साथ तुलना में सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स की मात्रा पर निरोधात्मक रास्ते की नाकाबंदी के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील पर्याप्त विधि नहीं हैएक ही समय बिंदुओं पर टी. इसके अतिरिक्त, सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स का सबसे सकारात्मक या नकारात्मक प्रतिक्रिया करने के लिए योगदान करके autocrine फैशन में अभिनय प्रतिजन कोशिकाओं के साथ बातचीत के माध्यम से छोरों. इसलिए, आईसीएस परख के दौरान Brefeldin या Monensin के अलावा cytokine स्राव को रोकता है और इस तरह टी कोशिकाओं की उत्तेजना इष्टतम नहीं है. अंत में, आईसीएस के साथ कई साइटोकिन्स का पता लगाने के प्रवाह cytometry साथ साइटोकिन्स का पता लगाने के साथ ही किसी भी पैनल में एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि fluorochromes की संख्या में कमी के द्वारा की उपलब्धता और एंटीबॉडी की संवेदनशीलता के द्वारा सीमित है.

हम कोशिकाओं (APCs) और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के. कोशिकाओं) पेश प्रतिजन के लिए एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव को विनियमित करने और बाद में सीडी 4 मदद में immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक बेहद संवेदनशील इन विट्रो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किया है. यह विधि भी IMPA मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैPBMCs से सीडी 4 टी कोशिकाओं घट द्वारा या केवल CD8 टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त हैं कि इष्टतम पेप्टाइड्स के साथ उत्तेजक द्वारा CD8 टी सेल समारोह पर निरोधात्मक अणुओं की नाकाबंदी की सीटी. , 2) एक व्यापक पैनल की जांच 1) उत्पादित साइटोकाइन के स्तर का एक और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव प्रदर्शन: intracellular साइटोकाइन धुंधला assays के विपरीत, हम करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव के साथ हस्तक्षेप नहीं करने का फैसला साइटोकिन्स या प्रेरक अणुओं की, और 3) अन्य सेल सबसेट पर एचआईवी विशिष्ट CD4 टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के प्रभाव का मूल्यांकन. हम ब्याज की immunoregulatory मार्ग के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध की उपस्थिति में एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ सीडी 8 समाप्त हो PBMCs को प्रोत्साहित. ऊष्मायन, आमतौर पर 48 घंटे की यात्रा के समय के बाद, हम मनका सरणियों साथ cytokine स्राव को मापने और अलग सेल सबसेट के प्ररूपी विश्लेषण के लिए या ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए या तो सेल छर्रों इकट्ठा करने के लिए supernatants इकट्ठा. टी पर ध्यान देंउसकी 48 घंटा समय बिंदु, हम टी कोशिकाओं 12 proliferating का एक महत्वपूर्ण आबादी का पता नहीं लगा. यह एक लचीला दृष्टिकोण है और इस डिजाइन के कई रूपांतरों विभिन्न परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, (जैसे एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं या पीडी -1 उच्च सीडी 4 टी कोशिकाओं के रूप में.) व्यक्तिगत सेल सबसेट supernatants और सेल छर्रों का संग्रह द्वारा पीछा किया 36 घंटे के लिए आगे ऊष्मायन से पहले ऊष्मायन के 12 घंटे के बाद हल किया जा सकता है अधिक विशेष रूप से PBMCs के परिभाषित subpopulations द्वारा cytokine स्राव पर नाकाबंदी के उपायों के प्रभाव की जांच करने के लिए.

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Protocol

1. Ficoll पृथक्करण के माध्यम से कमी और PBMCs का अलगाव

  1. पूरे रक्त के 50 μl / मिलीलीटर में मानव सीडी 8 + रिक्तीकरण कॉकटेल जोड़कर सीडी 8 + टी कोशिकाओं और गिरेगा.
  2. अच्छी तरह मिक्स और कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. ऊष्मायन के बाद, (सीए 2 + या 2 मिलीग्राम + बिना हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) HBSS के साथ पूरे रक्त मिश्रण और Histopaque के ऊपर परत. 30 मिनट (कोई ब्रेक, धीमी गति त्वरण) के लिए 340 आरसीएफ में स्पिन.
  4. PBMCs लीजिए और एक नया 50ml शंक्वाकार को हस्तांतरण. 340 आरसीएफ में 10 मिनट के लिए कताई द्वारा 50 आइयू पेनिसिलिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 1% HEPES के साथ पूरक 45 मिलीलीटर 1640 RPMI साथ धो 2x.

2. एंटीबॉडी नाकाबंदी और कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिजन उत्तेजना

  1. 50 आइयू पेनिसिलिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 1% HEPES के साथ पूरक 10% मानव सीरम युक्त RPMI 1640 में हालत प्रति 2x10 6 Resuspend कोशिकाओं,हालत प्रति 500 ​​μl के लिए लेखांकन.
  2. FACS ट्यूब प्रति सेल निलंबन की अशेष 500 μl.
  3. जांच मार्ग पर निर्भर करता है, पी.डी. एल 1, 10 माइक्रोग्राम / एमएल एंटीबॉडी और / या निर्धारण नियंत्रण अवरुद्ध आईएल 10Rα जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. 1 ग्राम / एमएल / पेप्टाइड अंतिम एकाग्रता में एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित. इसके अलावा प्रत्येक अवरुद्ध हालत के लिए एक "कोई उत्तेजना" नियंत्रण शामिल हैं. 37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 सेते हैं.

3. संग्रह और सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण

  1. 48 घंटे के बाद, 340 आरसीएफ में 7 मिनट के लिए FACS ट्यूबों नीचे स्पिन.
  2. ध्यान से गोली परेशान बिना Luminex मनका सरणियों के लिए Eppendorf ट्यूबों में 2 एक्स 225 μl सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
  3. 0.05% पीबीएस के बीच की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए 25 μl 0.5% पीबीएस के बीच के साथ एकत्र सतह पर तैरनेवाला में वायरस निष्क्रिय.
  4. Immed नहीं हैं कि स्टोर एकत्र supernatantsiately एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में इस्तेमाल किया.
  5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Millipore Luminex किट का उपयोग कर वांछित साइटोकाइन सांद्रता उपाय.

4. फ्लो के माध्यम से संग्रह और कोशिकाओं के प्ररूपी विश्लेषण

  1. सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के बाद, 3ml पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें. 340 आरसीएफ में 7 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन और अतिरिक्त धोने छानना.
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक मृत fixable / रहते मृत सेल दाग किट का उपयोग कर व्यवहार्यता के लिए दाग.
  3. 340 आरसीएफ में और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें 100 μl पीबीएस 1% FBS में Resuspend.
  4. FCR अभिकर्मक और मिश्रण करने के भंवर अवरुद्ध की 1.4 μl जोड़कर monocytes या अन्य प्रतिजन कोशिकाओं, ब्लॉक एफसी रिसेप्टर्स के लिए धुंधला हो जाना है.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते
  6. सतह एंटीबॉडी, भंवर जोड़ें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. , पीबीएस 1% FBS के साथ कोशिकाओं को धो अतिरिक्त धोने छानना, और 200 μl 4% paraformaldehyde जोड़ें. सेनाअंधेरे में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर.
  8. 250 μl पीबीएस 1% FBS में पीबीएस 1% FBS, resuspend के साथ कोशिकाओं को धो लें, और प्रवाह cytometer एक multilaser पर अधिग्रहण (जैसे बी.डी. LSRII या Fortessa).

5. QRT-पीसीआर के माध्यम से कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. कोशिकाओं के लिए फ्लो के माध्यम से विश्लेषण नहीं: सतह पर तैरनेवाला संग्रह के बाद, 1% बीटा mercaptoethanol युक्त 300 μl Qiagen बफर RLT में lyse कोशिकाओं. प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने यदि नहीं, तो कोशिकाओं को इस बिंदु के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जा सकता है.
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद एक शाही सेना अलगाव किट का उपयोग शाही सेना को अलग.
  3. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद एक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग शाही सेना से सीडीएनए synthesize.
  4. SYBR ग्रीन तकनीक का उपयोग कर मात्रात्मक पीसीआर प्रदर्शन करना.
  5. 10 के अंतिम एकाग्रता देने के लिए पानी से मुक्त nuclease को प्राइमरों जोड़कर गृह व्यवस्था जीन (जैसे आईएल 13, आईएल 10, IFN-γ, GAPDH) सहित इस्तेमाल प्रत्येक प्राइमर के लिए एक प्राइमर मिश्रण बनाएंमाइक्रोन. बर्फ पर रखें.
  6. अच्छी तरह से 10.5 μl nuclease मुफ्त पानी, 12.5 μl SYBR हरे, और प्लेट प्रति 1 μl प्राइमर मिश्रण जोड़कर प्रत्येक प्राइमर के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाएं. बर्फ पर रखें.
  7. उपयोग किया जाएगा कि थाली में से प्रत्येक कुएं में पिपेट 24 μl मास्टर मिश्रण.
  8. टेम्पलेट के अनुसार प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 μl सीडीएनए जोड़ें.
  9. 800 आरसीएफ में 3 मिनट के लिए कुओं और अपकेंद्रित्र थाली टोपी.
  10. एक QRT-पीसीआर मशीन, जैसे एक Stratagene MX3005P साधन पर थाली चलाएँ.

6. 48 घंटा में Intracellular Cytokine धुंधला के लिए अनुकूलन

Brefeldin और Monensin पूर्व intracellular साइटोकाइन धुंधला करने के लिए 6 घंटा जोड़ें. Monensin निर्माता के निर्देशों के अनुसार गयी है जबकि Brefeldin 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में जोड़ा जाता है. सुविधा के लिए, Brefeldin 5 ग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में दाग पिछले 12 घंटे में जोड़ा जा सकता है.

  1. सतह दाग के बाद, में के लिए पीबीएस 1% FBS और दाग के साथ कोशिकाओं को धोऐसे आईएल -12, IFN-γ, और एक नियतन / Permeabilization समाधान किट और प्रोटोकॉल का उपयोग TNF-α के रूप tracellular साइटोकिन्स.
  2. 250 μl पीबीएस 1% FBS में कोशिकाओं, resuspend धो लें, और (जैसे बी.डी. एलएसआर द्वितीय या Fortessa) प्रवाह cytometer एक multilaser पर चलाते हैं.

7. प्रकोष्ठों छंटनी के लिए अनुकूलन

  1. व्यवहार्यता के लिए उत्तेजना, दाग के बाद 16 घंटा निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार लाइव / मृत fixable मृत सेल दाग किट का उपयोग कर. पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
  2. 340 आरसीएफ में और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें 100 μl पीबीएस 1% FBS में Resuspend.
  3. मिश्रण को सतह एंटीबॉडी, भंवर जोड़ें, और 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर कोशिकाओं सेते हैं.
  4. 340 आरसीएफ में और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस 1% FBS के साथ कोशिकाओं को धो लें और 500 μl में Resuspend 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ठंड RPMI 1640 50 आइयू पेनिसिलिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 1% के साथ पूरक HEPES.
  5. 5 एमएल polysty का उपयोग कर फ़िल्टर कोशिकाओंसेल छलनी टोपी के साथ रेने दौर नीचे ट्यूब.
  6. भ्रूण गोजातीय सीरम 50 आइयू पेनिसिलिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और प्रत्येक ट्यूब 1% HEPES के साथ पूरक 10% से युक्त 200 μl 1640 RPMI जोड़कर प्रकार के लिए संग्रह ट्यूबों तैयार. सॉर्ट दौरान बर्फ पर सभी ट्यूबों रखें.
  7. लाइव एक साधन biohazardous सामग्री के लिए सुसज्जित एक सुविधा में स्थित (जैसे बी.डी. FACS Aria द्वितीय) पर ब्याज की सेल सबसेट सॉर्ट.
  8. कोशिकाओं को हल किया गया है, के बाद वापस समय के वांछित राशि के लिए इनक्यूबेटर में और सतह पर तैरनेवाला संग्रह / Luminex विश्लेषण और सेल गोली संकलन / पीसीआर विश्लेषण के साथ पालन जगह कोशिकाओं.

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Representative Results

इस में इन विट्रो प्रणाली का उपयोग कर साइटोकाइन माप प्रदर्शन करते हैं, तो यह उत्तेजना पर नियंत्रण नहीं की तुलना में विशिष्ट प्रतिजन प्रतिक्रियाओं भेद करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है. सामान्य में, हम उत्तेजना नियंत्रण और जो परख के रैखिक सीमा के भीतर थे नहीं की तुलना में साइटोकाइन के स्तर में कम से कम तीन गुना वृद्धि दे कि प्रतिजनी उत्तेजना के किसी भी मूल्यों के रूप में सकारात्मक प्रतिक्रियाओं पर विचार किया. हम कमजोर प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया निरीक्षण करने के लिए हमें सक्षम, 0.16 स्नातकोत्तर / एमएल के रूप में कम साइटोकिन्स की सांद्रता का पता लगा सकते हैं कि उच्च संवेदनशीलता मनका सरणी assays का उपयोग कर रहे हैं. नमूने कि सही मान प्राप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के क्रम में दो प्रतियों में चलाए जा रहे हैं. चित्रा 2A IFN-γ उत्पादन के लिए, परख कोई उत्तेजना की तुलना में 800 गुना वृद्धि की औसत पता लगा सकते हैं कि पता चलता है. इन मूल्यों को कोई उत्तेजना की तुलना में इस तरह के आईएल -13 और आईएल -2 के रूप में, क्योंकि उनमें से कुछ के लिए परीक्षण किया साइटोकिन्स,, कम मूल्यों पर निर्भर करेगामनाया जा. एक समान दृष्टिकोण विभिन्न साइटोकिन्स परीक्षण की mRNA के transcriptional रूपरेखा पर लागू होता है. चित्रा 2B उत्तेजना के बाद (अधिक से अधिक तीन गुना) में काफी वृद्धि हुई है कि IFN-γ के लिए mRNA के स्तर से पता चलता है. इस परख के साथ, IFN-γ प्रोटीन स्राव और IFN-γ mRNA स्तर (चित्रा -2) के बीच एक मजबूत संबंध है. हम एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल समारोह का अध्ययन करने के लिए इस में इन विट्रो दृष्टिकोण विकसित किया है, भले ही हम भी सफलतापूर्वक, पी.डी. एल 1 और / या एसईबी के साथ उत्तेजना के बाद सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया पर आईएल 10Rα नाकाबंदी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है anti-CD3/CD28, सीएमवी lysate और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग से आरडी -1 पेप्टाइड (डेटा) नहीं दिखाया. इस विधि वैक्सीन प्रेरित प्रतिक्रियाओं, उतना ही अच्छा. चित्रा 2 डी एचआईवी झूठ के साथ उत्तेजना अधिक IFN-γ स्राव में यह परिणाम है कि शो सहित बैक्टीरियल एंटीजन को प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि टेटनस toxoi साथ उत्तेजनाउच्च आईएल -13 स्राव में डी परिणाम, एचआईवी और टेटनस विशिष्ट सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया की विभिन्न साइटोकाइन प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन है.

इस परख की एक प्रमुख ताकत आईसीएस जैसे अन्य इन विट्रो assays द्वारा खोजे नहीं कि निरोधात्मक रास्ते के एंटीबॉडी में गड़बड़ी के बाद cytokine स्राव में अंतर का पता लगाने की क्षमता है. यह सतह पर तैरनेवाला में माप संभावित उत्पादन साइटोकाइन के स्तर को नजरअंदाज कर सकते हैं तो ऐसे आईएल -2 के रूप में कुछ साइटोकिन्स, कोशिकाओं द्वारा सेवन किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस कारण से, एंटीबॉडी नाकाबंदी के बाद मनाया साइटोकाइन स्राव में कोई मतभेद भी मनाया मतभेद में परिवर्तन की वजह से कर रहे हैं कि क्या मूल्यांकन करने के लिए mRNA स्तर पर पुष्टि की जानी चाहिए एक सेल उत्पादन प्रति. चित्रा 3A IFN पर एक पी.डी. एल 1 अवरुद्ध एंटीबॉडी के प्रभाव से पता चलता है -γ आत्मीय प्रतिजन के साथ उत्तेजना के 48 घंटे के बाद एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा और आईएल -2 स्राव. पीडी -1 मार्ग की नाकाबंदी आम तौर पर नहीं है एककोशिकाओं एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ प्रेरित कर रहे हैं जब किसी भी प्रतिजन उत्तेजना के बिना cytokine स्राव पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है लेकिन IFN-γ और आईएल -2 स्राव को बढ़ाता है. CD3 कोशिकाओं PBMCs से समाप्त हो रहे हैं, IFN-γ और आईएल -2 का स्राव एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी के जवाब में प्रेरित किया है यह दर्शाता है कि उत्तेजना (3B चित्रा) प्रतिजन के जवाब में उत्पादन नहीं IFN-γ या आईएल -2 है सेल प्रतिजन विशेष उत्तेजना. ऐसे आईएल -21 के रूप में कुछ साइटोकिन्स, के लिए, मनका सरणियों की संवेदनशीलता एचआईवी जैसे कमजोर प्रतिजन प्रतिक्रियाओं के बाद प्रोटीन के स्तर का पता लगाने की अनुमति नहीं है. उन साइटोकिन्स के लिए, mRNA की मात्रा का ठहराव के बजाय 12 किया जा सकता है.

ऐसे IFN-γ और TNF-α के रूप में कुछ साइटोकिन्स, सेल सबसेट की एक किस्म से उत्पादन किया जा सकता है. सीडी 8 समाप्त PBMCs पर प्रयोगों प्रदर्शन है, यह प्रोटीन का स्राव का स्रोत identfy कभी कभी बहुत मुश्किल है, और इसलिए, यह सेल सबसेट की पहचान करना मुश्किल है कि जिम्मेदारीनिरोधात्मक अणुओं की नाकाबंदी करने के लिए ded. हम उनके प्ररूपी विशेषताओं के अनुसार अलग सेल सबसेट छँटाई द्वारा cytokine स्राव पर निरोधात्मक अणुओं को अवरुद्ध के प्रभाव की एक अधिक व्यापक जांच करने के लिए इस विधि का एक संस्करण विकसित किया है इस कारण से. 4 IFN पर पीडी -1 नाकाबंदी के प्रभाव से पता चलता है -γ छांटी गई सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा secreted और आईएल -2. इस प्रयोग के लिए, सीडी 8 समाप्त PBMCs एक अवरुद्ध पी.डी. एल 1 एंटीबॉडी या एक निर्धारण नियंत्रण की उपस्थिति में 12 घंटे के लिए प्रेरित किया गया. 12 घंटे के बाद, कोशिकाओं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और सीडी 4 टी कोशिकाओं के साथ दाग सतह सेल सॉर्टर एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर हल किया गया थे. क्रमबद्ध किया गया CD4 टी कोशिकाओं को फिर 36 घंटे के लिए आगे incubated रहे थे और साइटोकिन्स रूप में ऊपर वर्णित मनका सरणियों का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला में मापा गया. हम सफलतापूर्वक पीडी -1 अभिव्यक्ति के अपने स्तर के अनुसार सीडी 4 टी कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए अतीत में इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है और पी.डी. एल 1 नाकाबंदी एचआईवी सपा के समारोह बहाल कर सकते हैं कि पता चला है पीडी -1 12 के उच्च स्तर व्यक्त कि ecific CD4 टी कोशिकाओं.

एचआईवी संक्रमण में शासी टी सेल समारोह के रूप में पहचान immunoregulatory रास्ते की संख्या लगातार बढ़ती जा रही है. हम सफलतापूर्वक एचआईवी -1 से विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं 8,13 द्वारा IFN-γ और आईएल -2 स्राव पर आईएल -10 नाकाबंदी के प्रभाव को दिखाने के लिए अतीत में इस परख का इस्तेमाल किया है. इस विधि के लाभ में से एक immunoregulatory अणुओं प्रतिजन कोशिकाओं के साथ एचआईवी विशिष्ट CD4 टी कोशिकाओं (APCs) के परस्पर क्रिया को विनियमित कैसे मूल्यांकन करने की क्षमता है. चित्रा 5A से आईएल -12 स्राव बहाल करने पर आईएल -10 नाकाबंदी के प्रभाव से पता चलता है प्रतिजन कोशिकाओं पेश. इस तकनीक का एक अनुकूलन के साथ, उत्तेजना के बाद 48 घंटे में आईसीएस प्रदर्शन करके, हम monocytes एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल (चित्रा 5 ब) के साथ उत्तेजना के बाद आईएल -12 का प्राथमिक स्रोत हैं कि दिखाने के लिए सक्षम थे.

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चित्रा 1. एचआईवी संक्रमित विषयों से कार्यप्रणाली. पृथक सीडी 8 समाप्त PBMCs के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 15 मिनट निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ या पी.डी. एल 1 या आईएल 10Rα खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध या तो के लिए incubated हैं. एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ एक 48 घंटा उत्तेजना के बाद, supernatants मनका सरणियों और सेल छर्रों के साथ cytokine स्राव की माप के लिए एकत्र कर रहे हैं प्रवाह cytometry या QRT-पीसीआर का उपयोग mRNA स्तर के transcriptional विश्लेषण का उपयोग प्ररूपी विश्लेषण के लिए या तो एकत्र कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. MRNA या प्रोटीन स्राव के साथ प्रतिजन विशेष टी सेल प्रतिक्रिया की जांच. एक: एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ प्रेरित सीडी 8 समाप्त PBMCs. IFN-γ स्राव उत्तेजना के बाद 48 घंटे में मापा गया था बी:. IFN-γ mRNA स्तरउत्तेजना के बाद 48 घंटे में सेल छर्रों में QRT-पीसीआर के साथ मापा गया सी:. IFN-γ mRNA स्तर के साथ supernatants में IFN-γ एकाग्रता का संबंध. डी:. IFN-γ और एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल या टिटनेस toxoid के साथ प्रेरित सीडी 8 समाप्त PBMCs के बीच आईएल -13 प्रोटीन के स्तर की तुलना में बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. . निरोधात्मक रास्ते के हेरफेर के बाद cytokine स्राव के परिवर्तन सीडी 4 टी सेल निर्भर है और बी: सीडी 8 समाप्त हो या CD3 समाप्त हो PBMCs निर्धारण नियंत्रण या पी.डी. एल 1 अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ प्रेरित किया. IFN-γ और आईएल -2 स्राव उत्तेजना के बाद 48 घंटे में मापा गया था.


चित्रा 4. पीडी -1 नाकाबंदी की जोड़ - तोड़ के बाद cytokine स्राव का पता लगाने के लिए सीडी 4 टी कोशिकाओं छंटनी. एबी: तीन चिरकाल संक्रमित, अनुपचारित विषयों से सीडी 8 समाप्त PBMCs एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ incubated या निर्धारण नियंत्रण या पी.डी. एल 1 अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में 12 घंटे के लिए unstimulated छोड़ दिया गया. CD4 टी कोशिकाओं को फिर नकारात्मक लिम्फोसाइटों पर वंश अपवर्जन द्वारा चयनित और 36 घंटे के लिए आगे incubated रहे थे.

चित्रा 5
चित्रा 5. सीडी 4 टी कोशिकाओं और प्रतिजन कोशिकाओं पेश बीच परस्पर क्रिया. एक: सीडी 8 समाप्त PBMCs निर्धारण नियंत्रण या आईएल 10Rα अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ प्रेरित किया गया. . सतह पर तैरनेवाला में आईएल -12 के स्तर उत्तेजना बी के बाद 48 घंटे में मापा गया:सीडी 8 समाप्त PBMCs एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ प्रेरित किया. Monocytes पर आईएल -12 स्राव उत्तेजना के बाद 48 घंटे में आईसीएस के साथ मापा गया था.

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Discussion

सतह पर तैरनेवाला संग्रह इस प्रयोगात्मक डिजाइन का एक अनिवार्य हिस्सा है. Luminex परख के लिए supernatants कटाई करते हैं, aliquots बनाया और चक्र पिघलना फ्रीज की वजह से प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था. ठंड और विगलन प्रोटीन के लिए, और फ्रीज thaws कम करके कठोर प्रक्रियाओं हो सकता है, संकेत assays में अधिकतम करना होगा. इसलिए, यह कई बार एक ही नंबर फ्रीज thawed किया गया है कि aliquots से काम कर जब repeatable और अधिक सटीक डेटा प्राप्त करना आसान है.

हम पहले से एचआईवी चुप पेप्टाइड पूल 12 के साथ उत्तेजना के बाद cytokine स्राव और mRNA स्तर की गतिज विश्लेषण प्रदर्शन किया है. इन कैनेटीक्स के आधार पर हमने cytokine स्राव माप प्रदर्शन करने के लिए 48 घंटे का समय बिंदु चुना है. MRNA और प्रोटीन स्राव के साथ ही विभिन्न उत्तेजनाओं के बीच के बीच मनाया मतभेद को देखते हुए यह शोधकर्ताओं उत्तेजनाओं के आधार पर अपने स्वयं के गतिज विश्लेषण प्रदर्शन जरूरी है किवे mRNA अभिव्यक्ति या प्रोटीन cytokine स्राव को मापने हैं कि क्या उपयोग और.

सेल सबसेट (3 चित्र में दिखाया दृष्टिकोण का उपयोग) हल कर रहे हैं, जब वह क्रमबद्ध सेल नंबर के अनुसार संस्कृति की मात्रा को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. मानक परख में, हम आम तौर पर मध्यम के 500 μl में 1 लाख सीडी 8 समाप्त PBMCs सेते हैं. हम तरह तरह के सीडी 4 टी कोशिकाओं के रूप में कैंपेन्स, सेल हालांकि, जब हम आम तौर पर 100,000 कोशिकाओं को सॉर्ट. इस कारण से, हम कोशिकाओं गिराए से रखने के लिए और मनका सरणी के साथ detectable है कि एक साइटोकाइन एकाग्रता हासिल करने के लिए 200 μl के लिए माध्यम की मात्रा कम होती है. एक प्रयोग के लिए, सेल संस्कृतियों की मात्रा प्रयोगात्मक ध्यान में सेल प्रकार, सेल नंबर हल, ब्याज की साइटोकाइन, और जांच किट की संवेदनशीलता लेने, परीक्षण किया जाना चाहिए.

Luminex परख प्रदर्शन जब एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू वायरस inactivati ​​हैपर. वायरस सुरक्षित रूप से साधन पर नमूने को चलाने के लिए सक्षम होने के लिए निष्क्रिय किया जाना चाहिए. बीच 20 इस कारण के लिए इस्तेमाल किया गया था. इससे पहले, दूसरे डिटर्जेंट इस उद्देश्य के लिए परीक्षण किया गया था. 0.5% बीच, 5-10% ट्राइटन, और धोने बफर के विभिन्न dilutions एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया और noninactivated कोशिकाओं के खिलाफ जांच कर रहे थे. बीच प्रदर्शन किया assays के साथ कम से कम दखल जबकि सर्वश्रेष्ठ वायरस को निष्क्रिय करने के लिए पाया गया था.

प्रवाह cytometry प्रदर्शन, monocytes के लिए धुंधला हो जाना जब एक आवश्यक कदम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की अविशिष्ट बंधन को रोकने के लिए एक एफसी अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ एफसी रिसेप्टर ब्लॉक करने के लिए है. एफसी रिसेप्टर प्रतिजन कोशिकाओं की सतह पर मौजूद है और एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र को बांधता है. इस रिसेप्टर धुंधला पहले अवरुद्ध नहीं है, तो विशिष्ट मार्करों लक्षित करने के लिए जोड़ रहे हैं कि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय इसलिए एक झूठी सकारात्मक परिणाम दे रही है, इस रिसेप्टर के लिए बाध्य कर सकते हैं. इस विश्लेषण करते समय से बचने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैइस रिसेप्टर अवरुद्ध नहीं के रूप में, एक निश्चित सेल प्रकार से प्राप्त साइटोकिन्स कि परिणाम के लिए हानिकारक हो सकता है. मानव सीरम युक्त मीडिया में incubating कोशिकाओं को भी एफसी रिसेप्टर के लिए बाध्य है कि सीरम में आईजीजी के प्रचुर मात्रा में हैं, के रूप में इस मुद्दे के साथ मदद कर सकते हैं.

Luminex assays आईसीएस assays की तुलना में अधिक संवेदनशील पता लगाने प्रदान करते हैं, जैसे कि आईएल -21 या perforin के रूप में कुछ प्रेरक अणुओं अभी भी इस विधि के साथ पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है. यह इन विट्रो दृष्टिकोण अन्य प्रेरक अणुओं का पता लगाने में अधिक से अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है कि QRT-पीसीआर का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की एक सीमा ब्याज की साइटोकाइन पूरे PBMCs या सीडी 8 समाप्त PBMCs में मौजूद leukocytes की विषम मिश्रण से अलग सेल सबसेट द्वारा निर्मित है जब उसके परिणामों की व्याख्या मुश्किल है. उदाहरण के लिए, यह अलग सेल ty में upregulated है जो साइटोकाइन आईएल -10 के लिए मामला हैप्रगतिशील एचआईवी रोग 8 की सेटिंग में PES. Supernatants के आगे ऊष्मायन और संग्रह से पहले ब्याज की आबादी की छंटनी हम सफलतापूर्वक इस संदर्भ में इस्तेमाल किया है एक वैकल्पिक तरीका है.

संक्षेप में, इस अखबार में प्रस्तुत तकनीक पी.डी. एल 1 और आईएल -10 immunoregulatory रास्ते की नाकाबंदी की उपस्थिति में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 या CD8 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन की बहाली को मापने का एक विश्वसनीय साधन प्रदान करते हैं. इन तकनीकों में साइटोकिन्स फ्लो द्वारा आसानी से detectable नहीं कर रहे हैं, जहां मामलों में लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम विरोधी पी.डी. एल 1 अवरुद्ध एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए गॉर्डन Freeman धन्यवाद. हम मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल और इस परियोजना में उनके अमूल्य भूमिका के लिए सभी अध्ययन प्रतिभागियों में नैदानिक ​​और प्रयोगशाला स्टाफ को धन्यवाद.

राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान (RO1 एच. एल-092565, DEK) है, यह अध्ययन नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DEK PO1 एआई 080192) के संक्रामक रोगों ने सहारा दिया. DEK क्यूबेक स्वास्थ्य अनुसंधान कोष की एक रिसर्च स्कॉलर कैरियर पुरस्कार (FRQS) द्वारा समर्थित है. एफपी अनुसंधान और हार्वर्ड विश्व स्वास्थ्य संस्थान (HGHI) पर मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के कार्यकारी समिति के एक फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

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References

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

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<em>इन विट्रो</em> परख <em>में</em> एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल effector समारोह पर immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए
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Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, … More

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

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