Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Abstract

T hücre bitkinlik kronik viral enfeksiyonlar sırasında başarısız patojen klirensinde önemli bir faktördür. Örneğin PD-1 ve IL-10 gibi bağışıklık düzenleyici yolları, bu devam eden antijen maruz kalma üzerine yukarı regüle ve proliferasyonu kaybı, düşük sitolitik işlevine katkı ve CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından sitokin üretimi bozulmaktadır. LCMV enfeksiyonunun murin modelinde, T hücresi tepkilerini artmış olarak bu iki yolun karşı bloke edici antikorların uygulanması. Bununla birlikte, insan örneklerinden hücrelerinde sitokin salgılanması üzerindeki bu blokajı etkisini ölçmek için bir in vitro deney, şu anda mevcuttur. Bizim protokolü ve deneysel yaklaşım doğru ve verimli bir şekilde HIV bulaşmış bireylerden HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından sitokin üretiminin restorasyon ölçmek için olanak sağlar.

Burada, HIV-özgü CD4 T hücreleri ve diğer cel üzerindeki etkisi ile sitokin salgılanmasının ölçümü sağlayan bir in vitro deney tasarımı tasvirl kümeler. CD8 T hücreleri, bütün kandan tükenmiş ve kalan PBMC Ficoll ayırma yöntemi ile izole edildi. CD8-tükenmiş PBMC daha sonra, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarıldıktan sonra, hücreler, 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edildi, PD-L1 ve / veya IL-10Rα karşı bloke edici antikor ile inkübe edilmiştir. 48 saat sonra, yüzer boncuk diziler ve hücre topakları tarafından sitokin analizi için toplandı, sonra, qRT-PCR kullanılarak sitometri veya transkripsiyonel analizi kullanılarak akış fenotipik analizi ya da toplandı. Daha ayrıntılı analiz için, farklı hücre popülasyonları PBMC'lerden selektif alt azalması ile ya da aynı deneylerde değerlendirilen önce akış sitometrisi kullanılarak sıralama ile elde edilmiştir. Bu yöntemler, antijene özgü T-yardımcı hücreleri tarafından sitokin üretiminin modülasyonu tespit etmek ve bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlar arasında fonksiyonel etkileşimi belirlemek için son derece hassas ve özel bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Kalıcı viral enfeksiyonlar esnasında, virüs spesifik T-hücreleri, T hücresi bitkinlik olarak bilinen bir işlem fonksiyonel kusurlar kazanır. Erken kronik viral enfeksiyonun LCMV murin modelinde in vivo çalışmalarda tükenmiş virüs spesifik T hücreleri, viral yönden enfekte edilmiş hücrelere karşı sitolitik fonksiyon düşük çoğalma yeteneğini kaybeder ve bu IL-2, TNF-a gibi sitokinler üretmek için kapasitesi düşük olduğunu göstermiştir α ve 1,2 IFN-γ. Örneğin PD-1 ve IL-10 gibi bağışıklık yolların, karmaşık bir ağ, kronik enfeksiyonlar sırasında yukarı düzenlenen ve (3,4 gözden) T hücre fonksiyon bozukluğuna katkıda bulunur. Olarak, LCMV fare Bu engelleyici yolların karşı bloke edici antikor vivo tatbikat model T hücresi tükenme (5 gözden), kısmen geri fenomen olduğunu gösteren, tükenmiş virüs spesifik T hücrelerinin fonksiyonunu ve gelişmiş viral açıklık geri.

Th BulgularE LCMV modeli hızlı bir şekilde HBV, HCV ve HIV 5 gibi insan kronik viral enfeksiyonların uzatıldı. Kronik HIV-1 enfeksiyonunda, PD-1 ve IL-10 yollar enfekte olmuş kişilerde yukarı regüle edilir ve CD4 ile ters viral yük ve doğrudan, hastalığın ilerlemesi parametreleri ile ilişkili 6-8 sayılır. LCMV fare modeline benzer, insanlardaki T hücresi tükenme, kısmen geri olgudur belirten HIV spesifik CD4 ve CD8 T hücrelerinin in vitro çoğalması geri PD-1 ya da IL-10 yollarının antikor blokajı. Bununla birlikte, hassas insan örnekleri üzerinde deneyler doğa hem de in vitro deneyleri, bu girişimlerin elde fonksiyonel restorasyon profillerin ayrıntılı soruşturma duyarlılığında sınırlamalar nedeniyle çarpıcı yoktur. Çoğalma deneyleri, bugüne kadar, çoğu çalışmalarda test tek güvenilir in vitro deney olmuştur, ancak bu Inter etkisi üzerine kanıt dikkate değer bir eksikliği varon VENTIONS: sitotoksik T hücrelerinin 1) öldürme kapasitesi, 2) viral replikasyonu üzerindeki T hücrelerinin antiviral etkisi, 3) sitokin sekresyon profili ve diğer hücre alt-gruplarla ilgili CD4 T hücresi yardımıyla 4) etkisi.

Hücre içi sitokin boyama (ICS) bir çok yararlı ve yaygın olarak kullanılan bir akım farelerde ve insanlarda hem de çeşitli hücre tiplerinde sitokinlerin üretimini tespit etmek için kullanılır sitometrisi göre deneyidir. Ayrıca inhibitör yollarının antikor ablukasının etkisini araştırmak için kullanılır olmuştur. ICS deneylerinde, sitokin salgılama Brefeldin ve / veya Monensin ilavesiyle engellenir. Hücrelerin içinde sıkışıp sitokinler sonra çok renkli akış sitometrisi kullanılarak floresan antikorlar ile tespit edilir. Tipik olarak antijen ilave 2 saat içinde ilave edilir ve Brefeldin Monensin, hem de hücreler için toksik olmasından dolayı, tahlilin süresi genellikle antijen stimülasyonu sonrası 6 veya 12 saat ile sınırlıdır. ICS deney yararlı i olmuştur güçlü bir tekniktirn hücreleri, antikor maruz 9 sonra belli bir süre sonra ekstre edildi farelerde antikor müdahale bloke in vivo etkisinin araştırılması. Bununla birlikte, insan örneklerinde inhibitör reseptörlerin blokajı etkisini değerlendirmek için bu deneysel yaklaşımın uygulanması için çeşitli sınırlamalar vardır. In vitro olarak, bir 6 ya da 12 saat stimülasyonu (insan örnekleri tipik durum) 'de önleyici bir yollarının antikor müdahaleler gerçekleştirirken, standart ICS deneyleri ile ölçüldüğü haliyle, çoğu durumda önleyici reseptörlerinin blokajı antijen-spesifik T hücrelerinin yanıt sıklığını değiştirmez 6, 7. Ortalama yoğunluğu ya da ortalama floresan ile ölçülen hücre başına sitokin üretiminin ölçümü tutarsız sonuçlar 6, 7, 10, verdik. Öte yandan, ICS sonra geç bir zaman noktasında gerçekleştirildiğinde stimülasyonu (yani altı gün), sitokin salgılayan c sayısındaki değişimlerarşın gözlenebilir. Farklılıklar değiştirilmiş çoğalma, hayatta kalma ve zaman 6'daki belirtilen süre boyunca birikir efektör fonksiyonu değişiklikleri, bir kombine etkisi vardır. Kısmen, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için bir yolu yayılması ortaya beklemeden sitokin salgı engelleyicinin ilave edilmeden önce antijen ile daha uzun bir süre (örneğin, 36 saat, 60 saat vs.) Boyunca inkübe etmektir. Başarıyla HIV spesifik CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından 11,12 sitokin salgılanmasının kinetiklerini belirlemek için bu yöntemi kullandık, ancak bu yaklaşım küçük tepkiler tespit etmek mümkün değildir ve toplam sitokin salgı meydana gelen entegre bir sonucu vermeyecektir stimülasyon beri. Bu nedenle, ICS supernatan sitokin mRNA miktarının ya da sitokin salgılanması ölçümleri ile karşılaştırıldığında aktive T hücreleri tarafından üretilen sitokin inhibe edici miktarına yollarının blokajı etkisini tespit etmek için yeterince hassas bir yöntem değildirAynı zaman noktalarında t. Ayrıca, aktive edilmiş T hücreleri tarafından üretilen sitokinlerden çok pozitif ya da negatif geri besleme katkıda otokrin bir şekilde hareket antijen sunan hücreler ile etkileşim aracılığıyla döner. Bu nedenle, tahlil sırasında ICS Brefeldin veya Monensin ilavesi sitokin salgılanmasını önler ve böylece T hücrelerinin uyarılması optimal değildir. Son olarak, ICS ile birden fazla sitokin tespiti akış sitometrisi ile sitokinlerin belirlenmesi yanı sıra, herhangi bir panelde aynı anda kullanılabilir fluorochromes sayısında kısıtlamalar tarafından kullanılabilirliği ve antikorlar duyarlılığı ile sınırlıdır.

Biz hücreler (APC) ve doğal öldürücü hücreler (NK hücreleri) sunulması antijen HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salınımını düzenleyen ve daha sonra CD4 yardım içinde immünregulatuar yolların etkisini değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro deneysel bir yaklaşım geliştirdi. Bu yöntem, aynı zamanda Çarpışma değerlendirmek için kullanılabilirPBMC'lerden CD4 T hücreleri tüketen veya sadece CD8 T hücreleri tarafından tanınan uygun peptitler ile uyarılmasıyla CD8 T hücre işlevi üzerindeki inhibitör moleküllerinin blokajının ct. , 2), daha geniş bir paneli araştırmak 1) üretilmiş sitokin düzeylerinin daha doğru bir ölçümü gerçekleştirmek: hücre içi sitokin boyama deneyleri aksine olarak, edebilmek amacıyla, HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından sitokin salgılanması ile müdahale karar sitokinler veya efektör moleküller, ve 3) diğer hücre alt-gruplarla ilgili HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından üretilen sitokin etkisini değerlendirmek. Biz, ilgi konusu bağışıklık yolu için bloke edici antikorların mevcudiyetinde bir HIV-1 Gag peptidi havuzlu CD8 tükenmiş PBMC uyarır. Inkübasyon, genellikle 48 saat içinde arzu edilen süre sonra, boncuk dizileri ile sitokin salgılanmasını ölçmek ve farklı hücre alt fenotipik analizi için ya da transkripsiyonel analizi için ya da hücre pelletleri toplamak için süpernatantlar toplamak. Of t dikkat,Onun 48 saat zaman noktası, biz T hücreleri 12 çoğalan önemli bir nüfus tespit yok. Bu esnek bir yaklaşım ve bu tasarımın bazı uyarlamaların farklı hipotezler gidermek için uygulanabilir. Örneğin, (örneğin, vb HIV spesifik CD4 T hücreleri veya PD-1 yüksek CD4 T hücreleri gibi). Tek hücre alt yüzer ve hücre topakları toplanması ve ardından 36 saat süre ile inkübasyondan önce, daha kuluçkalamadan 12 saat sonra sıralanabilir daha spesifik PBMC'lerin tanımlanmış alt popülasyonlar tarafından sitokin salgılanması üzerindeki abluka müdahalelerin etkisini araştırmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Ficoll ayırma yoluyla tükenmesi ve PBMC'lerin izolasyonu

  1. Tam kan, 50 ul / ml 'de insan CD8 + tükenmesi kokteyli eklenerek CD8 + T hücrelerinin tüketilmesi.
  2. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında (18-25 ° C) 'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, (Ca2 + veya Mg2 + olmaksızın Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) HBSS ile tam kan karıştırın ve Histopaque fazla tabaka. 30 dakika (hiçbir fren, yavaş hızlanma) için 340 RCF Spin.
  4. PBMC'Ierde toplamak ve yeni bir 50ml konik transfer. 340 RCF 10 dakika boyunca iplik 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 HEPES ile takviye edilmiş 45 ml RPMI 1640 ile yıkayın 2x.

2. Antikor Blockade ve Hücreler antijen-spesifik uyarım

  1. 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 HEPES ile takviye edilmiş,% 10 insan serumu ihtiva eden RPMI 1640 içinde durum başına 2x10-6 yeniden süspanse hücre,durum başına 500 ul için muhasebe.
  2. FACS tüp başına hücre süspansiyonu kısım 500 ul.
  3. Incelenen yolu bağlı olarak, PD-L1, 10 ug / ml 'de antikorlar ve / veya izotip kontrolleri IL-bloke 10Rα ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO2 de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  4. 1 ug / ml / peptid nihai konsantrasyonda, bir HIV-1 Gag peptidi havuzlu hücreleri uyarır. Ayrıca, her bir durum için bir bloke "no uyarım" kontrolü içerir. 37 ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.

3. Toplama ve süpernatanı üzerinde yapılan analiz

  1. 48 saat sonra, 340 rcf 7 dakika FACS tüpler aşağı spin.
  2. Dikkatle pelet bozmadan Luminex boncuk dizileri için Eppendorf tüpleri 2 x 225 ul süpernatant toplamak.
  3. % 0.05 PBS-Tween bir son konsantrasyon vermek üzere 25 ul% 0.5 'lik PBS-Tween ile toplanan süpernatan içinde virüs etkisiz hale getirirler.
  4. Immed değildir Mağazası toplanan süpernatanlanVakit kaybetmeden bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir.
  5. Üreticinin protokolüne göre Millipore Luminex kiti kullanılarak istenen sitokin konsantrasyonları ölçün.

4. Sitometrisi yoluyla Toplama ve Hücre Fenotipik Analizi

  1. Süpernatant topladıktan sonra, 3 ml PBS içinde hücreleri yıkayın. 340 rcf 7 dakika hücreleri Spin ve aşırı yıkama süzün.
  2. Üreticinin protokolüne göre bir DEAD tamir edilebilir / CANLI Ölü Hücre Leke Kit kullanarak canlılığı için leke.
  3. 340 RCF ve 4 ° C 'de, 7 dakika boyunca PBS içinde hücreler yıkayın 100 ul PBS% 1 FBS içinde süspanse edin.
  4. FcR reaktifi ve karıştırmak için girdap bloke 1.4 ul ekleyerek, monositler veya başka antijen sunan hücreler, blok Fc reseptörleri için boyama durumunda.
  5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe
  6. Yüzey antikorlar, vorteks ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  7. , PBS,% 1 FBS hücreleri yıkayın fazla yıkama süzün ve 200 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. Kuluçkaya yatmakKaranlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
  8. 250 ul PBS,% 1 FBS içinde PBS,% 1 FBS, tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi üzerinde elde MULTILASER (örneğin BD LSRII veya Fortessa).

5. QRT-PCR ile analiz Hücrelerinin

  1. Hücreleri için akış sitometri ile analiz değil: yüzer toplama sonra,% 1 beta-merkaptotanol içeren 300 ul Oiagen Tampon RLT içinde lyse hücreler. Protokolü ile devam değilse, hücreler bu noktadan sonra -80 ° C 'de dondurulabilir.
  2. Üreticinin protokolü takip edilerek, bir RNA izolasyon kiti kullanarak, RNA izole edilir.
  3. Üreticinin protokolü takip edilerek, bir cDNA sentez kiti kullanılarak RNA'dan cDNA sentez.
  4. SYBR Green teknolojisi kullanılarak kantitatif PCR gerçekleştirin.
  5. 10 uM'lik nihai bir konsantrasyon vermek üzere su içermeyen nükleaz primerlerin eklenmesiyle hazırlık geninin (örneğin, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) dahil olmak üzere, kullanılan her bir primer için bir primer karışımını oluşturmakuM. Buz üzerinde tutmak.
  6. 10,5 ul nükleazsız su, 12.5 ul SYBR yeşil ve plaka başına 1 ul primer karışımı ekleyerek her primer için bir ana karışımı oluşturun. Buz üzerinde tutmak.
  7. Kullanılacak, plakanın her oyuğuna pipetle 24 ul ana karışımı.
  8. Şablona göre her kuyuya 1 ul cDNA ekleyin.
  9. 800 rcf 3 dakika boyunca kuyu ve santrifüj plaka Cap.
  10. Bir Mah-PCR makinesi, örneğin bir Stratagene MX3005P enstrüman üzerinde plakayı.

6. 48 saat sonra hücre içi sitokin boyama için İntibak

Brefeldin ve Monensin önce hücre içi sitokin boyama 6 saat ekleyin. Monensin, üreticinin talimatlarına uygun olarak ilave edilirken Brefeldin 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Kolaylık sağlamak için, Brefeldin 5 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda leke önce 12 saat eklenebilir.

  1. Yüzey leke sonra, en çok PBS% 1 FBS ve leke ile yıkama hücreleriIL-12, IFN-γ, ve bir tespit / Permeabilization Solution kiti ve protokol kullanılarak TNF-α gibi ekstrasellüler sitokinler.
  2. 250 ul PBS,% 1 FBS içinde hücreler tekrar süspansiyon yıkayın ve (örneğin, BD LSR II veya Fortessa) akış sitometresi bir MULTILASER çalışır.

7. Hücreleri Ayırma adaptasyon

  1. Canlılığı için stimülasyon, leke sonra 16 saat üreticinin protokolüne göre / CANLI ÖLÜ tamir edilebilir Ölü Hücre Leke Kit kullanarak. Tüm işlem sırasında hücreleri buz üzerinde tutun.
  2. 340 RCF ve 4 ° C 'de, 7 dakika boyunca PBS ile yıkayın hücrelerin 100 ul PBS% 1 FBS içinde süspanse edin.
  3. Karıştırmak için yüzey antikorlar, vorteks ekleyin ve 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde hücrelerin inkübe edilir.
  4. 340 RCF ve 4 ° C'de PBS,% 1 FBS ile yıkanır ve hücreler tekrar süspansiyon 500 ul% 10 Fetal Bovine Serum ihtiva eden soğuk RPMI 1640 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 ile desteklenmiş hepes.
  5. 5 ml polistiro kullanılarak Filtre hücreleriHücre-Süzgeç kapaklı rene Yuvarlak Dipli Tube.
  6. Fetal Bovine Serum 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin, ve her bir tüpe,% 1 HEPES ile takviye edilmiş% 10 ihtiva eden 200 | il RPMI 1640 eklenmesi ile bir tür toplama tüpleri hazırlayın. Sıralama sırasında buz üzerinde tüm tüpler tutun.
  7. Canlı bir enstrüman biyozararli malzeme için donanımlı bir tesiste bulunan (örn. BD FACS Aria II) faiz hücre alt sıralamak.
  8. Hücreler kriteri edildikten sonra, geriye zaman istenilen miktarda inkübatör ve yüzer toplama / Luminex analizi ve hücre topağı toplama / PCR analizi ile takip yer hücreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu in vitro bir sistem kullanılarak sitokin ölçümleri gerçekleştirirken, bu uyarım kontrol ile karşılaştırıldığında herhangi bir antijene özgü yanıtları ayırt edebilmek için gereklidir. Genel olarak, bu kontrol ve uyarım tahlilin lineer aralığı içindeydi no göre sitokin seviyelerinde en azından üç kat bir artış elde antijenik uyarımı herhangi bir değeri pozitif tepkiler olarak. Zayıf bir antijene özgü CD4 T hücresi tepkilerini gözlemlemek kılar, 0.16 pg / ml gibi düşük sitokinlerin konsantrasyonlarının saptanması, yüksek hassasiyet boncuk dizi tahlilleri kullanılarak edilir. Örnekler bu doğru değerleri elde edilir sağlamak için iki kez çalıştırılır. Şekil 2A, IFN-γ üretimi için, deney no uyarıma kıyasla 800 kat artış bir medyan tespit göstermektedir. Bu değerler, herhangi bir uyarma ile karşılaştırıldığında, IL-13 ve IL-2 gibi, çünkü bunlardan bazıları için test edilen sitokinler, düşük değerlere bağlıdırgözlenebilir. Benzer bir yaklaşım, çeşitli sitokin testlerin mRNA'nın transkripsiyonel profil için de geçerlidir. Şekil 2B uyarma işleminden sonra (en fazla üç misli) önemli ölçüde artar IFN-γ için mRNA seviyesini göstermektedir. Bu deneyde ile, IFN-γ, protein salgılaması ve IFN-γ mRNA seviyeleri (Şekil 2C) arasında güçlü bir korelasyon vardır. Biz HIV-spesifik CD4 T hücre fonksiyonunu incelemek için, bu in vitro yaklaşım geliştirdi olsa, biz de başarılı, PD-L1 ve / veya SEB ile uyarılmasından sonra CD4 T hücre yanıtları IL-10Rα blokajın etkisini değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanmış anti-CD3/CD28, CMV lizat ve Mycobacterium tüberküloz RD-1 peptitler, (veriler gösterilmemiştir). Bu yöntem, aşı ile uyarılan, eşit derecede iyi. Şekil 2D, HIV-Gag ile uyarılması büyük IFN-γ salgılanması ile sonuçlanan göstermektedir dahil olmak üzere bakteriyel antijenlere karşı tepkileri, değerlendirmek için kullanılabilir iken Tetanos toxoi ile uyarımdaha yüksek IL-13 salgılanması ile sonuçlanır, HIV ve Tetanoz spesifik CD4 T hücre yanıtlarının farklı sitokin profili ortaya koydu.

Bu tahlilde önemli bir ICS gücü gibi diğer in vitro deneyler ile tespit edilmez önleyici yollarının antikor manipülasyon sonra sitokin salgılama farklılıkları tespit etmek için yeteneğidir. Bu, üst sıvı içinde, potansiyel ölçümleri üretilen sitokin düzeylerinin hafife böylece IL-2 gibi bazı sitokinler, hücreler tarafından tüketilebilir olduğu not edilmelidir. Bu nedenle, antikorun blokaj sonra gözlenen sitokin salgılama olarak anlamlı bir farklılık da gözlemlenen farklılıklar değişikliklerden dolayı olup olmadığını değerlendirmek için, mRNA düzeyinde teyit edilmesi gereken bir üretim hücre başına. Şekil 3A, IFN üzerinde PD-L1 bloke edici antikorun etkisini göstermektedir -γ kognat antijeni ile uyarılmaya 48 saat sonra HIV-özgü CD4 T hücreleri ile ve IL-2 salgılaması. PD-1 yolunun blokajı genellikle olmayan birhücreleri, HIV-1 Gag peptidi havuzları ile uyarılır ne herhangi bir antijen stimülasyonu olmadan sitokin salgılaması üzerinde önemli bir etkisi değil, IFN-γ ve IL-2 salgılanmasını artırır. CD3 hücreler PBMC'lerden tükenmiş zaman, IFN-γ ve IL-2 salgılaması, HIV-özgü CD4 T tepki olarak indüklenir belirten stimülasyon (Şekil 3B) antijene tepki olarak üretilen herhangi bir IFN-γ ya da IL-2 orada hücresi antijen spesifik uyarım. IL-21 gibi bazı sitokinler için, boncuk dizilerin duyarlılık HIV gibi zayıf antijen tepkiler sonra protein seviyelerinin tespit izin vermez. Bu sitokinler için, mRNA miktar yerine 12 gerçekleştirilebilir.

Örneğin, IFN-γ, TNF-α gibi bazı sitokinler, hücre alt çeşitli ile üretilebilir. CD8-tükenmiş PBMC'ler üzerinde deneyler, bu protein salgılanmasının kaynağını tanınmasını öğretmektir bazen zordur ve bu nedenle, bu hücre alt kümesini tanımlamak zor olduğunu sorumluluğuinhibitör moleküllerinin blokajına ded. Biz onların fenotipik özelliklerine göre farklı hücre alt sıralayarak sitokin salgılanması üzerinde inhibitör molekülleri engelleme etkisinin daha ayrıntılı bir soruşturma yapmak, bu yöntemin bir varyantını geliştirdik bu nedenle. 4 IFN üzerinde PD-1 blokajı etkisini göstermektedir -γ sıralanmış CD4 T hücreleri tarafından salgılanan ve IL-2. Bu deney için, CD8-tükenmiş PBMC bloke edici bir PD-L1 antikoru veya bir izotip kontrolü varlığında, 12 saat boyunca uyarıldı. 12 saat sonra, hücreler, floresan antikor ve CD4 T hücreleri ile lekelenmiş yüzey hücre sıralayıcı bir akış sitometrisi kullanılarak kriteri olarak bulundu. Kriteri CD4 T hücreleri, daha sonra 36 saat süre ile inkübe edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi sitokinler boncuk dizileri kullanılarak süpernatan içinde ölçüldü. Biz başarıyla PD-1 ifade düzeylerine göre CD4 T hücreleri sıralamak için geçmişte bu yaklaşımı kullanmış ve PD-L1 abluka HIV-sp fonksiyonu geri olduğunu göstermiştir PD-1 12, yüksek düzeyde eksprese ecific CD4 T hücreleri.

HIV enfeksiyonunda yönetim T hücresi fonksiyonu olarak tanımlanan bağışıklık yollarının sayısı sürekli olarak artmaktadır. Başarıyla HIV-1-özgü CD4 T hücreleri tarafından IFN-y 8,13 γ ve IL-2 salgılanması üzerindeki IL-10 blokajının etkilerini göstermek amacıyla geçmişte bu tahlil kullanılmıştır. Bu metodun avantajlarından biri, bağışıklık düzenleyici moleküller, antijen sunan hücreler ile birlikte HIV-özgü CD4 T hücreleri (APC'ler) ve etkileşimi düzenlemek değerlendirmek üzere kapasitesidir. Şekil 5A, IL-12 salgılanması ile ilgili geri IL-10 blokajının etkilerini göstermektedir antijen sunan hücreler. Bu tekniğin bir adaptasyonu ile, stimülasyon sonrası 48 saat sonra ICS gerçekleştirerek biz monositler HIV-1 Gag peptidi havuzları (Şekil 5B) ile uyarma sonrasında IL-12'nin ana kaynağı olduğunu gösterebilmişlerdir.

e 1 "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
Şekil 1. HIV enfekte olmuş kişilere ait yöntem. Izole edilmiş CD8-tükenmiş PBMC'lerin şematik gösterimi, 15 dakika izotip kontrol antikorları veya PD-L1 ya da IL-10Rα karşı bloke edici antikor ya da inkübe edilir. Bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile 48 saatlik bir stimülasyon sonrasında süpernatanlar boncuk diziler ve hücre peletleri ile sitokin salgılanmasının ölçümü için toplanır, akış sitometrisi ve QRT-PCR kullanılarak mRNA seviyelerinin transkripsiyonel analizi kullanılarak fenotipik analizi için de toplanır.

Şekil 2,
Şekil 2. MRNA veya protein salgılanması antijen spesifik T hücre yanıtlarının tespiti. A: Bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarılmış CD8-tükenmiş PBMC'ler. IFN-γ salgısı uyarımdan 48 saat sonra ölçüldü B:. IFN-γ mRNA seviyeleriuyarıldıktan sonra 48 saat sonra, hücre granül QRT-PCR ile ölçülmüştür C:. IFN-γ mRNA seviyeleri ile yüzer IFN-γ konsantrasyon korelasyonu. D:. IFN-γ ve HIV-1 Gag peptit havuz veya Tetanos Toksoide ile uyarılan CD8-tükenmiş PBMC'lere arasında IL-13 protein düzeylerinin karşılaştırılması büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. . Önleyici yollarının manipülasyonu sonra sitokin salgılama değişiklikleri CD4 T hücre-bağımlı A ve B: CD8 tükenmiş veya CD3 tükenmiş PBMC izotip kontrolü veya PD-L1 bloke edici antikorun varlığında, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarılır. IFN-γ ve IL-2 salgısı uyarımdan sonra 48 saat sonra ölçülmüştür.


Şekil 4. PD-1 blokajı manipülasyonu sonra sitokin salgılanmasını algılar CD4 T hücreleri sıralama. AB: Üç kronik olarak enfekte olan, muamele edilmemiş deneklerden CD8-tükenmiş PBMC, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile kuluçkalanmıştır veya bir izotip kontrolü ya da PD-L1 bloke edici antikorun mevcudiyetinde 12 saat boyunca uyarılmamış kalmıştı. CD4 T hücreleri daha sonra negatif lenfositleri üzerinde soy dışlama tarafından seçilen ve 36 saat daha inkübe edilmiştir.

Şekil 5,
Şekil 5,. CD4 T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki etkileşim. A: CD8-tükenmiş PBMC'ler bir izotip kontrolü ya da IL-10Rα bloke edici antikorun varlığında, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarıldı. . Yüzer IL-12 seviyelerinin uyarılması B sonra 48 saat sonra ölçülmüştür:CD8-tükenmiş PBMC, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarılır. Monositlerde IL-12 salgısı uyarımdan sonra 48 saat sonra ICS ile ölçüldü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Supernatant koleksiyonu bu deneysel tasarım bir zorunluluk parçasıdır. Luminex deneyi için süpernatantlar hasat zaman, tam bölünen miktarları yapılan ve donma-erime döngüleri nedeniyle protein bozulmasını önlemek için -80 ° C'de tutuldu. Dondurma ve eritme proteinler için ve dondurularak çözülür en aza indirerek sert işlemler olabilir, sinyal deneylerde maksimize edilir. Bu nedenle, bu kez aynı sayıda dondurularak çözülmüş edilmiş alikotlarından çalışırken, tekrarlanabilir ve daha detaylı bilgi elde etmek için daha kolaydır.

Daha önce HIV-Gag peptidi havuzlar 12 ile uyarıldıktan sonra sitokin sekresyonu ve mRNA seviyelerinin kinetik analiz gerçekleştirdik. Bu kinetik dayanarak, sitokin salgılama ölçümleri gerçekleştirmek için 48 saat zaman noktasını seçtik. MRNA ve protein salgılanması gibi çeşitli farklı uyarıcı arasında arasında gözlemlenen farklar göz önüne alındığında, bu araştırmacılar, uyaranlara bağlı olarak kendi kinetik analizleri yapmak şarttıronlar mRNA veya protein, sitokin salgısını ölçüyoruz olmadığını kullanımı ve.

Hücre alt (Şekil 3'te gösterilen yaklaşım kullanarak) sıralanır, bu kriteri hücre sayısına göre kültür seviyesini ayarlamak için önemlidir. Standart tahlil olarak, genellikle ortam 500 ul 1000000 CD8-tükenmiş PBMC inkübe edin. Sort'u CD4 T hücreleri gibi alt grupları, hücre Ancak, biz genellikle 100,000 hücrelere kadar sıralayabilirsiniz. Bu nedenle, hücreleri seyreltilmesi tutmak için ve kordon dizisi ile bulunabilir olan bir sitokin konsantrasyonu elde etmek amacıyla, 200 ul ortam hacmini azaltır. Her deney için, hücre kültürlerinin hacmi deneysel olarak dikkate hücre tipi, hücre sayıları kriteri, ilgilenilen sitokin ve saptama kiti hassasiyetini alınarak, test edilmelidir.

Luminex tahlili yerine bir diğer önemli yönü virüs inactivati ​​olduğuüzerinde. Virüs güvenli bir cihaz üzerinde çalıştırmak örnekleri edebilmek için inaktive edilmesi gerekmektedir. Tween-20, bu nedenle kullanılmıştır. Daha önce, diğer deterjanlar, bu amaç için test edilmiştir. % 0.5 Tween,% 5-10 Triton ve yıkama tamponu çeşitli seyreltileri, HIV, enfekte olmuş hücrelere ilave edildi ve noninactivated hücrelerine karşı test edildi. Tween gerçekleştirilen deneyleri ile en az müdahale sırasında en virüsü inaktive olduğu bulunmuştur.

Akış sitometrisi gerçekleştirirken, monositler için boyama önemli bir adımdır monoklonal antikor özel olmayan bağlanmasını önlemek için bir Fc bloke edici tepkin madde ile Fc reseptör bloke etmektir. Fc reseptörü antijen sağlayan hücrelerin yüzeyi üzerinde mevcut olan ve antikorların Fc bölgesine bağlanan. Bu reseptör lekelenme bloke değilse, belirli bir hedef işaretleri eklenir monoklonal antikorlar yerine bu yüzden yanlış pozitif sonuç veren, bu reseptörüne bağlanabilir. Bu analiz ederken kaçınmak özellikle önemlidirbu reseptörü bloke olarak değil, belirli bir hücre tipinden elde sitokinler sonuçlar için zararlı olabilir. Insan serumu içeren ortamda inkübe hücreler aynı zamanda Fc reseptörüne bağlanan serum IgG bol miktarda olduğu gibi, bu konuda yardımcı olabilir.

Luminex deneyler ICS deneylerde daha hassas algılama sağlamasına rağmen, IL-21 ya da perforin gibi bazı efektör moleküller, yine de bu yöntemle tespit etmek zordur. Bu in vitro yaklaşım, diğer efektör molekülleri tespit daha fazla hassasiyet sağlar Mah-PCR kullanarak transkripsiyon analizi sağlar.

Deneysel yaklaşımın bir sınırlama ilgi sitokin bütün PBMC'ler veya CD8-tükenmiş PBMC içinde mevcut lökositlerin heterojen karışımı farklı hücre alt tarafından üretildiği zaman sonuçları bu yorumlanması zordur. Örneğin, bu farklı hücre ty yukarı-regüle olan sitokin IL-10 için de geçerlidirprogresif HIV hastalığının 8 ortamda pes. Yüzer daha inkübe ve toplama önce ilgili nüfusunun Sıralama başarılı bu bağlamda kullanmış alternatif bir yaklaşımdır.

Özet olarak, bu çalışmada yer alan teknikler PD-L1 ve IL-10 bağışıklık yollarının blokajı varlığında HIV spesifik CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından sitokin üretiminin ölçülmesi restorasyon güvenilir bir yol sağlar. Bu teknikler, sitokinler, akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilir değildir durumlarda uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz, anti-PD-L1 bloke antikorun sağlanması ve kullanılması için Gordon Freeman ederiz. Biz Massachusetts General Hospital ve bu projede onların değerli rolü için tüm katılımcıların de klinik ve laboratuar çalışanlarına teşekkür ederiz.

, Ulusal Kalp Akciğer ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Kan Enstitüsü (RO1 HL-092.565, DEK); Bu çalışma Ulusal Alerji Enstitüsü ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (DEK PO1 AI-080192) Enfeksiyon Hastalıkları tarafından desteklenmiştir. DEK Quebec Sağlığı Araştırma Fonu Araştırmacı Kariyer Ödülü (FRQS) tarafından desteklenmektedir. FP Araştırma ve Harvard Küresel Sağlık Enstitüsü (HGHI) üzerine Massachusetts General Hospital İcra Komitesi burs hibe ile desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

Tags

Immunology Sayı 80 virüs hastalıkları bağışıklık sistemi hastalıkları HIV CD4 T hücresi CD8 T hücresi antijen oluşturucu hücre sitokinler bağışıklık ağlar PD-1: IL-10 yorgunluk monositler
<em>Vitro</em> Testi <em>HIV-spesifik</em> CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, … More

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter