In vitro assay at evaluere virkningen af immunoregulerende Pathways på HIV-specifikke CD4 T-celle effektorfunktion

Summary

Vi udviklede en in vitro assay til at undersøge den rolle immunoregulatoriske veje i reguleringen af cytokinudskillelse af HIV-specifikke CD4 T-celler.

Abstract

T-celle udmattelse er en væsentlig faktor i mislykkedes patogen clearance under kroniske virusinfektioner. Immunregulatoriske veje, såsom PD-1 og IL-10, opreguleres på denne løbende antigen eksponering og bidrage til tab af proliferation, nedsat cytolytiske funktion, og forringet cytokinproduktion af CD4-og CD8-T-celler. I den murine model af LCMV-infektion, administration af blokerende antistoffer mod disse to veje augmented T-celle responser. Men der er i øjeblikket ingen in vitro assay til at måle virkningen af en sådan blokade på cytokinudskillelse i celler fra humane prøver. Vores protokol og eksperimenterende tilgang giver os mulighed for at præcist og effektivt kvantificere genoprettelse af cytokinproduktion af HIV-specifikke CD4 T-celler fra HIV-smittede forsøgspersoner.

Her har vi skildrer en in vitro eksperimentel design, der gør det muligt for målinger af cytokinudskillelse af HIV-specifikke CD4 T-celler og deres indvirkning på andre cell delmængder. CD8 T-celler blev depleteret fra fuldblod og de resterende PBMC'er blev isoleret via Ficoll separationsmetode. CD8-udtømte PBMC'er blev derefter inkuberet med blokerende antistoffer mod PD-L1-og / eller IL-10Rα og efter stimulering med en HIV-1 Gag-peptid pool, blev cellerne inkuberet ved 37 ° C, 5% _CO2. Efter 48 timer, supernatanten blev opsamlet til cytokinanalyse af perler arrays og cellepellets opsamledes enten fænotypisk analyse ved anvendelse af flowcytometri eller transkriptionel analyse under anvendelse QRT-PCR. For mere detaljeret analyse blev forskellige cellepopulationer opnået ved selektiv delmængde udtømning fra PBMC'er eller ved at sortere ved hjælp af flowcytometri, før de vurderes på samme assays. Disse metoder giver en meget følsom og specifik metode til at bestemme modulering af cytokinproduktion af antigenspecifikke T-hjælper celler og bestemme funktionelle interaktioner mellem forskellige populationer af immunceller.

Introduction

Under vedvarende virusinfektioner, virus specifik T-celler erhverver funktionelle defekter i en proces kendt som T-celle udmattelse. Early in vivo-undersøgelser i den murine LCMV model af kronisk virusinfektion indikerede, at udtømte virus-specifikke T-celler har reduceret cytolytiske funktion mod virusinficerede celler mister deres evne til at formere sig og har reduceret evne til at producere cytokiner, såsom IL-2, TNF- α og IFN-γ ^1,2. Et kompliceret net af immunregulatoriske veje, såsom PD-1 og IL-10, opreguleres under kroniske infektioner og bidrager til T-celle-dysfunktion (revideret i ^3,4). In vivo administration af blokerende antistoffer mod disse inhiberende veje i LCMV mus model restaureret funktion af udtømte virus-specifikke T-celler og forøget viral clearance, hvilket indikerer, at T-celle-konsumption er et delvist reversibel fænomen (gennemgået i ^5).

Resultater om the LCMV model blev hurtigt udvidet til humane kroniske virusinfektioner som HBV, HCV og HIV ^5.. Ved kronisk HIV-1 infektion, er PD-1 og IL-10 veje opreguleret i smittede forsøgspersoner og korrelerer med parametre for sygdomsprogression, direkte med den virale belastning og omvendt med CD4-tal ^6-8. Antistof blokade af PD-1 eller IL-10-veje in vitro restaureret proliferation af HIV-specifikke CD4-og CD8-T-celler tyder på, at, svarende til LCMV musemodel T-celle udmattelse hos mennesker er en delvist reversibel fænomen. Men på grund af den fine karakter af eksperimenter med humane prøver samt begrænsninger i følsomhed in vitro-assays, grundig undersøgelse af de funktionelle profiler restaurering opnået ved disse indgreb er påfaldende fraværende. Proliferationsassays har været hidtil det eneste pålidelige in vitro testet i de fleste undersøgelser assay, men der er en bemærkelsesværdig mangel på beviser om virkningen af disse interkonventioner om: 1) aflivning kapacitet af cytotoksiske T-celler, 2) den antivirale virkning af T-celler på viral replikation, 3) cytokinsekretion profil, og 4) effekten på CD4 T-celle hjælp på andre celledelmængder.

Intracellulær cytokin-farvning (ICS) er en meget nyttig og udbredt flowcytometri baseret assay, der anvendes til at påvise produktion af cytokiner i forskellige celletyper i både mus og mennesker. Det er også blevet anvendt til at undersøge effekten af ​​antistof blokade af inhiberende veje. I ICS assays cytokinsekretion blokeret ved tilsætning af Brefeldin og / eller Monensin. Cytokiner fanget inde i cellerne påvises derefter med fluorescerende antistoffer under anvendelse af polykromatisk flowcytometri. Varigheden af ​​assayet er normalt begrænset til 6 eller 12 timer efter antigenstimulering da både Brefeldin og monensin, som tilsættes typisk indenfor 2 timer af antigen Desuden er toksisk for cellerne. ICS-analysen er en kraftfuld teknik, der har været nyttigt in undersøgelse af effekten af in vivo-administration af blokerende antistof intervention i mus, hvor celler blev udtrukket efter en vis periode efter antistof eksponering ^9. Der er dog flere begrænsninger for anvendelsen af ​​denne eksperimenterende tilgang til at evaluere virkningen af ​​blokade af hæmmende receptorer i humane prøver. Ved udførelse af antistof interventioner inhiberende veje i en 6 eller 12 timers stimulering in vitro (typisk tilfældet med humane prøver), er blokade af inhiberende receptorer i de fleste tilfælde ikke ændre frekvensen reagere antigenspecifikke T-celler som målt ved standard ICS assays ^{6, 7.} Målinger af per-celle cytokinproduktion målt ved gennemsnit eller median fluorescensintensitet har givet inkonsistente resultater ^{6, 7, 10.} På den anden side, når ICS udføres på et sent tidspunkt efter stimulering (dvs. seks dage), ændringer i antallet af cytokin-secernerende calen kan observeres. Forskellene er en kombineret effekt af ændret proliferation, overlevelse og ændringer i effektorfunktion, der ophobes i det angivne tidsrum ^6. En måde at delvis overvinde disse begrænsninger er at inkubere i længere tid (fx 36 hr, 60 hr, osv.) Med antigenet før tilsætning af cytokinsekretion blocker uden at vente på proliferation at forekomme. Vi har med succes anvendt denne metode til at bestemme kinetikken af cytokinsekretion af HIV-specifikke CD4-og CD8-T-celler ^11,12, men denne fremgangsmåde er ikke i stand til at detektere små reaktioner og vil ikke give en integreret resultat af den samlede cytokinsekretion forekommende eftersom stimulation. Derfor ICS er ikke følsomme nok til at registrere virkningen af ​​blokade af inhiberende veje på mængden af ​​cytokiner produceret af aktiverede T-celler sammenlignet med cytokin mRNA kvantificering eller målinger af cytokinsekretion i supernatant på samme tidspunkter. Derudover er de fleste af cytokinerne produceret af aktiverede T-celler virker i autokrin måde ved at bidrage til enten positiv eller negativ feedback loops gennem interaktion med antigenpræsenterende celler. Derfor tilsætning af Brefeldin eller Monensin under ICS assay forhindrer cytokinsekretion og dermed stimulering af T-celler ikke er optimal. Endelig er påvisning af multiple cytokiner med ICS begrænses af tilgængeligheden og følsomheden af ​​antistoffer til påvisning af cytokiner med flowcytometri samt af begrænsninger i antallet af fluorochromer som kan anvendes samtidigt i et givet panel.

Vi udviklede en meget følsom in vitro eksperimenterende tilgang til at evaluere effekten af immunoregulatoriske veje i reguleringen cytokinudskillelse af HIV-specifikke CD4 T-celler og efterfølgende CD4 hjælp til at antigenpræsenterende celler (APC'er) og naturlige dræberceller (NK-celler). Denne metode kan også anvendes til at vurdere impact af blokade af hæmmende molekyler på CD8 T-celle funktion ved at nedbryde CD4 T-celler fra PBMC'er eller ved at stimulere med optimale peptider, der er anerkendt kun af CD8 T-celler. I modsætning til intracellulære cytokin farvningsteknikker assays, besluttede vi ikke at blande sig i cytokinudskillelse af HIV-specifikke CD4 T-celler for at være i stand til: 1) udføre en mere nøjagtig kvantificering af cytokinniveauer producerede, 2) undersøge et bredere panel af cytokiner eller effektor molekyler, og 3) evaluere virkningen af ​​cytokiner produceret af HIV-specifikke CD4 T-celler på andre celledelmængder. Vi stimulerer CD8 udtømte PBMC'er med en HIV-1 Gag peptid pool i tilstedeværelse af blokerende antistoffer til immunregulatoriske vej af interesse. Efter den ønskede inkubationstid, sædvanligvis 48 timer, indsamler vi supernatanterne at måle cytokinsekretion med perle arrays og indsamle cellepellets enten til fænotypisk analyse af de forskellige celledelmængder eller for transkriptionel analyse. Af note, ved thans 48 timers tidspunkt, vi ikke påvise en signifikant population af prolifererende T-celler ^12. Dette er en fleksibel tilgang og flere tilpasninger af dette design kan anvendes til at løse forskellige hypoteser. For eksempel kan de enkelte celledelmængder (såsom HIV-specifikke CD4-T-celler eller PD-1 høje CD4 T-celler, mv.) Sorteres efter 12 timers inkubation, før yderligere inkubation i 36 timer efterfulgt af indsamling af supernatanter og cellepellets at undersøge mere specifikt virkningen af ​​blokade interventioner på cytokinudskillelse ved definerede subpopulationer af PBMC'er.

Protocol

1.. Nedbrydning og Isolering af PBMC'er via Ficoll Separation

1. Nedbryder CD8 + T-celler ved tilsætning af humane CD8 + Depletion cocktail ved 50 ul / ml fuldblod.
2. Bland godt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur (18-25 ° C).
3. Efter inkubation blandes fuldblod med HBSS (Hanks Balanced Salt Solution uden ^{Ca2 +} eller ^{Mg2 +)} og lag over Histopaque. Spin ved 340 RCF i 30 min (ingen bremse, langsom acceleration).
4. Saml PBMC'er og overføre til en ny 50ml konisk. Vask 2x med 45 ml RPMI 1640 suppleret med 50 IU penicillin, 50 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES ved spinding i 10 minutter ved 340 RCF.

2. Antistof blokade og antigenspecifik Stimulering af celler

1. Resuspender celler ved 2x10 ⁶ pr tilstand i RPMI 1640 indeholdende 10% humant serum suppleret med 50 IE Penicillin, 50 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES,tegner sig for 500 pi pr tilstand.
2. Aliquot 500 pi cellesuspension pr FACS rør.
3. Afhængigt af vejen undersøges, tilsættes PD-L1, IL-10Rα blokerende antistoffer og / eller isotypekontroller ved 10 ug / ml og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C, 5% _CO2.
4. Stimuler celler med et HIV-1 Gag peptid pulje på 1 pg / ml / peptid slutkoncentration. Også omfatte et "nej stimulering" kontrol for hver blokerende tilstand. Inkuberes ved 37 ° C, 5% _CO2 i 48 timer.

3. Indsamling og analyse af supernatant

1. Efter 48 timer, spin ned FACS-rør i 7 min ved 340 RCF.
2. Indsamle forsigtigt 2 x 225 pi supernatant i Eppendorf rør til Luminex perle arrays uden at forstyrre bundfaldet.
3. Inaktivere virus i den opsamlede supernatant med 25 pi 0,5% PBS-Tween til opnåelse af en slutkoncentration på 0,05% PBS-Tween.
4. Store indsamlede supernatanter, der ikke immediately anvendes i en -80 ° C fryser.
5. Mål ønskede cytokinkoncentrationer hjælp Millipore Luminex kit ifølge producentens protokol.

4.. Indsamling og fænotypisk analyse af celler via Flowcytometri

1. Efter indsamling af supernatanten, vaske cellerne i 3 ml PBS. Spin celler til 7 min ved 340 rcf og dekanteres overskydende vask.
2. Stain for levedygtighed ved hjælp af et LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit ifølge producentens protokol.
3. Vask cellerne i PBS i 7 min ved 340 rcf og ved 4 ° C. Resuspender i 100 pi PBS 1% FBS.
4. Hvis farvning for monocytter eller andre antigenpræsenterende celler, blokere Fc-receptorer ved tilsætning af 1,4 pi FcR blokerende reagens og vortex at blande.
5. Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
6. Tilføj overflade antistoffer, vortex, og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
7. Vask cellerne med PBS 1% FBS, dekanteres overskydende vask, og der tilsættes 200 ul 4% paraformaldehyd. Inkuberved stuetemperatur i 20 minutter i mørke.
8. Vask cellerne med PBS 1% FBS, resuspender i 250 pi PBS 1% FBS, og erhverve en Multilaser flowcytometer (f.eks BD LSRII eller Fortessa).

5.. Analyse af celler via QRT-PCR

1. For celler ikke analyseret via flowcytometri: efter supernatant indsamling, lysere celler i 300 pi Qiagen Buffer RLT indeholdende 1% beta-mercaptoethanol. Hvis det ikke er at fortsætte med protokollen, kan cellerne fryses ved -80 ° C efter dette punkt.
2. Isolere RNA under anvendelse af et RNA isolation kit ved at følge fabrikantens protokol.
3. Syntetisere cDNA fra RNA ved anvendelse af et cDNA-syntese kit ved at følge fabrikantens protokol.
4. Udføre kvantitativ PCR under anvendelse af SYBR Green teknologi.
5. Opret en primer mix for hver primer anvendes, herunder rengøring gener (fx IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) ved tilsætning af primere nukleasefrit vand til en slutkoncentration på 10uM. Hold på is.
6. Opret en master mix til hver primer ved at tilsætte 10,5 ul nuklease-frit vand, 12,5 ul SYBR grøn og 1 pi primer mix per plade godt. Hold på is.
7. Pipetter 24 pi masterblanding i hver brønd i pladen, der vil blive anvendt.
8. Tilsæt 1 gl cDNA til hver brønd i henhold til skabelon.
9. Cap brønde og centrifugeres plade i 3 minutter ved 800 RCF.
10. Kør plade på en qRT-PCR-maskine, fx en Stratagene MX3005P instrument.

6.. Tilpasning til intracellulær Cytokine Staining på 48 timer

Tilføj Brefeldin og Monensin 6 timer før intracellulær cytokin-farvning. Brefeldin tilsættes ved en koncentration på 10 ug / ml, mens Monensin tilsættes i henhold til producentens anvisninger. For nemheds skyld kan Brefeldin tilsættes 12 timer forud for farvning ved en koncentration på 5 ug / ml.

1. Efter overflade pletten vaskes cellerne med PBS 1% FBS og plet itracellular cytokiner, såsom IL-12, IFN-γ og TNF-α ved hjælp af en Fiksering / Permeabilisering Solution kit og protokol.
2. Vask cellerne, resuspender i 250 pi PBS 1% FBS, og køre på en Multilaser flowcytometer (fx BD LSR II eller Fortessa).

7.. Tilpasning til Sortering Celler

1. 16 timer efter stimulering, pletten for levedygtighed ved hjælp LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit ifølge producentens protokol. Hold celler på is under hele proceduren.
2. Vask cellerne med PBS i 7 min ved 340 rcf og ved 4 ° C. Resuspender i 100 pi PBS 1% FBS.
3. Tilføj overflade antistoffer, vortex at blande og inkubere cellerne på is i mørke i 20 minutter.
4. Vask cellerne med PBS 1% FBS ved 340 rcf og ved 4 ° C og resuspenderes i 500 pi kold RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum suppleret med 50 IE Penicillin, 50 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES.
5. Filter-celler med 5 ml polystyrenrene rundbundede rør med Cell-Si hætte.
6. Forbered opsamlingsrør for sortering ved tilsætning af 200 gl RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum suppleret med 50 IE Penicillin, 50 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1% HEPES til hvert rør. Hold alle rør på is under slags.
7. Levende sortere celleundergrupperne af interesse på et instrument (f.eks BD FACS Aria II), der ligger i et anlæg udstyret til biologisk farligt materiale.
8. Efter cellerne er blevet sorteret, placere celler tilbage i inkubatoren til den ønskede mængde tid og følge med supernatant indsamling / Luminex analyse og cellepelleten indsamling / PCR-analyse.

Representative Results

Ved udførelse af cytokin målinger ved hjælp af dette in vitro-system, er det vigtigt at være i stand til at skelne mellem de antigen-specifikke responser sammenlignet med ingen stimulering kontrol. I almindelighed, vi betragtes som positive reaktioner som nogen værdier i den antigenstimulation som giver mindst tre-dobling i cytokinniveauer sammenlignet med ingen stimulation kontrol og som lå inden for det lineære område for analysen. Vi bruger høj følsomhed bead array-assays, som kan påvise koncentrationer af cytokiner så lave som 0,16 pg / ml, gør det muligt at observere svage antigenspecifikke CD4-T-celle-responser. Prøver kørt in duplo for at sikre, at der opnås, at de nøjagtige værdier. Figur 2A viser, at der for IFN-γ produktionen, kan analysen afsløre en median på 800-fold stigning sammenlignet med ingen stimulation. Disse værdier afhænger af de testede grund for nogle af dem cytokiner, såsom IL-13 og IL-2, lavere værdier i forhold til ingen stimulationoverholdes. En lignende fremgangsmåde anvendes i transskriptionsprofilering af mRNA af forskellige cytokiner tests. Figur 2B viser niveauet af mRNA for IFN-γ, der er steget betydeligt (mere end tre gange) efter stimulering. Med dette assay, der er en stærk korrelation mellem IFN-γ protein sekretion og IFN-γ-mRNA-niveauer (figur 2C). Selvom vi udviklet denne in vitro metode til at studere HIV-specifikke CD4 T-celle funktion, vi har også med succes brugt denne metode til at evaluere virkningen af PD-L1-og / eller IL-10Rα blokade på CD4 T-celle responser efter stimulering med SEB, anti-CD3/CD28, CMV lysat og RD-1 peptider fra Mycobacterium tuberculosis (data ikke vist). Denne metode kan anvendes til at vurdere respons på bakterielle antigener, herunder vaccine-inducerede reaktioner, lige godt. Figur 2D viser, at stimulering med HIV-Gag resulterer i øget IFN-γ-sekretion, mens stimulation med tetanus toxoiU-resultater i højere IL-13-sekretion, demonstrerer de forskellige cytokinprofilen af ​​HIV og Tetanus-specifikke CD4 T-celle responser.

En stor styrke i denne analyse er evnen til at opdage forskelle i cytokinudskillelse efter antistof manipulation af hæmmende veje, der ikke påvises ved andre in vitro-assays som ICS. Det skal bemærkes, at visse cytokiner, såsom IL-2, kan forbruges af celler, så målinger i supernatanten potentielt kan undervurdere cytokinniveauer produceret. Af denne grund bør eventuelle forskelle i cytokinudskillelse observeret efter antistof blokade også blive bekræftet på mRNA-niveau at vurdere, om observerede forskelle skyldes ændringer i en per celle produktion Figur 3A viser virkningen af en PD-L1 blokerende antistof på IFN. -γ og IL-2-sekretion med HIV-specifikke CD4-T-celler efter 48 timers stimulering med det beslægtede antigen. Blokade af PD-1-vejen har generelt ikke enbetydelig indvirkning på cytokinsekretion uden antigenstimulering men øger IFN-γ og IL-2-sekretion, når celler stimuleres med HIV-1 Gag peptid puljer. Når CD3 celler udtømt fra PBMC'er, der ikke er IFN-γ eller IL-2 produceres i respons på antigen stimulering (figur 3B), hvilket indikerer, at sekretionen af IFN-γ og IL-2 induceret som reaktion på HIV-specifik CD4 T celle antigen-specifik stimulering. For nogle cytokiner, såsom IL-21, ikke følsomheden af ​​perle arrays ikke tillader detektering af protein-niveauer efter svage antigen reaktioner såsom HIV. For disse cytokiner kan kvantificering af mRNA udføres stedet ^12.

Visse cytokiner, såsom IFN-γ og TNF-α, kan fremstilles ved en række forskellige celledelmængder. Ved udførelse af forsøg med CD8-udtømte PBMC'er, er det undertiden vanskeligt at identfy den proteinkilde sekretion, og derfor er det vanskeligt at identificere den celle delmængde at ansvarded til blokade af den hæmmende molekyler. Derfor har vi udviklet en variant af denne metode til at udføre en mere grundig undersøgelse af konsekvenserne af at blokere hæmmende molekyler på cytokinudskillelse ved at sortere forskellige celledelmængder efter deres fænotypiske karakteristika 4 viser effekten af PD-1 blokade på IFN. Figur -γ og IL-2, der udskilles af sorterede CD4 T-celler. Til dette eksperiment blev CD8-udtømte PBMC'er stimuleret i 12 timer i nærvær af et blokerende PD-L1-antistof eller en isotypekontrol. Efter 12 timer blev celler overflade farvet med fluorescerende antistoffer og CD4-T-celler blev sorteret ved anvendelse af et flowcytometer cellesorteringsapparat. Sorteret CD4 T-celler blev derefter inkuberet i yderligere 36 timer og cytokiner blev målt i supernatanten ved hjælp af perle arrays som beskrevet ovenfor. Vi har med succes brugt denne fremgangsmåde i fortiden for at sortere CD4 T-celler i forhold til deres niveau af PD-1-ekspression og har vist, at PD-L1 blokade kan genoprette funktionen af ​​HIV-sp ecific CD4 T-celler, der udtrykker høje niveauer af PD-1 ^12.

Antallet af immunoregulatoriske veje identificeret som styrende T-celle funktion i HIV-infektion er konstant stigende. Vi har med succes brugt denne analyse i fortiden for at vise effekten af IL-10 blokade på IFN-γ og IL-2-sekretion af HIV-1-specifikke CD4 T-celler ^8,13. En af fordelene ved denne metode er evnen til at vurdere, hvor immunregulerende molekyler regulerer samspillet af HIV-specifikke CD4-T-celler med antigenpræsenterende celler (APC'er). Figur 5A viser virkningen af IL-10-blokade på at genoprette IL-12-sekretion fra antigenpræsenterende celler. Med en tilpasning af denne teknik, ved at udføre ICS ved 48 timer efter stimulering, var vi i stand til at vise, at monocytter er den primære kilde til IL-12 efter stimulering med HIV-1 Gag peptid pools (figur 5B).

e 1 "src =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk fremstilling af metoden. Isoleret CD8-udtømte PBMC'er fra HIV-smittede forsøgspersoner inkuberes i 15 min enten med isotypekontrolantistoffer eller blokering af antistoffer mod PD-L1 eller IL-10Rα. Efter en 48 timers stimulering med en HIV-1 Gag-peptid pool supernatanter indsamlet til måling af cytokinsekretion med perle arrays og cellepellets opsamles enten til fænotypeanalyse ved hjælp af flowcytometri eller transkriptionel analyse af mRNA-niveauer ved hjælp af QRT-PCR.

Figur 2. Påvisning af antigen-specifikke T-celle responser med mRNA eller protein sekretion. A: CD8-forarmet PBMC'er stimuleret med en HIV-1 Gag peptid pool. IFN-γ-sekretion blev målt ved 48 timer efter stimulering B:. IFN-γ-mRNA-niveauerblev målt med QRT-PCR i cellepellets ved 48 timer efter stimulering C:. Korrelation af IFN-γ-koncentration i supernatanter med IFN-γ-mRNA-niveauer. D:. Sammenligning af IFN-γ og IL-13 protein niveauer mellem CD8-udtømte PBMC'er stimuleret med HIV-1 Gag peptid poolen eller tetanustoxoid Klik her for at se større figur .

Figur 3. Ændringer af cytokinsekretion efter manipulation af inhiberende veje er CD4 T-celle-afhængig A og B:. CD8 udtømt eller CD3 udtømte PBMC'er stimuleret med en HIV-1 Gag-peptid pool i nærvær af isotypekontrol eller PD-L1 blokerende antistof. IFN-γ og IL-2-sekretion blev målt ved 48 timer efter stimulering.

Figur 4.. Sortering CD4-T-celler til at opdage cytokinsekretion efter manipulation af PD-1 blokade. AB: CD8-udtømte PBMC'er fra tre kronisk inficerede, ubehandlede forsøgspersoner blev inkuberet med en HIV-1 Gag peptid pool eller venstre stimulerede i 12 timer i nærvær af isotypekontrol eller PD-L1 blokerende antistof. CD4 T-celler blev derefter negativt udvalgt af afstamning eksklusion lymfocytterne og yderligere inkuberet i 36 timer.

Figur 5. Samspillet mellem CD4 T-celler og antigenpræsenterende celler. A: CD8-udtømte PBMC'er stimuleret med en HIV-1 Gag-peptid pool i nærvær af isotypekontrol eller IL-10Rα blokerende antistof. IL-12-niveauer i supernatanten blev målt ved 48 timer efter stimulering B.:CD8-udtømte PBMC'er stimuleret med en HIV-1 Gag-peptid pool. IL-12-sekretion på monocytter blev målt med ICS på 48 timer efter stimulering.

Discussion

Supernatant samling er en afgørende del af denne eksperimentelle design. Når man høster supernatanterne til Luminex-assayet blev portioner fremstillet og opbevaret ved -80 ° C for at forhindre proteinnedbrydning på grund af fryse-tø cykler. Frysning og optøning kan være barske processer for proteiner, og ved at minimere fryse-smelter, vil signalet blive maksimeret i assays. Derfor er det lettere at opnå reproducerbar og mere nøjagtige data, når man arbejder portioner, der er fryse-optøet det samme antal gange.

Vi har tidligere foretaget kinetisk analyse af cytokinudskillelse og mRNA niveauer efter stimulering med HIV-Gag peptid pools ^12. Baseret på disse kinetik, valgte vi 48 hr tidspunkt til at udføre de cytokinsekretion målinger. I betragtning af de konstaterede forskelle mellem mRNA og protein sekretion samt mellem forskellige stimuli, er det bydende nødvendigt, at forskere udføre deres egen kinetiske analyser afhængigt af stimulide bruger, og om de er at måle mRNA-ekspression eller protein cytokinsekretion.

Når celledelmængder er sorteret (ved hjælp af den fremgangsmåde, der er vist i figur 3), er det vigtigt at justere mængden af kulturen ifølge celleantallet sorteres. I standard assay, vi typisk inkuberes 1 million CD8-udtømte PBMC'er i 500 pi medium. Men når vi slags celledelmængder, såsom CD4 T-celler, vi normalt sortere op til 100.000 celler. Af denne grund, at vi skrue ned for lydstyrken af ​​mediet til 200 ul for at holde fra at fortynde cellerne og for at opnå en cytokin koncentration, der kan påvises med perlen array. For hvert eksperiment, bør mængden af ​​cellekulturer eksperimentelt testet under hensyntagen til celletypen, de celleantal sorteret cytokinet af interesse og følsomhed påvisning kit.

Et andet vigtigt aspekt, når du udfører Luminex analysen er virus inactivatipå. Virus skal inaktiveres for at være i stand til sikkert at køre prøver på instrumentet. Tween-20 blev anvendt til denne grund. Tidligere havde andre rengøringsmidler blevet testet til dette formål. Forskellige fortyndinger af 0,5% Tween, 5-10% Triton og vaskebuffer sattes til HIV-inficerede celler, og blev testet mod noninactivated celler. Tween blev fundet at inaktivere viruset bedste, mens blande mindst med de assays, der udføres.

Ved udførelse af flowcytometri et vigtigt skridt, når farvning for monocytter er at blokere Fc-receptoren med en Fc-blokerende reagens for at forhindre ikke-specifik binding af monoklonale antistoffer. Fc-receptoren er til stede på overfladen af ​​antigenpræsenterende celler og binder til Fc-regionen af ​​antistoffer. Hvis denne receptor ikke er blokeret før farvning kan monoklonale antistoffer, der er føjet til at målrette specifikke markører i stedet binder sig til denne receptor, derfor giver et falsk positivt resultat. Dette er især vigtigt at undgå, når man analyserercytokiner, der stammer fra en bestemt celletype, som ikke blokerer denne receptor kan være til skade for resultater. Inkubere celler i medier, der indeholder humant serum kan også hjælpe med dette problem, da der er rigelige mængder af IgG i serum, der binder til Fc-receptor.

Selv Luminex assays give mere følsom påvisning end ICS assays visse effektor molekyler, såsom IL-21 eller perforin er stadig vanskeligt at opdage med denne metode. Denne in vitro metode giver mulighed for transkriptionel analyse ved hjælp qRT-PCR, som giver større følsomhed i detektering af andre effektor molekyler.

En begrænsning af vores eksperimenterende tilgang er, at fortolkningen af ​​dens resultater er svært, når det cytokin af interesse er produceret af forskellige celle delmængder fra den heterogene blanding af leukocytter til stede i hele PBMC'er eller CD8-udtømte PBMC'er. For eksempel er dette tilfældet for cytokin IL-10, som er opreguleret i anden celle types i fastsættelsen af progressiv HIV-sygdom ^8. Sortering af populationen af ​​interesse før yderligere inkubation og indsamling af supernatanter er en alternativ tilgang, vi har med succes brugt i denne sammenhæng.

Sammenfattende de teknikker, der præsenteres i dette papir giver en pålidelig metode til at måle restaurering af cytokinproduktion af HIV-specifikke CD4 eller CD8 T-celler i nærværelse af blokade af PD-L1 og IL-10 immunoregulatoriske veje. Disse teknikker kan anvendes i tilfælde, hvor cytokiner ikke let kan påvises ved flowcytometri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Human Serum AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30 001 CI
L-glutamine	Mediatech	25 005 CI
HEPES buffer	Mediatech	25060CI
FcR blocking reagent, human	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail	Stem Cell	15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ primer	Invitrogen		FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG