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Immunology and Infection

Essai in vitro pour évaluer l'impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Abstract

T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l'agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l'antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l'infection par LCMV, l'administration d'anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n'existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l'impact d'un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d'échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH.

Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur ​​les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l'IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO 2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l'analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l'analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l'épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d'être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l'antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.

Introduction

Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d'infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l'IL-2, TNF- α et IFN-γ 1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l'IL-10, sont régulés à la hausse au cours des infections chroniques et de contribuer à un dysfonctionnement des cellules T (revue dans 3,4). Administration in vivo d'anticorps bloquants contre ces voies inhibitrices chez la souris de LCMV modèle de fonction des cellules T spécifiques du virus épuisés et amélioré la clairance virale rétablie, ce qui indique que l'épuisement de cellules T est un phénomène partiellement réversible (revue dans 5).

Conclusions sur ee modèle de LCMV ont été rapidement étendu à des infections virales chroniques humaines telles que le VHB, le VHC et le VIH 5. Dans chronique par le VIH-1 infection, PD-1 et IL-10 sont régulés à la hausse dans les voies sujets infectés et en corrélation avec les paramètres de la progression de la maladie, directement avec la charge virale et inversement proportionnelle à la numération des CD4 8.6. Blocage des anticorps PD-1 ou l'IL-10 in vitro des voies restauré la prolifération des cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH, indiquant que, comme dans le modèle de la souris LCMV, T épuisement des cellules chez l'homme est un phénomène partiellement réversible. Toutefois, en raison de la nature délicate des expériences sur des échantillons humains ainsi que les limites de la sensibilité des tests in vitro, étude approfondie des profils de restauration fonctionnelle obtenus par ces interventions est frappante absent. Les tests de prolifération ont été, jusqu'à présent, le seul test fiable in vitro testé dans la plupart des études, mais il ya un manque remarquable de preuves sur l'impact de ces interventionsinterventions sur: 1) la capacité de destruction des cellules T cytotoxiques, 2) l'effet antiviral des lymphocytes T sur la réplication virale, 3) le profil de sécrétion des cytokines, et 4) l'effet sur CD4 aide des lymphocytes T sur d'autres sous-ensembles de cellules.

Coloration intracellulaire des cytokines (ICS) est un courant très utile et largement utilisé dosage basé sur une cytométrie qui est utilisé pour détecter la production de cytokines dans divers types de cellules chez les souris et les humains. Il a également été utilisé pour étudier l'effet de l'anticorps au blocage des voies inhibitrices. Dans les dosages de l'ICS, la sécrétion de cytokines est bloquée par l'addition de Brefeldin et / ou de monensin. Les cytokines piégées à l'intérieur des cellules sont ensuite détectés avec des anticorps fluorescents en utilisant la cytométrie en flux polychromatique. La durée de l'essai est généralement limité à 6 ou 12 h après la stimulation antigénique puisque les deux Brefeldin et monensine, qui sont typiquement ajoutés en 2 heures de l'addition de l'antigène, sont toxiques pour les cellules. Le dosage des ICS est une technique puissante qui a été i utilesn l'investigation de l'effet de l'administration in vivo d'anticorps de blocage intervention chez les souris où les cellules ont été extraites, après une certaine période de temps après l'exposition de l'anticorps 9. Cependant, il existe plusieurs limitations à l'application de cette approche expérimentale pour évaluer l'impact de blocage des récepteurs inhibiteurs dans les échantillons humains. Lors d'interventions d'anticorps de voies inhibitrices dans une stimulation 6 ou 12 heures in vitro (typiquement le cas avec des échantillons humains), le blocage des récepteurs inhibiteurs dans la plupart des cas, ne modifie pas la fréquence de la réponse des cellules T spécifiques de l'antigène, mesurée par des dosages de l'ICS standards 6, 7. Les mesures de la production de cytokines par des cellules, mesurée par l'intensité moyenne ou la médiane de fluorescence ont donné des résultats incohérents 6, 7, 10. D'autre part, lorsque ICS est effectuée à un point de temps après la fin de la stimulation (par exemple six jours), les changements dans le nombre de cytokine sécrétant caunes peuvent être observées. Les différences sont un effet combiné de la prolifération altérée, la survie et l'évolution de la fonction d'effecteur qui s'accumulent au cours de la période de temps spécifiée 6. Une façon de surmonter une partie de ces limitations est à incuber pendant de longues périodes de temps (par exemple 36 h, 60 h, etc.) Avec l'antigène avant l'ajout de l'inhibiteur de sécrétion des cytokines sans attendre à la prolifération de se produire. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour déterminer la cinétique de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH 11,12, mais cette approche n'est pas en mesure de détecter des réponses petites et ne donnera pas un résultat intégré de la sécrétion de cytokine totale survenant car la stimulation. Par conséquent, ICS n'est pas une méthode suffisamment sensible pour détecter l'impact de blocage des voies inhibitrices de la quantité de cytokines produites par les cellules T activées par rapport à la quantification de l'ARNm de cytokines ou des mesures de la sécrétion de cytokines dans le supernatant aux mêmes points dans le temps. En outre, la plupart des cytokines produites par les lymphocytes T activés agissent de façon autocrine, en contribuant à la rétroaction positive ou négative par une interaction avec des boucles de cellules présentatrices d'antigène. Par conséquent, l'addition de Brefeldin monensin ou au cours de l'essai de ICS empêche la sécrétion de cytokines et donc la stimulation des cellules T n'est pas optimale. Enfin, la détection de multiples cytokines avec ICS est limitée par la disponibilité d'anticorps et de la sensibilité pour la détection des cytokines avec la cytométrie de flux, ainsi que par des contraintes dans le nombre des fluorochromes qui peuvent être utilisés simultanément dans n'importe quel panneau donné.

Nous avons développé une approche très sensible in vitro expérimentale pour évaluer l'impact des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH et par la suite CD4 aide à cellules présentatrices d'antigène (CPA) et les cellules tueuses naturelles (cellules NK). Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer l'impact de blocus de molécules inhibitrices de la fonction des cellules T CD8 par épuiser les cellules de PBMC T CD4 ou en stimulant des peptides optimales reconnues uniquement par les cellules T CD8. Contrairement à intracellulaires dosages de cytokines de coloration, nous avons décidé de ne pas interférer avec la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH afin d'être en mesure de: 1) réaliser une quantification plus précise des niveaux de cytokines produites; 2) étudier un panel plus large des cytokines ou des molécules effectrices, et 3) évaluer l'impact de cytokines produites par les cellules T CD4 spécifiques du VIH sur les autres sous-ensembles de cellules. On stimule CD8 PBMC déplétées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide, en présence d'anticorps bloquants pour la voie immunorégulateur d'intérêt. Après le temps désiré d'incubation, généralement 48 heures, nous recueillons les surnageants de mesurer la sécrétion de cytokines avec des tableaux de perles et de recueillir les culots cellulaires soit pour l'analyse phénotypique des différents sous-ensembles de cellules ou pour l'analyse de la transcription. De noter, à tson article 48, point de temps h, on ne détecte pas une population significative de la prolifération des cellules T 12. Il s'agit d'une approche souple et plusieurs adaptations de cette conception peut être appliquée pour répondre à différentes hypothèses. Par exemple, les sous-ensembles de cellules individuelles (telles que des cellules T CD4 spécifiques du VIH ou de PD-1 des cellules de haute T CD4, etc.) Peuvent être triées après 12 h d'incubation avant incubation supplémentaire pendant 36 heures puis on a recueilli les surnageants et les culots de cellules d'enquêter plus spécifiquement l'impact des interventions du blocus sur la sécrétion de cytokines par les sous-populations définies de CMSP.

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Protocol

Une. L'épuisement et l'isolement des PBMC par Ficoll séparation

  1. Épuiser les cellules T CD8 + en ajoutant humain CD8 + Depletion Cocktail à 50 ul / ml de sang entier.
  2. Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante (18-25 ° C).
  3. Après incubation, mélanger le sang total avec HBSS (solution saline équilibrée de Hank sans Ca 2 + ou Mg 2 +) et couche sur Histopaque. Tourner à 340 rcf pendant 30 min (pas de frein, accélération lente).
  4. Recueillir les CMSP et transférer à une nouvelle conique de 50 ml. Laver 2 fois avec 45 ml de RPMI 1640 supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1% de HEPES et en faisant tourner pendant 10 min à 340 rcf.

2. Blocus d'anticorps et de stimulation spécifique de l'antigène des cellules

  1. Resuspendre les cellules à 2x10 6 pour la condition dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES,représentant 500 pi par état.
  2. Aliquote de 500 ul de suspension cellulaire par FACS tube.
  3. En fonction de la voie d'une enquête, ajouter PD-L1, l'IL-10Rα anticorps de blocage et / ou des contrôles isotypiques à 10 ug / ml et incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Stimuler les cellules avec une piscine de peptide Gag VIH-1 à 1 pg / ml / peptide concentration finale. Inclure aussi un contrôle "pas de stimulation" pour chaque condition de blocage. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.

3. Collecte et analyse de surnageant

  1. Après 48 heures, centrifuger les tubes FACS pendant 7 minutes à 340 FCR.
  2. Recueillir soigneusement les 2 x 225 pi surnageant dans des tubes Eppendorf pour Luminex arrangements de billes sans perturber le culot.
  3. Inactiver les virus dans le surnageant recueilli avec 25 ul de 0,5% de PBS-Tween pour donner une concentration finale de 0,05% de PBS-Tween.
  4. Magasin recueillies surnageants qui ne sont pas immediately utilisé dans un congélateur à -80 ° C.
  5. Mesurer les concentrations de cytokines souhaitées en utilisant le kit Millipore Luminex selon le protocole du fabricant.

4. Collecte et Analyse phénotypique des cellules par cytométrie en flux

  1. Après avoir recueilli le surnageant, laver les cellules dans 3 ml de PBS. Spin cellules pendant 7 minutes à 340 FCR et décanter excès lavage.
  2. Teinture de viabilité en utilisant un kit portable de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant.
  3. Laver les cellules dans du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS.
  4. Si la coloration pour les monocytes ou d'autres cellules présentatrices d'antigènes, les récepteurs de Fc bloc en ajoutant 1,4 ul de réactif de blocage des FcR et vortex pour mélanger.
  5. Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Ajouter les anticorps de surface, les vortex, et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  7. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, décanter excès de lavage, et ajouter 200 ul paraformaldéhyde 4%. Incuberà la température ambiante pendant 20 min dans l'obscurité.
  8. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et d'acquérir une multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSRII ou Fortessa).

5. Analyse des cellules par qRT-PCR

  1. Pour les cellules non analysé par cytométrie de flux: après la collecte de surnageant, lyser les cellules dans 300 ul de tampon RLT Qiagen contenant 1% de bêta-mercaptoéthanol. Si ce n'est pas en continuant avec le protocole, les cellules peuvent être congelées à -80 ° C après ce point.
  2. Isoler l'ARN en utilisant un kit d'isolement d'ARN en suivant le protocole du fabricant.
  3. Synthétiser un ADNc à partir d'ARN en utilisant un kit de synthèse d'ADNc en suivant le protocole du fabricant.
  4. Faire la PCR quantitative en utilisant la technologie SYBR Green.
  5. Création d'un mélange d'amorces pour chaque amorce utilisée, y compris des gènes domestiques (par exemple, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) par l'addition d'amorces à la nucléase sans eau pour donner une concentration finale de 10uM. Garder sur la glace.
  6. Créer un mélange maître pour chaque amorce en ajoutant 10,5 pi d'eau sans nucléase, 12,5 pi SYBR vert, et 1 pi mélange d'amorces par plaque bien. Garder sur la glace.
  7. Pipette 24 ul mélange maître dans chaque puits de la plaque qui sera utilisé.
  8. Ajouter 1 ul d'ADNc à chaque puits selon modèle.
  9. Cap puits et la plaque de centrifuger 3 min à 800 rcf.
  10. Exécutez plaque sur une machine qRT-PCR, par exemple, un instrument Stratagene MX3005P.

6. Adaptation pour intracellulaire de cytokines coloration à 48 h

Ajouter Brefeldin monensin et 6 heures avant la coloration des cytokines intracellulaires. Brefeldin est ajouté à une concentration de 10 ug / ml tandis que la monensine est ajoutée selon les instructions du fabricant. Pour plus de commodité, la Bréfeldine peut être ajouté 12 heures avant la teinture, à une concentration de 5 pg / ml.

  1. Après coloration de surface, laver les cellules avec du PBS 1% de FBS et tache danscytokines intracellulaires telles que l'IL-12, IFN-γ et TNF-α en utilisant un kit de fixation / perméabilisation de solutions et de protocole.
  2. Laver les cellules, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et fonctionner sur un multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSR II ou Fortessa).

7. Adaptation pour le tri des cellules

  1. 16 heures après la stimulation, la tache pour la viabilité cellulaire en utilisant le kit de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. Gardez les cellules sur la glace durant la procédure entière.
  2. Laver les cellules avec du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS.
  3. Ajouter des anticorps de surface, vortex pour mélanger et incuber les cellules sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
  4. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS à 340 rcf et à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de milieu RPMI 1640 froid contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% HEPES.
  5. cellules de filtrage à l'aide de 5 ml Polystyrene Tube à fond rond avec bouchon Cell-passoire.
  6. Préparer des tubes de collecte pour trier par addition de 200 ul de milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES à chaque tube. Conservez tous les tubes sur la glace pendant le tri.
  7. Trier en direct les sous-ensembles de cellules d'intérêt sur ​​un instrument (par exemple BD FACS Aria II) situé dans un établissement équipé pour matières infectieuses.
  8. Après que les cellules ont été triées, place des cellules dans l'incubateur pour la durée souhaitée et suivre l'analyse collection surnageant / Luminex et d'analyse collecte de culot cellulaire / PCR.

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Representative Results

Pour effectuer des mesures de cytokines en utilisant ce système in vitro, il est essentiel d'être capable de distinguer les réponses spécifiques de l'antigène par rapport au pas de commande de stimulation. En général, nous avons considéré que les réponses positives des valeurs de la stimulation antigénique qui donnent au moins trois fois plus dans les niveaux de cytokine par rapport au pas de commande de stimulation et qui étaient dans la plage linéaire du dosage. Nous utilisons sensibilité tableau de perles dosages élevés qui peuvent détecter des concentrations de cytokines aussi faibles que 0,16 pg / ml, ce qui nous permet d'observer la faiblesse des CD4 réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Les échantillons sont analysés en double afin de s'assurer que les valeurs précises sont obtenues. Figure 2A montre que, pour la production d'IFN-γ, le test peut détecter une médiane de 800 fois plus par rapport à aucune stimulation. Ces valeurs dépendent des cytokines testées parce que pour certains d'entre eux, comme l'IL-13 et IL-2, des valeurs inférieures par rapport à l'absence de stimulation seraêtre observé. Une approche similaire s'applique au profilage de la transcription de l'ARNm de cytokines différents tests. Figure 2B montre le taux d'ARNm de IFN-γ qui est augmentée de façon significative (plus de trois fois) après stimulation. Avec ce test, il existe une forte corrélation entre la sécrétion de la protéine IFN-γ et les niveaux d'ARNm d'IFN-γ (Figure 2C). Même si nous avons développé cette approche in vitro pour étudier la fonction des cellules T CD4 spécifiques du VIH, nous avons également utilisé cette approche avec succès pour évaluer l'impact de la PD-L1 et / ou de l'IL-10Rα blocus sur les réponses des cellules T CD4 après stimulation par SEB, anti-CD3/CD28, CMV lysat et RD-1 à partir de peptides mycobacterium tuberculosis (données non présentées). Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les réponses à des antigènes bactériens, y compris des réponses induites par le vaccin, tout aussi bien. Figure 2D montre que la stimulation avec le VIH-Gag se traduit par une plus grande IFN-γ tandis que la stimulation de la sécrétion de tétanos toxoirésultats d en plus IL-13 sécrétion, démontrant le profil différent de cytokines du VIH et réponses tétanos spécifiques cellules T CD4.

Une des grandes forces de ce test est la capacité de détecter des différences dans la sécrétion de cytokines après manipulation d'anticorps de voies inhibitrices qui ne sont pas détectés par d'autres essais in vitro comme ICS. Il convient de noter que certaines cytokines, telles que IL-2, peuvent être consommés par les cellules de manière mesures dans le surnageant peuvent potentiellement sous-estimer les niveaux de cytokines produites. Pour cette raison, les différences dans la sécrétion de cytokines observé après anticorps blocus devraient également être confirmées au niveau de l'ARNm d'évaluer si les différences observées sont dues à des changements dans une production par cellule. Figure 3A montre l'impact d'un anticorps bloquant PD-L1 sur l'IFN -γ et l'IL-2 par les cellules de sécrétion spécifiques au VIH T CD4 après 48 heures de stimulation avec l'antigène correspondant. Le blocage de la voie de PD-1 n'a généralement pas unimpact significatif sur la sécrétion de cytokines sans la stimulation antigénique, mais améliore l'IFN-γ et l'IL-2 de la sécrétion lorsque les cellules sont stimulées avec des pools de HIV-1 Gag peptidiques. Lorsque les cellules CD3 sont épuisées à partir des PBMC, il n'y a pas d'IFN-γ ou l'IL-2 produite en réponse à une stimulation antigénique (figure 3B), indiquant que la sécrétion d'IFN-γ et l'IL-2 est induite en réponse à VIH-spécifiques CD4 T stimulation spécifique à un antigène cellulaire. Pour certaines cytokines, telles que IL-21, la sensibilité des arrangements de billes ne permet pas de détecter les niveaux de protéine après les réponses faibles d'antigène telles que le VIH. Pour les cytokines, la quantification de l'ARNm peut être effectué à la place 12.

Certaines cytokines, telles que l'IFN-γ et TNF-α, peuvent être produites par une variété de sous-ensembles de cellules. Lors d'expériences sur des PBMC appauvries en CD8, il est parfois difficile de identfy la source de protéines de sécrétion, et, par conséquent, il est difficile d'identifier le sous-ensemble de cellules qui responded de bloquer des molécules inhibitrices. Pour cette raison, nous avons développé une variante de cette méthode pour effectuer une enquête plus approfondie de l'impact de blocage molécules inhibitrices sur la sécrétion de cytokines par tri différents sous-ensembles de cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques. Figure 4 montre l'impact de PD-1 blocus de l'IFN -γ et l'IL-2 sécrétée par les cellules T CD4 triées. Pour cette expérience, des PBMC appauvries en CD8 ont été stimulées pendant 12 h en présence d'un anticorps PD-L1 blocage ou un contrôle d'isotype. Après 12 h, les cellules ont été colorées avec des anticorps surface fluorescentes et des cellules T CD4 ont été triées en utilisant un cytomètre en flux trieur de cellules. Cellules T CD4 triées ont été ensuite incubées pendant 36 heures de plus et les cytokines ont été mesurées dans le surnageant en utilisant des arrangements de billes comme décrit ci-dessus. Nous avons utilisé cette approche avec succès dans le passé pour trier les cellules T CD4 en fonction de leurs niveaux de PD-1 expression et avons montré que PD-L1 blocus peut restaurer la fonction de VIH-sp cellules T CD4 ecific qui expriment des niveaux élevés de PD-1 12.

Le nombre de voies immuno identifiés en fonction administration des lymphocytes T dans l'infection à VIH est en constante augmentation. Nous avons utilisé avec succès ce test dans le passé pour montrer l'impact de l'IL-10 blocus de l'IFN-γ et IL-2 de la sécrétion par les cellules T CD4-1-spécifiques du VIH 8,13. Un des avantages de cette méthode est la capacité d'évaluer comment les molécules immuno régulent l'interaction des cellules spécifiques au VIH CD4 T avec des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Figure 5A montre l'impact de l'IL-10 blocus sur la restauration de l'IL-12 sécrétion de cellules présentatrices d'antigène. Avec une adaptation de cette technique, en effectuant ICS à 48 h après la stimulation, nous avons pu montrer que les monocytes sont la principale source d'IL-12 après stimulation avec piscines Gag VIH-1 peptide (figure 5B).

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Figure 1. Représentation schématique de la méthodologie. Isolé CMSP CD8 appauvri provenant de sujets infectés par le VIH sont incubées pendant 15 min, soit avec des anticorps de contrôle d'isotype ou anticorps bloquants contre PD-L1 ou IL-10Rα. Après une stimulation de 48 h avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les surnageants sont prélevés pour les mesures de la sécrétion de cytokine avec des arrangements de billes et les culots de cellules sont recueillies, soit pour l'analyse phénotypique par cytométrie en flux ou analyse transcriptionnelle des taux d'ARNm en utilisant la qRT-PCR.

Figure 2
Figure 2. La détection des réponses de cellules T spécifiques de l'antigène avec l'ARNm ou de la protéine de sécrétion. A: CMSP CD8 épuisés stimulées avec une piscine Gag VIH-1 peptide. IFN-γ sécrétion a été mesurée à 48 h après la stimulation B:. Taux d'IFN-γ ARNmont été mesurés avec qRT-PCR dans les culots cellulaires à 48 h après la stimulation C:. corrélation de la concentration d'IFN-γ dans les surnageants avec des niveaux d'IFN-γ d'ARNm. D:. Comparaison de l'IL-13 niveaux de protéines entre CMSP CD8 appauvri stimulées par le VIH-1 Gag groupe de peptides ou l'anatoxine tétanique IFN-γ et Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Les changements de la sécrétion de cytokines après une manipulation de voies inhibitrices est CD4 des lymphocytes T dépendant de A et B:. CD8 CD3 épuisé ou appauvri PBMC stimulées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide en présence de témoin isotype ou PD-L1 anticorps bloquant. IFN-γ et l'IL-2 a été mesurée à la sécrétion de 48 h après la stimulation.


Figure 4. Tri des cellules T CD4 pour détecter la sécrétion de cytokines après manipulation de PD-1 blocus. AB: PBMC appauvries en CD8 provenant de trois chroniquement infectés, les sujets non traités ont été incubées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide ou laissées non stimulées pendant 12 h en présence de témoin isotype ou PD-L1 anticorps bloquant. Cellules T CD4 ont ensuite été sélectionnés négativement par l'exclusion de la lignée des lymphocytes et incubées encore pendant 36 heures.

Figure 5
Figure 5. Interaction entre les lymphocytes T CD4 et les cellules présentatrices d'antigène. A: Les PBMC appauvries en CD8 ont été stimulées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide en présence de témoin isotype ou l'IL-10Rα anticorps bloquant. IL-12 niveaux dans le surnageant ont été mesurées à 48 h après la stimulation B.:Les PBMC appauvries en CD8 stimulées avec un pool de peptide de HIV-1 Gag. IL-12 sécrétion sur les monocytes a été mesurée avec ICS à 48 h après la stimulation.

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Discussion

collecte de surnageant est une composante essentielle de cette conception expérimentale. Lors de la récolte des surnageants pour l'analyse Luminex, des aliquotes ont été établis et conservés à -80 ° C pour éviter la dégradation des protéines en raison de cycles gel-dégel. La congélation et la décongélation peut être processus rigoureux pour les protéines, et en minimisant gel-dégel, le signal sera maximisé dans les essais. Par conséquent, il est plus facile d'obtenir des données plus précises et reproductibles lorsque l'on travaille à partir de portions aliquotes qui ont été congelé et décongelé le même nombre de fois.

Nous avons déjà effectué une analyse cinétique de la sécrétion de cytokines et les niveaux d'ARNm après stimulation avec le VIH-Gag groupes de peptides 12. Sur la base de cette cinétique, nous avons choisi le point de temps de 48 heures pour effectuer les mesures de sécrétion de cytokines. Compte tenu des différences observées entre les ARNm et la sécrétion de protéines ainsi que entre les différents stimuli, il est impératif que les chercheurs effectuent leurs propres analyses de cinétique en fonction des stimuliqu'ils utilisent et qu'ils mesurent l'expression de l'ARNm ou de la protéine de sécrétion de cytokines.

Lorsque les sous-ensembles de cellules sont triées (en utilisant la méthode représentée sur la figure 3), il est important de régler le volume de la culture en fonction du nombre de cellules triées. Dans le test standard, nous incubons généralement 1 million de PBMC CD8 appauvri dans 500 pi de milieu. Cependant, lorsque nous cellulaires tri des sous-ensembles, tels que les cellules T CD4, nous trions habituellement jusqu'à 100 000 cellules. Pour cette raison, on diminue le volume du milieu à 200 pi, afin de conserver les cellules de dilution et de parvenir à une concentration de cytokine qui est détectable par le réseau de billes. Pour chaque expérience, le volume des cultures de cellules doit être testée expérimentalement, en prenant en considération le type de cellule, le nombre de cellules triées, la cytokine d'intérêt, et la sensibilité du test de détection.

Un autre aspect important lors de l'exécution du test Luminex est inactivati ​​de virussur. Virus doit être inactivé pour être en mesure d'exécuter en toute sécurité des échantillons sur l'instrument. Tween-20 a été utilisé pour cette raison. Antérieurement, d'autres détergents ont été testés dans ce but. Différentes dilutions de 0,5% de Tween, 5 à 10% de Triton, et un tampon de lavage ont été ajoutés à des cellules infectées par le VIH et ont été testés contre des cellules noninactivated. Tween a été trouvé pour inactiver le virus en interférant au mieux moins avec les dosages effectués.

Lors de l'exécution de cytométrie en flux, une étape essentielle lorsque la coloration pour les monocytes est de bloquer les récepteurs Fc avec un réactif de blocage de Fc pour éviter la liaison non spécifique des anticorps monoclonaux. Le récepteur Fc est présent à la surface des cellules présentant l'antigène et se lie à la région Fc des anticorps. Si ce récepteur n'est pas bloqué avant la coloration, des anticorps monoclonaux qui sont ajoutés à une cible, à la place des marqueurs spécifiques peuvent se lier à ce récepteur, donnant ainsi un résultat faussement positif. Ceci est particulièrement important pour éviter l'analysecytokines qui dérivent d'un certain type de cellule, en tant que non bloquant ce récepteur pourrait être préjudiciable pour les résultats. Incubation des cellules dans des milieux contenant du sérum humain peuvent également aider avec ce problème, car il ya une grande quantité d'IgG dans le sérum qui se lient au récepteur Fc.

Bien que des dosages Luminex fournissent une détection plus sensible que les essais de l'ICS, certaines molécules effectrices telles que l'IL-21 ou la perforine sont encore difficiles à détecter par cette méthode. Cette approche in vitro permet une analyse de la transcription en utilisant qRT-PCR qui permet une plus grande sensibilité pour la détection d'autres molécules effectrices.

Une des limites de notre approche expérimentale est que l'interprétation de ses résultats est difficile lorsque la cytokine d'intérêt est produite par différents sous-ensembles de cellules du mélange hétérogène de leucocytes présents dans les CMSP entiers ou CMSP CD8 appauvri. Par exemple, ceci est le cas pour la cytokine IL-10 qui est régulée à la hausse dans des cellules différentes types dans le cadre de la maladie VIH progressive 8. Tri de la population d'intérêt avant une incubation et la collecte des surnageants est une approche alternative, nous avons utilisé avec succès dans ce contexte.

En résumé, les techniques présentées dans le présent document fournissent un moyen fiable de mesurer la restauration de la production de cytokines par les cellules CD4 ou CD8 spécifiques au VIH en présence de blocus des PD-L1 et IL-10 voies d'immuno. Ces techniques peuvent être appliquées dans les cas où les cytokines ne sont pas facilement détectables par cytométrie en flux.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Gordon Freeman pour fournir l'anticorps bloquant anti-PD-L1. Nous remercions le personnel clinique et de laboratoire à l'Hôpital général du Massachusetts et tous les participants à l'étude pour leur rôle inestimable dans ce projet.

Cette étude a été financée par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health (SP1 AI-080192; DEK), le coeur-poumon National and Blood Institute des National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK est soutenu par une bourse de carrière bourse de recherche du Fonds de recherche en santé du Québec (FRQS). FP est soutenu par une subvention de la communion de l'Assemblée générale Comité exécutif Hôpital Massachusetts sur la recherche et le Global Health Institute de Harvard (HGHI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

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References

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Immunologie Numéro 80 les maladies virales les maladies du système immunitaire le VIH CD4 lymphocytes T CD8 les lymphocytes T cellules présentatrices d'antigène les cytokines réseaux immunorégulatoires PD-1: IL-10 l'épuisement les monocytes
Essai <em>in vitro</em> pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH
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Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

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