Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50821
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)
* These authors contributed equally

Summary

وضعنا مقايسة في المختبر للتحقيق في دور مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة.

Abstract

T خلية الإرهاق هو عامل رئيسي في إزالة الممرض فشلت خلال العدوى الفيروسية المزمنة. وupregulated مسارات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، على هذا المستضد التعرض المستمر وتساهم في فقدان الانتشار، وانخفاض وظيفة لحل الخلايا، وضعف إنتاج السيتوكينات من قبل خلايا CD4 و CD8 T. في نموذج الفئران من الإصابة LCMV، إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات اثنين زيادة استجابات الخلايا التائية. ومع ذلك، لا يوجد حاليا أي فحص في المختبر لقياس أثر هذه الحصار على إفراز السيتوكينات في الخلايا من عينات الإنسان. لدينا بروتوكول والمنهج التجريبي تمكننا من تحديد بدقة وكفاءة إعادة إنتاج السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من الموضوعات فيروس نقص المناعة البشرية المصابة.

هنا، ونحن تصور وتصميم التجارب في المختبر تمكن من قياسات إفراز السيتوكينات من الخلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة وتأثيرها على سل أخرىمجموعات فرعية ل. تم استنفاد خلايا CD8 T من الدم الكامل وتم عزل PBMCs المتبقية عبر Ficoll طريقة الانفصال. ثم تم تحضين PBMCs المنضب CD8 مع منع الأجسام المضادة ضد PD-L1 و / أو IL-10Rα، وبعد التحفيز مع حمام سباحة الكمامة الببتيد HIV-1، وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد أن جمعت 48 ساعة، طاف للتحليل خلوى بواسطة صفائف الخرز وكريات خلية تم جمعها للتحليل المظهري إما باستخدام التدفق الخلوي أو تحليل النسخي باستخدام QRT-PCR. لتحليل أكثر تفصيلا، تم الحصول على السكان مختلفة من الخلايا عن طريق استنزاف فرعية انتقائية من PBMCs أو عن طريق الفرز باستخدام التدفق الخلوي قبل أن يتم تقييمها في نفس المقايسات. توفر هذه الأساليب نهج حساسة للغاية ومحددة لتحديد التشكيل الإنتاج خلوى من قبل خلايا تي المساعد مستضد محددة وتحديد التفاعلات الوظيفية بين مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية.

Introduction

خلال العدوى الفيروسية المستمرة، وخلايا محددة-T فيروس اكتساب عيوب وظيفية في عملية تعرف باسم الخلايا التائية الإرهاق. في الدراسات المجراة في نموذج الفئران من LCMV عدوى فيروسية مزمنة في وقت مبكر إلى أن الخلايا T الفيروس محددة استنفدت خفضت وظيفة لحل الخلايا ضد الخلايا المصابة فيروسي، وتفقد قدرتها على التكاثر وخفضت القدرة على إنتاج السيتوكينات مثل IL-2، TNF- α الإنترفيرون γ و1،2. شبكة معقدة من الممرات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، وupregulated خلال الالتهابات المزمنة وتسهم في ضعف الخلايا التائية (إعادة النظر في 3،4). في الجسم الحي إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات المثبطة في الماوس LCMV نموذج استعادة وظيفة خلايا تي فيروس محددة استنفدت وتعزيز إزالة الفيروسية، مشيرا إلى أن استنفاد الخلايا التائية هي ظاهرة عكسها جزئيا (مراجعة في 5).

النتائج على التم تمديد ه نموذج LCMV بسرعة للعدوى الفيروسية المزمنة مثل الإنسان HBV، HCV وفيروس نقص المناعة البشرية 5. في المزمنة عدوى HIV-1، وupregulated PD-1 و IL-10 مسارات في مواضيع المصابة وترتبط مع معلمات من تطور المرض، مباشرة مع الحمل الفيروسي وعكسيا مع عدد CD4 6-8. الحصار الضد من PD-1 أو IL-10 مسارات في المختبر استعادة انتشار خلايا CD4 و CD8 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة تشير إلى أن، على غرار نموذج LCMV الماوس، T استنفاد الخلايا لدى البشر هي ظاهرة عكسها جزئيا. ولكن نظرا إلى الطبيعة دقيق من التجارب على العينات البشرية فضلا عن القيود في حساسية في المختبر فحوصات، تحقيق شامل في الأوضاع استعادة الفنية من خلال هذه التدخلات حققت غائب لافت للنظر. وكانت فحوصات الانتشار، حتى الآن، والوحيدة التي يعول عليها في المختبر اختبار في معظم الدراسات الفحص، ولكن هناك نقصا ملحوظا من الأدلة على أثر هذه أمورالتدخالت على: 1) قدرة قتل الخلايا التائية السامة، 2) تأثير مضاد للفيروسات من خلايا T على تكاثر الفيروس، 3) الشخصى إفراز السيتوكينات، و 4) تأثير على CD4 الخلايا التائية المساعدة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى.

الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) هو مفيد جدا وتستخدم على نطاق واسع على أساس مقايسة تدفق الخلوي الذي يستخدم للكشف عن إنتاج السيتوكينات في مختلف أنواع الخلايا في كل من الفئران والبشر. كما تم استخدامه لدراسة تأثير الحصار الضد من المسارات المثبطة. في المقايسات ICS، يتم حظر إفراز خلوى من خلال إضافة Brefeldin و / أو مونينسين. السيتوكينات المحاصرين داخل الخلايا ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة مع الفلورسنت باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي. مدة الفحص عادة يقتصر على 6 أو 12 ساعة بعد التحفيز مستضد لأن كلا Brefeldin ومونينسين، والتي عادة المضافة داخل 2 ساعة من إضافة مستضد، هي سامة للخلايا. مقايسة ICS هي تقنية قوية التي كانت ط مفيدةن التحقيق من تأثير في الجسم الحي إدارة منع التدخل الأجسام المضادة في الفئران حيث تم استخراج الخلايا بعد فترة معينة من الوقت بعد التعرض الضد 9. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لتطبيق هذا النهج التجريبية لتقييم أثر الحصار المفروض على المستقبلات المثبطة في العينات البشرية. عند تنفيذ التدخلات الضد من المسارات المثبطة في 6 أو 12 ساعة التحفيز في المختبر (عادة الحال مع العينات البشرية)، الحصار من المستقبلات المثبطة في معظم الحالات لا يغير من وتيرة الاستجابة خلايا T مستضد محددة مقاسا المقايسات ICS القياسية 6، 7. أعطت قياسات الإنتاج خلوى في خلايا مقاسا متوسط ​​أو متوسط ​​كثافة مضان نتائج غير متناسقة 6، 7، 10. من ناحية أخرى، عندما يتم تنفيذ ICS عند نقطة أواخر الوقت بعد التحفيز (أي ستة أيام)، والتغييرات في عدد من إفراز السيتوكينات جويمكن ملاحظة أذرع. الاختلافات هي التأثير المشترك للتغير الانتشار والبقاء، والتغيرات في وظيفة المستجيب التي تتراكم على مدى فترة محددة من الوقت 6. طريقة واحدة للتغلب على هذه القيود جزئيا هو احتضان لفترات أطول من الوقت (على سبيل المثال 36 ساعة، 60 ساعة، الخ.) مع مستضد قبل إضافة مانع إفراز خلوى دون انتظار انتشار تحدث. وقد استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب لتحديد حركية إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية محددة CD4 و CD8 T 11،12، ولكن هذا النهج ليس قادرا على الكشف عن الاستجابات الصغيرة ولن يعطي نتيجة متكاملة من إفراز السيتوكينات مجموع تحدث منذ التحفيز. لذا، ICS ليست طريقة حساسة بما يكفي للكشف عن تأثير الحصار من مسارات المثبطة على كمية من السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تفعيلها مقارنة مع خلوى مرنا الكميات أو قياسات من إفراز خلوى في supernatanر في الوقت نفسه نقطة. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تنشيط العمل في الأزياء autocrine من خلال المساهمة في ردود فعل إيجابية أو سلبية حلقات عبر التفاعل مع الخلايا مستضد تقديم. لذلك، إضافة Brefeldin أو مونينسين خلال فحص ICS يمنع إفراز السيتوكينات، وبالتالي تحفيز خلايا T ليس الأمثل. أخيرا، كشف عن السيتوكينات متعددة مع ICS محدودة بسبب توافر وحساسية الأجسام المضادة للكشف عن السيتوكينات مع التدفق الخلوي فضلا عن القيود في عدد من fluorochromes التي يمكن استخدامها في وقت واحد في أي لوحة معينة.

قمنا بتطوير نهج حساسة للغاية في المختبر التجريبي لتقييم تأثير مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة وبالتالي CD4 تساعد على تقديم المستضد خلايا (ناقلات الجنود المدرعة) والخلايا القاتلة الطبيعية (الخلايا القاتلة الطبيعية). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتقييم السلطة الإسرائيليةط الحصار من الجزيئات المثبطة CD8 T على وظيفة الخلية عن طريق استنزاف خلايا CD4 T من PBMCs أو من خلال تحفيز الببتيدات مع الأمثل التي يتم التعرف عليها إلا من خلال خلايا CD8 T. وعلى النقيض من الخلايا تلطيخ خلوى المقايسات، قررنا عدم التدخل في إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من أجل أن يكون قادرا على: 1) إجراء تقدير أكثر دقة لمستويات خلوى المنتجة؛ 2) التحقيق في لجنة أوسع السيتوكينات أو الجزيئات المستجيب، و 3) تقييم أثر السيتوكينات التي تنتجها الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى. نحن تحفيز PBMCs المنضب CD8 مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد في وجود أجسام مضادة لعرقلة مسار مناعة من الفائدة. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، عادة 48 ساعة، ونحن جمع supernatants لقياس إفراز السيتوكينات مع صفائف حبة وجمع الكريات الخلايا إما لتحليل المظهري من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا لتحليلها أو النسخي. علما، في رله 48 نقطة زمنية ساعة، ونحن لا كشف عدد كبير من السكان من الخلايا المتكاثرة T 12. هذا هو نهج مرن والعديد من التعديلات من هذا التصميم يمكن تطبيقها لمعالجة الفرضيات المختلفة. على سبيل المثال، مجموعات فرعية الخلايا الفردية (مثل خلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة أو PD-1 خلايا CD4 T عالية، الخ.) يمكن فرزها بعد 12 ساعة من الحضانة قبل مزيد من الحضانة لمدة 36 ساعة تليها مجموعة من supernatants وكريات خلية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا تأثير التدخلات الحصار على إفراز السيتوكينات من مجموعات سكانية فرعية محددة من PBMCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. استنزاف وعزل PBMCs عبر Ficoll فصل

  1. تستنفد خلايا CD8 + T بإضافة الإنسان CD8 + استنفاد كوكتيل في 50 ميكرولتر / مل من الدم الكامل.
  2. تخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية).
  3. بعد الحضانة، ومزج الدم الكامل مع HBSS (محلول الملح المتوازن هانك دون كا 2 + أو 2 ملغ +) وطبقة أكثر Histopaque. تدور في إطار التعاون الإقليمي 340 لمدة 30 دقيقة (لا الفرامل، والتسارع البطيء).
  4. جمع PBMCs ونقل إلى 50ML المخروطية جديدة. غسل 2X مع 45 مل 1640 RPMI تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES من خلال الدوران لمدة 10 دقيقة في 340 إطار التعاون الإقليمي.

2. حصار الأجسام المضادة وتحفيز المستضد محددة من الخلايا

  1. Resuspend الخلايا في 2X10 6 في حالة في 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مصل الإنسان تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES،وهو ما يمثل 500 ميكرولتر لكل حالة.
  2. قسامة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب FACS.
  3. تبعا لمسار التحقيق، إضافة PD-L1، IL-10Rα منع الأجسام المضادة و / أو ضوابط نمط إسوي في 10 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  4. تحفيز الخلايا مع حمام سباحة الببتيد HIV-1 الكمامة في 1 ميكروغرام / مل / الببتيد تركيز النهائي. وتشمل أيضا "لا التحفيز" التحكم لكل حالة حظر. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.

3. جمع وتحليل طاف

  1. بعد 48 ساعة، وتدور أسفل أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 7 دقائق في 340 إطار التعاون الإقليمي.
  2. جمع بعناية 2 × 225 ميكرولتر طاف في أنابيب إيبندورف لLUMINEX صفائف حبة من دون إزعاج بيليه.
  3. تعطيل الفيروس في طاف جمعها مع 25 ميكرولتر 0.5٪ PBS-توين لإعطاء تركيز النهائي من 0.05٪ PBS-توين.
  4. مخزن جمع supernatants التي ليست immedتستخدم iately في الفريزر -80 درجة مئوية.
  5. قياس تركيزات خلوى المطلوب باستخدام ميليبور LUMINEX عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. جمع وتحليل المظهري من الخلايا عن طريق التدفق الخلوي

  1. بعد جمع طاف، وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 3ML. تدور الخلايا لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 صب غسل الزائدة.
  2. وصمة عار للبقاء باستخدام ايف / الميت الميت قابل للتثبيت اللطخة خلية كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية. resuspend في 100 ميكرولتر PBS 1٪ FBS.
  4. إذا تلطيخ لحيدات أو الخلايا مستضد تقديم غيرها، والمستقبلات كتلة التيسير عن طريق إضافة 1.4 ميكرولتر من كاشف FCR حجب ودوامة لخلط.
  5. احتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. إضافة الأجسام المضادة السطحية، الدوامة، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  7. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، صب غسل الزائدة، وإضافة 200 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪. احتضانفي درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  8. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، resuspend في 250 ميكرولتر PBS 1٪ FBS، والحصول على تدفق عداد الكريات multilaser (على سبيل المثال BD LSRII أو Fortessa).

5. تحليل الخلايا عن طريق QRT-PCR

  1. لخلايا لا تحليلها عن طريق التدفق الخلوي: بعد جمع طاف، وخلايا ليز في 300 ميكرولتر العازلة في Qiagen RLT تحتوي على 1٪ بيتا المركابتويثانول. إذا لم المستمر مع بروتوكول، يمكن تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية بعد هذه النقطة.
  2. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. توليف [كدنا] من الحمض النووي الريبي باستخدام التوليف [كدنا] طقم التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  4. أداء الكمي PCR باستخدام تقنية SYBR الأخضر.
  5. خلق مزيج التمهيدي لكل التمهيدي المستخدمة بما في ذلك الجينات التدبير المنزلي (مثل IL-13، IL-10، الإنترفيرون γ، GAPDH) وذلك بإضافة الاشعال لنوكلياز خالية من المياه لإعطاء تركيز النهائي من 10ميكرومتر. الحفاظ على الجليد.
  6. إنشاء مزيج الرئيسي لكل التمهيدي بإضافة 10.5 ميكرولتر nuclease خالية من المياه، 12.5 ميكرولتر SYBR الخضراء، و 1 ميكرولتر مزيج التمهيدي في لوحة جيدا. الحفاظ على الجليد.
  7. ماصة 24 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة التي سيتم استخدامها.
  8. إضافة 1 ميكرولتر [كدنا] إلى كل بئر وفقا للقالب.
  9. سقف الآبار وأجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 3 دقائق في 800 إطار التعاون الإقليمي.
  10. تشغيل لوحة على جهاز QRT-PCR، مثل أداة Stratagene MX3005P.

6. التكيف للداخل الخلايا تلطيخ خلوى في 48 ساعة

إضافة Brefeldin ومونينسين 6 ساعة قبل الخلايا تلطيخ خلوى. يضاف Brefeldin بتركيز 10 ميكروغرام / مل بينما يتم إضافة مونينسين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. للراحة، Brefeldin يمكن إضافة 12 ساعة قبل وصمة عار بتركيز من 5 ميكروغرام / مل.

  1. بعد وصمة عار السطح، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS وصمة عار لفيالسيتوكينات tracellular مثل IL-12، الإنترفيرون γ، وTNF-α استخدام عدة التثبيت / Permeabilization الحل والبروتوكول.
  2. غسل الخلايا، resuspend في 250 ميكرولتر PBS 1٪ FBS، وتعمل على تدفق عداد الكريات multilaser (على سبيل المثال BD LSR الثاني أو Fortessa).

7. التكيف لفرز الخلايا

  1. 16 ساعة بعد التحفيز، وصمة عار للبقاء باستخدام ايف / الميت قابل للتثبيت الميت وصمة عار خلية كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تبقي الخلايا على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية. resuspend في 100 ميكرولتر PBS 1٪ FBS.
  3. إضافة الأجسام المضادة السطحية، ودوامة لخلط، واحتضان الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية وresuspend في 500 ميكرولتر RPMI الباردة 1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES.
  5. تصفية الخلايا باستخدام 5 مل البوليرينيه أنبوب الجولة القاع مع غطاء الخلوي مصفاة.
  6. إعداد أنابيب جمع لنوع بإضافة 200 ميكرولتر 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES لكل أنبوب. إبقاء جميع أنابيب على الجليد أثناء الفرز.
  7. يعيش فرز مجموعات فرعية من الخلايا في المصالح على صك (على سبيل المثال BD FACS الأغنية II) يقع في منشأة مجهزة للمواد biohazardous.
  8. بعد أن تم فرز الخلايا، وخلايا المكان مرة أخرى في الحاضنة لمدة المبلغ المطلوب من الوقت والمتابعة مع تحليل جمع طاف / LUMINEX وتحليل خلية جمع بيليه / PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عند تنفيذ القياسات خلوى استخدام هذا النظام في المختبر، فمن الضروري أن تكون قادرة على التمييز بين الاستجابات مستضد محددة بالمقارنة مع أي سيطرة التحفيز. بشكل عام، درسنا ردودا إيجابية عن أي قيم التحفيز الأنتيجين التي تعطي زيادة على الأقل ثلاثة أضعاف في مستويات خلوى بالمقارنة مع أي سيطرة التحفيز والتي كانت ضمن مجموعة خطية من الفحص. نحن نستخدم عالية الحساسية المقايسات مجموعة حبة التي يمكن الكشف عن تركيزات منخفضة مثل السيتوكينات 0.16 جزء من الغرام / مل، مما يتيح لنا أن نلاحظ ضعف CD4 T استجابات الخلايا مستضد محددة. يتم تشغيل العينات في مكررة من أجل ضمان الحصول على ما قيم دقيقة. يبين الشكل 2A أن لإنتاج الإنترفيرون γ، الفحص يمكن الكشف عن وسيطة من زيادة 800 أضعاف مقارنة مع عدم التحفيز. هذه القيم تعتمد على السيتوكينات اختبار للبعض منهم، مثل IL-13 و IL-2، القيم الأدنى بالمقارنة مع أي التحفيز سوفيتعين مراعاتها. ينطبق نهج مماثل لالنسخي من مرنا من مختلف السيتوكينات الاختبارات. ويبين الشكل 2B مستوى مرنا لالإنترفيرون γ التي زادت بشكل ملحوظ (أكثر من ثلاثة أضعاف) بعد التحفيز. مع هذا الاختبار، هناك علاقة قوية بين إفراز بروتين الإنترفيرون γ والإنترفيرون γ مستويات مرنا (الشكل 2C). على الرغم من أننا وضعت هذا النهج في المختبر لدراسة CD4 T وظيفة الخلية فيروس نقص المناعة البشرية محددة، لدينا أيضا استخدمت بنجاح هذه المقاربة لتقييم أثر PD-L1 و / أو الحصار IL-10Rα على استجابات خلايا CD4 T بعد التحفيز مع SEB، anti-CD3/CD28، CMV المحللة وRD-1 الببتيدات من المتفطرة السلية (لا تظهر البيانات). هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم الاستجابات لمستضدات جرثومية، بما في ذلك الاستجابات التي يسببها اللقاح، وأيضا على حد سواء. ويبين الشكل 2D أن التحفيز مع فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة النتائج بمزيد من إفراز الإنترفيرون γ بينما التحفيز مع الكزاز toxoiالنتائج د في أعلى IL-13 إفراز، مما يدل الشخصى خلوى مختلفة من فيروس نقص المناعة البشرية والاستجابات الكزاز محددة خلايا CD4 T.

إحدى نقاط القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو القدرة على الكشف عن الاختلافات في إفراز خلوى بعد التلاعب الضد من المسارات المثبطة التي لم يتم الكشف عنها من قبل الآخرين في المختبر فحوصات مثل ICS. تجدر الإشارة إلى أن بعض السيتوكينات، مثل IL-2، قد يتم امتصاصها من قبل خلايا حتى القياسات في طاف يحتمل أن نقلل من مستويات خلوى المنتجة. لهذا السبب، ينبغي تأكيد أي اختلافات في إفراز الأجسام المضادة خلوى وحظ بعد الحصار أيضا على مستوى مرنا لتقييم ما إذا كانت الاختلافات الملحوظة هي نتيجة للتغيرات في الإنتاج في الخلية. ويبين الشكل 3A أثر منع الأجسام المضادة PD-L1 على الإنترفيرون -γ و IL-2 إفراز من قبل خلايا فيروس نقص المناعة البشرية محددة CD4 T بعد 48 ساعة من التحفيز مع مستضد وما شابه ذلك. الحصار المفروض على مسار PD-1 عموما لايوجدتأثير كبير على إفراز السيتوكينات من دون أي تنبيه مستضد لكن الإنترفيرون γ يعزز وIL-2 عندما يتم تحفيز إفراز الخلايا مع حمامات HIV-1 الكمامة الببتيد. عندما تنضب الخلايا CD3 من PBMCs، لا يوجد الإنترفيرون γ أو IL-2 التي تنتج في استجابة لتحريض المستضد (الشكل 3B) مشيرا إلى أن إفراز الإنترفيرون γ و IL-2 هو فعل استجابة لفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T-محددة خلية مستضد محددة التحفيز. بالنسبة لبعض السيتوكينات، مثل IL-21، وحساسية من صفائف حبة لا يسمح الكشف عن مستويات البروتين بعد ردود مستضد ضعيفة مثل فيروس نقص المناعة البشرية. بالنسبة لأولئك السيتوكينات، الكمي مرنا يمكن القيام بها بدلا 12.

بعض السيتوكينات، مثل الإنترفيرون γ وTNF-α، يمكن أن ينتج عن مجموعة متنوعة من مجموعات فرعية الخلية. عند إجراء التجارب على PBMCs CD8 المنضب، فإنه من الصعب في بعض الأحيان إلى identfy مصدر إفراز البروتين، وبالتالي، فمن الصعب تحديد الخلية التي فرعية المسؤولةدائرة التنمية الاقتصادية في الحصار من الجزيئات المثبطة. لهذا السبب قمنا بتطوير البديل من هذا الأسلوب لإجراء تحقيق أكثر شمولا لتأثير كابح بشكل خاص على منع الجزيئات إفراز السيتوكينات من فرز مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا وفقا لخصائصها المظهرية. الشكل 4 يوضح تأثير PD-1 الحصار على الإنترفيرون -γ و IL-2 يفرز من قبل خلايا CD4 T فرزها. لهذه التجربة، وحفز PBMCs CD8 المنضب لمدة 12 ساعة في وجود حظر PD-L1 الأجسام المضادة أو isotype السيطرة. بعد 12 ساعة، وكانت الخلايا تم فرز السطح الملون مع الأجسام المضادة الفلورسنت وخلايا CD4 T باستخدام تدفق عداد الكريات فارز الخلية. فرز خلايا CD4 T وثم حضنت لمدة 36 ساعة إضافية وتم قياس السيتوكينات في طاف باستخدام صفائف حبة كما هو موضح أعلاه. وقد استخدمنا هذا النهج بنجاح في الماضي لفرز خلايا CD4 T وفقا لمستوياتها من PD-1 التعبير وأظهرت أن PD-L1 الحصار يمكن استعادة وظيفة من فيروس نقص المناعة البشرية ليرة سورية خلايا CD4 T ecific التي تعبر عن مستويات عالية من PD-1 12.

عدد مسارات مناعة التعرف على وظيفة خلايا T في الحكم عدوى فيروس نقص المناعة البشرية في تزايد مستمر. وقد استخدمنا بنجاح هذا الاختبار في الماضي لإظهار تأثير IL-10 الحصار على الإنترفيرون γ و IL-2 إفراز من قبل خلايا HIV-1-T CD4 محددة 8،13. واحدة من مزايا هذا الأسلوب هو القدرة على تقييم مدى جزيئات مناعة تنظيم التفاعل بين الخلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة مع الخلايا مستضد تقديم (ناقلات الجنود المدرعة). ويبين الشكل 5A تأثير IL-10 الحصار على استعادة IL-12 من إفراز مستضد تقديم الخلايا. مع تطويع هذه التقنية، عن طريق إجراء ICS في 48 ساعة بعد التحفيز، كنا قادرين على إظهار أن حيدات هي المصدر الرئيسي للIL-12 بعد التحفيز مع حمامات HIV-1 الكمامة الببتيد (الشكل 5B).

ه 1 "سرك =" / files/ftp_upload/50821/50821fig1.jpg "/>
الشكل 1. يتم تحضين التمثيل التخطيطي للمنهجية. المعزولة المنضب CD8 PBMCs من المواضيع فيروس نقص المناعة البشرية المصابة لمدة 15 دقيقة إما مع الأجسام المضادة isotype السيطرة أو منع الأجسام المضادة ضد PD-L1 أو IL-10Rα. بعد التحفيز ساعة 48 مع حمام سباحة الكمامة الببتيد HIV-1، يتم جمع supernatants لقياس إفراز السيتوكينات مع صفائف حبة والكريات الخلايا يتم جمعها إما لتحليل المظهري باستخدام التدفق الخلوي أو تحليل النسخي مستويات مرنا باستخدام QRT-PCR.

الرقم 2
الشكل 2. الكشف عن استجابات الخلايا التائية مستضد معين مع مرنا أو إفراز البروتين. ج: PBMCs CD8 المنضب حفز مع حمام سباحة الكمامة الببتيد HIV-1. وقد تم قياس إفراز الإنترفيرون γ في 48 ساعة بعد التحفيز B: مستويات الإنترفيرون γ مرنا تم قياس مع QRT-PCR في الكريات الخلية في 48 ساعة بعد التحفيز C: ارتباط تركيز الإنترفيرون γ في supernatants مع مستويات الإنترفيرون γ مرنا. D:. مقارنة بين الإنترفيرون γ و IL-13 بين مستويات البروتين PBMCs المنضب CD8 حفز مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد أو التيتانوس انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. التغيرات في إفراز خلوى بعد التلاعب مسارات المثبطة هو CD4 T تعتمد على الخلية A و B:. CD8 المنضب أو المستنفد CD3 PBMCs حفز مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد في وجود isotype السيطرة أو PD-L1 منع الأجسام المضادة. وقد تم قياس الإنترفيرون γ و IL-2 إفراز في 48 ساعة بعد التحفيز.

er.within صفحة = "دائما"> الرقم 4
الشكل 4. فرز خلايا CD4 T للكشف عن إفراز خلوى بعد التلاعب PD-1 الحصار. AB: حضنت PBMCs CD8 المنضب من ثلاثة بالعدوى بشكل مزمن، لم يخضعن للعلاج مع الكمامة تجمع الببتيد HIV-1 أو اليسار unstimulated لمدة 12 ساعة في وجود isotype السيطرة أو PD-L1 منع الأجسام المضادة. ثم تم تحديد الخلايا CD4 T سلبا النسب الإقصاء على الخلايا الليمفاوية والمحتضنة لمدة 36 ساعة إضافية.

الرقم 5
الرقم 5. التفاعل بين الخلايا CD4 T والخلايا العارضة للمستضد. وقد حفز PBMCs CD8 المنضب مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد في وجود isotype السيطرة أو IL-10Rα منع الأجسام المضادة: A. تم قياس مستويات IL-12 في طاف في 48 ساعة بعد التحفيز B.:PBMCs المنضب CD8 حفز مع حمام سباحة الببتيد HIV-1 الكمامة. وقد تم قياس إفراز IL-12 على وحيدات مع ICS في 48 ساعة بعد التحفيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جمع طاف هو جزء حتمي من هذا التصميم التجريبي. عندما حصاد supernatants لفحص LUMINEX، أدلى مأخوذة والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمنع تدهور البروتين بسبب تجميد أذاب دورات. تجميد والذوبان يمكن أن تكون عمليات قاسية للبروتينات، والتقليل من تجميد يذوب، سيتم مكبر إشارة في المقايسات. لذا، فمن الأسهل للحصول على بيانات أكثر دقة للتكرار وعند العمل من مأخوذة التي تم إذابة تجميد نفس العدد من المرات.

وقد أجرينا في السابق تحليل الحركية من إفراز السيتوكينات ومستويات مرنا بعد التحفيز مع حمامات الببتيد بفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة 12. على أساس هذه حركية، اخترنا نقطة زمنية 48 ساعة لتنفيذ القياسات إفراز السيتوكينات. نظرا للاختلافات التي تمت ملاحظتها بين مرنا وإفراز البروتين وكذلك بين محفزات مختلفة، لا بد من أن أداء الباحثون بتحليل الحركية الخاصة بهم اعتمادا على المحفزاتالتي يستخدمونها، وعما إذا كانت قياس التعبير مرنا أو إفراز بروتين خلوى.

عندما يتم فرز فرعية الخلية (باستخدام النهج هو مبين في الشكل 3)، فمن المهم لضبط حجم الصوت للثقافة وفقا لعدد الخلايا فرزها. في مقايسة مستوى، ونحن عادة احتضان 1000000 PBMCs المنضب CD8 في 500 ميكرولتر من المتوسط. ومع ذلك، عندما كنا الخلية فرز مجموعات فرعية، مثل خلايا CD4 T، ونحن عادة ما يصل إلى 100،000 فرز الخلايا. لهذا السبب، فإننا تقليل حجم المتوسط ​​إلى 200 ميكرولتر من اجل الحفاظ على من تمييع الخلايا وتحقيق تركيز خلوى هذا هو كشفها مع مجموعة حبة. لكل تجربة، وحجم الثقافات الخلية وينبغي اختبار تجريبيا، مع الأخذ في الاعتبار نوع من الخلايا، وأعداد الخلايا فرزها، خلوى في المصالح، وحساسية من عدة الكشف.

جانب آخر مهم عند إجراء فحص فيروس LUMINEX هو inactivatiعلى. يحتاج الفيروس إلى أن المعطل لتكون قادرة على تشغيل بأمان عينات على الصك. وقد استخدم توين 20 لهذا السبب. سابقا، كان قد تم اختبار المنظفات الأخرى لهذا الغرض. أضيفت التخفيفات مختلفة من 0.5٪ توين، 5-10٪ تريتون، وغسل العازلة إلى الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتم اختبار ضد خلايا noninactivated. تم العثور توين إلى تعطيل الفيروس أفضل حين تتدخل الأقل مع المقايسات التي يؤدونها.

عند تنفيذ التدفق الخلوي، خطوة أساسية عندما تلطيخ لحيدات هو لمنع مستقبلات التيسير مع كاشف حظر التيسير لمنع ملزم غير محدد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. مستقبلات التيسير موجودة على سطح الخلايا مستضد تقديم ويربط المنطقة التيسير من الأجسام المضادة. إذا لم يتم سد هذا المستقبل قبل تلطيخ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تمت إضافتها إلى استهداف علامات محددة بدلا من ذلك قد ربط هذا المستقبل، وبالتالي إعطاء نتيجة إيجابية كاذبة. هذا مهم بشكل خاص لتجنب عند تحليلالسيتوكينات التي تستمد من نوع من الخلايا معينة، كما لا تمنع هذا المستقبل يمكن أن يكون ضارا لنتائج. احتضان الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الإنسان يمكن أن يساعد أيضا مع هذه المسألة، كما أن هناك كميات وفيرة من مفتش في المصل التي تربط لمستقبلات التيسير.

على الرغم من المقايسات LUMINEX تقديم كشف أكثر حساسية من المقايسات ICS، بعض الجزيئات المستجيب مثل IL-21 أو perforin لا تزال صعبة للكشف مع هذا الأسلوب. هذا النهج في المختبر يسمح للتحليل النسخي باستخدام QRT-PCR أن توفر قدرا أكبر من الحساسية في الكشف عن الجزيئات المستجيب الأخرى.

واحد الحد من نهجنا التجريبية هو أن تفسير نتائجها من الصعب عندما يتم إنتاج خلوى من الاهتمام من خلال مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا من خليط غير متجانس من الكريات البيض موجودة في PBMCs كليا أو PBMCs المنضب CD8. على سبيل المثال، وهذا هو الحال بالنسبة للخلوى IL-10 التي upregulated في تاي مختلفة من الخلاياعبوة في تحديد مرض فيروس نقص المناعة البشرية التقدمية 8. الفرز من سكان الفائدة قبل مزيد من الحضانة وجمع supernatants هو نهج بديل وقد استخدمنا بنجاح في هذا السياق.

وباختصار، فإن التقنيات المعروضة في هذه الورقة تقديم وسيلة يمكن الاعتماد عليها لقياس استعادة الإنتاج خلوى من قبل خلايا CD4 أو CD8 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة في وجود الحصار المفروض على مسارات مناعة PD-L1 و IL-10. هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الحالات التي لا يمكن كشفها السيتوكينات بسهولة عن طريق التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر جوردون فريمان لتوفير الحجب الأجسام المضادة لمكافحة PD-L1. نشكر الكادر الطبي والمختبر في مستشفى ماساتشوستس العام وجميع المشاركين في الدراسة لدور لا تقدر بثمن في هذا المشروع.

وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (PO1 AI-080192؛ دك)، والرئة القومي للقلب والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL-092565؛ دك). ويدعم دك من قبل جائزة شهادة باحث من صندوق البحوث الصحية كيبيك (FRQS). ويدعم FP من خلال منحة زمالة من ماساتشوستس العام اللجنة التنفيذية مستشفى للبحوث ومعهد هارفارد للصحة العالمية (HGHI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ Sigma H9394
RPMI 1640 Sigma R0883
Histopaque-1077 Sigma 10771
Human Serum AB Gemini BioProducts 100-512
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30 001 CI
L-glutamine Mediatech 25 005 CI
HEPES buffer Mediatech 25060CI
FcR blocking reagent, human Miltenyi 130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell 15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen L23105
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Improm-II Reverse Transcription System Promega A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix Agilent 600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
Tween-20 Fisher BP337100
IFN-γ primer Invitrogen FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer Invitrogen FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 80، أمراض الفيروسات، وأمراض الجهاز المناعي، فيروس نقص المناعة البشرية، CD4 T الخلية، CD8 T الخلية، والخلية المقدمة للمستضد، السيتوكينات، وشبكات مناعة، PD-1: IL-10، والإرهاق، وحيدات
<em>في المختبر</em> الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, … More

Porichis, F., Hart, M. G., Zupkosky, J., Barblu, L., Kaufmann, D. E. In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function. J. Vis. Exp. (80), e50821, doi:10.3791/50821 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter