Summary
우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.
Abstract
T 세포 고갈은 만성 바이러스 감염 동안 실패 병원체 정리의 주요 요인이다. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로는이 지속적인 항원 노출에 상향 조절 및 확산의 손실 감소 세포 용해 기능에 기여하고, CD4와 CD8 T 세포에 의해 사이토 카인의 생산을 손상됩니다. LCMV 감염의 뮤린 모델에서 T 세포 반응을 증강 이러한 두 경로에 대한 항체를 블로킹 투여. 그러나, 사람의 샘플에서 세포의 사이토 카인 분비와 같은 차단의 효과를 측정하는 시험 관내 분석은 현재 존재하지 않는다. 우리의 프로토콜과 실험 방법은 정확하고 효율적으로 HIV에 감염된 과목에서 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 생산의 복원을 정량화 할 수있게.
여기, 우리는 HIV 특정 CD4 T 세포와 다른 CEL에 미치는 영향에 의해 사이토 카인의 분비를 측정 할 수있는 시험 관내 실험 설계를 묘사L의 부분 집합. CD8 T 세포는 전혈로부터 고갈시키고, 잔존 된 PBMC는 피콜 분리 방법을 통해 분리 하였다. CD8 고갈 된 PBMC는 다음 HIV-1 개그 펩타이드 수영장 자극 한 후, 세포를 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양하고, PD-L1 및 / 또는 IL-10Rα에 대한 항체를 차단하고 함께 배양 하였다. 48 시간, 상층 액 구슬의 배열 및 세포 펠렛에 의해 사이토 카인 분석을 위해 수집 한 후 QRT-PCR을 이용하여 세포 계측법 또는 전사 분석 흐름을 이용하여 표현형 분석도 수집했다. 더 자세한 분석을 위해, 서로 다른 세포 집단이 된 PBMC에서 선택적 집합 고갈 또는 같은 분석에서 평가되기 전에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬을 얻을 수 있었다. 이들 방법은 항원 특이적인 T-헬퍼 세포에 의해 시토 킨 생산의 조절을 결정하고, 면역 세포의 개체군 간의 기능적 상호 작용을 결정하는 매우 민감하고 구체적인 방법을 제공한다.
Introduction
영구 바이러스 감염 동안 바이러스의 특정 T-세포는 T 세포의 고갈로 알려진 과정에서 기능적 결함을 취득. 초기 만성 바이러스 감염의 쥐 LCMV 모델에서 생체 내 연구에 지쳐 바이러스 특정 T 세포는 바이러스 성 감염 세포에 대한 세포 용해 기능을 감소 증식 할 수있는 능력을 잃게하고 IL-2, TNF-와 같은 사이토 카인을 생산하는 능력을 감소 한 것으로 나타났다 α 1,2를 IFN-γ는. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로의 복잡한 네트워크는 만성 감염시 상향 조절 및 (3,4 검토) T 세포 기능 장애에 기여하고 있습니다.에서 LCMV 마우스에이 억제 경로에 대한 항체를 차단 생체 관리 모델은 T 세포 고갈 (5 검토) 부분적으로 가역적 인 현상임을 나타내는 소진 바이러스 특정 T 세포의 기능 및 향상된 바이러스 제거를 복원.
일에 발견전자 LCMV 모델은 신속하게 HBV, HCV와 HIV 5와 같은 인간의 만성 바이러스 성 감염으로 확장되었다. 만성 HIV-1 감염, PD-1과 IL-10 경로는 감염된 과목에서 상향 조절하고 CD4와 반대로 바이러스 부하와 직접, 질병의 진행의 매개 변수와 상관 관계가 6-8을 계산합니다. LCMV 마우스 모델과 비슷, 인간의 T 세포 고갈이 부분적으로 가역적 인 현상, 나타내는 HIV 특정 CD4와 CD8 T 세포의 체외 복원 증식 PD-1, IL-10 경로의 항체 봉쇄. 그러나, 섬세한 인간의 샘플에 대한 실험의 성격뿐만 아니라 체외 분석, 이러한 개입에 의해 달성되는 기능 복원 프로필의 철저한 조사의 감도의 한계로 인해 막히게 결석. 대량 살상 무기 확산의 분석은, 지금까지 대부분의 연구에서 시험 만 신뢰할 수있는 시험 관내 분석했습니다, 그러나이 상호의 영향에 대한 증거의 놀라운 부족하다에 ventions : 세포 독성 T 세포의 1) 살상 능력, 2) 바이러스 복제에 대한 T 세포의 항 바이러스 효과, 3) 사이토 카인 분비 프로필 및 다른 세포 서브셋에 CD4 T 세포 도움에 4) 효과.
세포 내 사이토 카인 염색법 (ICS)는 매우 유용하고 널리 사용되는 유동 마우스 및 인간 모두에서 다양한 종류의 세포에서 사이토 카인의 생산을 검출하는 데 사용되는 기초 세포 계측법 분석이다. 또한 억제 경로의 항체 봉쇄의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. ICS 내 분석, 사이토 카인 분비는 Brefeldin 및 / 또는 모 넨신의 첨가에 의해 차단된다. 세포 안에 갇혀 사이토 카인은 다음 다색 유동 세포 계측법을 사용하여 형광 항체로 검출된다. 일반적으로 항원 첨가 2 시간 이내에 첨가 Brefeldin 및 모 넨신, 모두 세포에 독성 때문에 분석의 기간은 일반적으로 항원 자극 후 10 또는 12 시간으로 제한된다. ICS 분석에 유용 내가되었습니다 강력한 기술이다N 세포를 항체에 노출 후 15 시간의 특정 기간 후에 압축 해제 된 마우스에서 항체 개입 차단의 생체 내 투여의 효과의 조사. 그러나, 인간의 샘플에서 억제 수용체의 봉쇄의 영향을 평가하는이 실험 방법의 응용 프로그램에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 체외에서 10 또는 12 시간 자극 (인간 샘플 전형적 케이스)의 억제 경로의 항체 중재를 수행 할 때 표준 ICS 분석법에 의해 측정 한, 대부분의 경우에 억제 수용체의 봉쇄가 항원 특이적인 T 세포 응답의 주파수를 변경하지 않는다 6, 7. 평균 또는 평균 형광 강도로 측정 한 셀 당 사이토 카인 생산의 측정은 일치하지 않는 결과 6, 7, 10을 받고 있습니다. 한편, ICS는 이후 늦은 시점에서 수행 될 때 자극 (즉 육일), 사이토 카인 분비 C의 개수의 변화ELL 학생은 관찰 할 수있다. 차이가 변경된 증식, 생존, 그리고 6시 지정된 기간 동안 축적 이펙터 기능의 변화의 결합 된 효과입니다. 부분적으로 이러한 한계를 극복하기위한 한 가지 방법은 증식이 발생하기를 기다리지 않고 사이토 카인 분비 차단제의 첨가 전에 항원으로 오랜 기간 (예를 들면 36 시간, 60 시간, 등.) 동안 배양한다. 우리는 성공적 HIV 특정 CD4 및 CD8 T 세포 11,12 의해 사이토 카인 분비의 동력학을 결정하기 위해이 방법을 사용하고 있으나,이 방법은 작은 반응을 검출 할 수없고, 전체 사이토 카인 분비가 발생의 통합 결과를주지 않을 것이다 자극입니다. 따라서, ICS가 supernatan에서 사이토 카인의 mRNA 정량 또는 사이토 카인 분비의 측정에 비해 활성화 된 T 세포에 의해 생산 된 사이토 카인의 양에 억제 경로의 봉쇄의 영향을 검출하는 방법에 충분히 민감 아니다같은 시간 지점에서 t. 또한, 활성화 된 T 세포에 의해 생성되는 사이토 카인의 대부분이 긍정적이거나 부정적인 피드백에 기여에 의해 분비 방식으로 행동은 항원 제시 세포와의 상호 작용을 반복합니다. 따라서, ICS 분석 중에 Brefeldin 또는 모 넨신 첨가는 사이토 카인 분비를 방지하고, 따라서 T 세포의 자극은 최적이 아니다. 마지막으로, ICS 여러 사이토 카인의 검출은 유동 세포 계측법과 사이토 카인의 검출뿐만 아니라 특정 패널에 동시에 사용할 수있는 형광 색소의 수에 제약 조건에 대한 가용성과 항체의 감도에 의해 제한됩니다.
우리는 세포 (장갑차) 및 자연 살해 세포 (NK 세포)를 항원 제시하는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의해 사이토 카인 분비를 조절하고 이후 CD4 도움말에서 면역 조절 경로의 영향을 평가하는 매우 중요한 생체 외 실험 방법을 개발했다. 이 방법은 또한 IMPA을 평가할 수있다PBMC를에서 CD4 T 세포를 파괴하거나 만 CD8 T 세포에 의해 인식되는 최적의 펩티드로 자극하여 CD8 T 세포의 기능에 억제 분자의 봉쇄 CT. 2) 넓은 패널을 조사 1) 제조 사이토킨 수준의 더 정확한 정량화를 수행 세포 내 사이토 카인 염색법 어 세이는 달리, 우리는 행 수 있도록하기 위해 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인의 분비를 방해하지 않기로 사이토 카인 또는 이펙터 분자, 3) 다른 세포 서브셋에 HIV 특정 CD4 T 세포에 의해 생산 된 사이토 카인의 영향을 평가. 우리는 관심의 면역 조절 경로에 대한 항체를 차단 존재 HIV-1 개그 펩티드 풀과 CD8 고갈 된 PBMC를 자극한다. 배양, 보통 48 시간 원하는 시간 후, 우리는 비드 어레이와 사이토 카인의 분비를 측정하고 다른 세포 부분 집합의 표현형 분석을 위해 또는 전사 분석을위한 하나 세포 펠렛을 수집하는 상층 액을 수집합니다. 의 t에서,주의그의 48 시간 시점, 우리는 T 세포 (12) 증식의 중요한 인구를 감지하지 않습니다. 이것은 유연한 접근이며,이 설계의 여러 가지 다른 적응 가설을 해결하기 위해 적용될 수있다. 예를 들어, (예 등 HIV 특정 CD4 T 세포 또는 PD-1 높은 CD4 T 세포, 등.) 개별 셀의 부분 집합은 상층 액과 세포 펠렛을 수집 한 다음 36 시간 동안 추가 배양하기 전에 배양 12 시간 후 정렬 할 수 있습니다 더 구체적으로 된 PBMC의 정의 모집단에 의한 사이토 카인 분비에 봉쇄 개입의 영향을 조사한다.
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Protocol
1. 피콜 분리를 통해 고갈 된 PBMC의 분리
- 전체 혈액의 50 μL / ㎖에서 인간 CD8 + 공핍 칵테일을 첨가하여 CD8 + T 세포를 고갈.
- 잘 섞어 실온 (18-25 ℃)에서 20 분 동안 품어.
- 배양 후, (칼슘 + 마그네슘 또는 2 +없이 행크의 균형 소금 솔루션) HBSS로 전체 혈액을 혼합 Histopaque을 통해 계층. 30 분 (노 브레이크, 느린 가속) 340 RCF에 스핀.
- PBMC를 수집하고 새로운 50 ML 원뿔로 전송할 수 있습니다. 340 RCF에서 10 분 동안 회전시켜 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 %의 HEPES와 보충 45 ML의 RPMI 1640 워시 2 배.
2. 항체 봉쇄 및 세포의 항원 특이적인 자극
- 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 % HEPES와 보충 10 % 인간 혈청이 포함 된 RPMI 1640 상태 당 2 × 6에서 재현 탁 세포,조건 당 500 μL를 차지한다.
- FACS 튜브 당 세포 현탁액의 나누어지는 500 μL.
- 조사 경로에 따라, PD-L1, 10 ㎍ / ml로 항체 및 / 또는 이소 컨트롤을 차단하는 IL-10Rα를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 15 분 동안 품어.
- 1 ㎍ / ㎖ / 펩타이드 최종 농도에서 HIV-1 개그 펩티드 풀과 세포를 자극한다. 또한 각각의 차단 상태에 대해 "자극 없음"컨트롤을 포함. 37 ° C, 48 시간 동안 5 % CO 2에서 배양한다.
3. 수집 및 상층의 분석
- 48 시간 후, 340 RCF에서 7 분 동안 FACS 튜브를 스핀 다운.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 루미 넥스 비드 배열의 에펜 도르프 튜브에 2 × 225 ㎕의 상층 액을 수집합니다.
- 0.05 % PBS-트윈 (Tween)의 최종 농도를 제공하기 위해 25 ㎕의 0.5 % PBS-트윈 (Tween)으로 수집 된 상청액에서 바이러스를 비활성화.
- IMMED하지 스토어 수집 상층 액iately -80 ° C 냉동고에 사용됩니다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 밀리 포어 루미 넥스 키트를 사용하여 원하는 사이토 카인 농도를 측정한다.
4. 유동 세포 계측법을 통해 수집 및 세포의 표현형 분석
- 상층 액을 수집 한 후, 3 ㎖ PBS로 세포를 씻어. 340 RCF에서 7 분 동안 세포를 스핀 과잉 세척을 가만히 따르다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 고칠 / 라이브 죽은 세포 얼룩 키트를 사용하여 생존을위한 얼룩.
- 340 RCF에서 4 ℃에서 12 분 동안 PBS에 세포를 씻으십시오 100 ㎕의 PBS 1 % FBS에 재현 탁.
- 의 FcR 시약과 혼합하는 소용돌이를 차단의 1.4 μl를 추가하여 단핵구 또는 다른 항원 제시 세포, 블록의 Fc 수용체 발현이 관찰합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 품어
- 표면 항체, 소용돌이를 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
- , PBS 1 % FBS로 세포를 씻어 초과 세척을 가만히 따르다, 200 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 품다어둠 속에서 20 분 동안 실온에서.
- 250 ㎕의 PBS 1 % FBS에서 PBS 1 % FBS,에 resuspend로 세포를 씻어 흐름 cytometer multilaser에 취득 (예 : BD LSRII 또는 Fortessa).
5. QRT-PCR을 통해 세포의 분석
- 세포에 대한 유동 세포 계측법을 통해 분석되지 : 상층 액을 수집 한 후, 1 % 베타 - 머 캅토 에탄올을 포함하는 300 ㎕의 키아 버퍼 RLT의 세포를 Lyse. 프로토콜을 계속하지 않으면 세포는이 시점 후 -80 ° C에서 고정 할 수 있습니다.
- 제조 업체의 프로토콜을 다음 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
- 제조 업체의 프로토콜을 다음 cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성.
- SYBR 녹색 기술을 사용하여 정량 PCR을 수행합니다.
- 10의 최종 농도가 물없는 클레아하는 프라이머를 추가로 하우스 키핑 유전자 (예 : IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH)을 포함하여 사용되는 각 프라이머 프라이머 믹스를 만들기μM. 얼음에 보관하십시오.
- 물론 10.5 μL의 nuclease가없는 물, 12.5 μL의 SYBR 녹색, 접시 당 1 μL 프라이머 믹스를 추가하여 각각의 프라이머에 대한 마스터 믹스를 만듭니다. 얼음에 보관하십시오.
- 사용되는 플레이트의 각 웰에 피펫 24 μL 마스터 믹스.
- 템플릿에 따라 각도에 1 μL의 cDNA를 추가.
- 800 RCF에서 3 분 동안 우물과 원심 분리 판을 모자.
- QRT-PCR 기계, 예를 들어 스트라 타진 MX3005P 악기 판을 실행합니다.
6. 48 시간에 세포 내 사이토 카인 염색법에 대한 적응
Brefeldin와 모 넨신 이전의 세포 내 사이토 카인 염색법에 6 시간을 추가합니다. 모 넨신은 제조업체의 지시에 따라 첨가되는 동안 Brefeldin은 10 ㎍ / ㎖의 농도로 첨가된다. 편의상 Brefeldin은 5 ㎍ / ㎖의 농도로 염색하기 전에 12 시간을 추가 할 수있다.
- 표면의 얼룩 후,에 대한 PBS 1 % FBS와 얼룩 세포를 씻어이러한 IL-12, IFN-γ, 및 고정 / Permeabilization 솔루션 키트 및 프로토콜을 사용하여 TNF-α와 같은 사이토 카인 tracellular.
- 250 ㎕의 PBS 1 % FBS에서 세포에 resuspend을 세척하고, (예를 들어, BD의 LSR II 또는 Fortessa) 유동 세포 multilaser에서 실행됩니다.
7. 셀 정렬에 대한 적응
- 생존을위한 자극, 염색 후 16 시간은 제조 업체의 프로토콜에 따라 LIVE / DEAD 고칠 죽은 세포 얼룩 키트를 사용. 전체 절차를 수행하는 동안 얼음에 세포를 보관하십시오.
- 340 RCF에서 4 ℃에서 12 분 동안 PBS로 세포를 씻어 100 ㎕의 PBS 1 % FBS에 재현 탁.
- 혼합 표면 항체, 소용돌이를 추가하고 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 세포를 배양한다.
- 340 RCF에서 4 ° C에서 PBS 1 % FBS와 세포를 세척하고 500 μL에 재현 탁은 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 차가운 RPMI 1640 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 %로 보충 HEPES.
- 5 ㎖ 폴리스티렌을 사용하여 필터 세포셀 스트레이너 캡 르네 둥근 바닥 관.
- 태아 혈청 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 각 튜브에 1 % HEPES와 보충 10 %가 포함 된 200 μL의 RPMI 1640에 추가하여 정렬에 수집 튜브를 준비합니다. 정렬하는 동안 얼음에 모든 튜브를 유지합니다.
- 라이브 악기 생물학적 위험 물질에 장착 된 시설에 위치 (예 : BD FACS 아리아 II)에 대한 관심의 세포 부분 집합을 정렬 할 수 있습니다.
- 세포가 분류 한 후, 다시 시간이 원하는 양에 대한 보육 및 상층 액을 수집 / 루미 넥스 분석 및 세포 펠렛 수집 / PCR 분석을 수행 장소 세포.
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Representative Results
이 시험 관내 시스템을 사용하여 사이토 카인을 측정 할 때, 자극 제어 명에 비해 항원 특이적인 반응을 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 일반적으로, 우리는 자극 제어하는 분석의 선형 범위 내에서 있었다 없음에 비해 사이토 카인 수준의 최소 3 배 증가를 제공 항원 자극의 값으로 긍정적 인 반응을 고려했다. 우리는 약한 항원 특이 CD4 T 세포 반응을 관찰하기 위해 우리를있게, 0.16 PG / ㎖의 낮은 사이토 카인의 농도를 검출 할 수있는 고감도 비드 어레이 분석을 사용하고 있습니다. 샘플이 정확한 값을 얻을 수 있습니다 확인하기 위해 중복으로 실행됩니다. 그림 2A는 IFN-γ의 생산, 분석이 더 자극에 비해 800 배 증가의 평균을 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 이 값은없는 자극에 비해 같은 IL-13 및 IL-2로 인해 그들 중 일부에 대한 검사를 사이토 카인, 낮은 값에 따라 달라집니다관찰 될 수있다. 비슷한 접근 방식은 다양한 사이토 카인 시험의 mRNA 전사 프로파일에 적용됩니다. 그림 2b는 자극 후 (이상 3 배) 크게 증가 IFN-γ에 대한 mRNA의 수준을 보여줍니다. 이 분석으로 IFN-γ 단백질 분비 및 IFN-γ mRNA 수준 (그림 2C) 사이에 강한 상관 관계가있다. 우리는 HIV 특정 CD4 T 세포의 기능을 연구하는이 체외 접근 방식을 개발하더라도, 우리는 성공적으로, PD-L1 및 / 또는 SEB와 자극 후 CD4 T 세포 반응에서 IL-10Rα 봉쇄의 영향을 평가하기 위해이 방법을 사용했습니다 anti-CD3/CD28, CMV 파쇄물 및 결핵균의 RD-1 펩타이드 (데이터는 미도시). 이 방법은 백신 유도 응답, 동일하게. 그림 2D는 HIV-개그와 자극이 큰 IFN-γ의 분비 결과를 보여줍니다 포함하여 세균의 항원에 대한 반응을 평가하는 데 사용할 수있는 동안 파상풍 toxoi와 자극높은 IL-13 분비 D 결과, HIV 및 파상풍 특정 CD4 T 세포 반응의 다른 사이토킨 프로파일을 보여주는.
이 분석의 가장 큰 강점은 ICS와 같은 다른 생체 분석에 의해 감지되지 않습니다 억제 경로의 항체 조작 후 사이토 카인 분비의 차이를 감지 할 수있는 기능입니다. 이 상등액에서 측정이 잠재적으로 생산 사이토킨 수준을 과소 평가할 수 있도록 예컨대 IL-2와 같은 일부 사이토킨은, 세포에 의해 소비 될 수 있음을 주목해야한다. 이러한 이유로, 항체 봉쇄 후에 관찰 사이토 카인 분비에 어떠한 차이도 관찰 된 차이의 변화에 기인하는지 여부를 평가하는 mRNA의 수준으로 확인되어야 세포 생산 당.도 3a는 IFN에 대한 PD-L1 차단 항체의 영향을 보여준다 -γ 동족 항원 자극의 48 시간 후 HIV 특정 CD4 T 세포에 의해 IL-2 분비. PD-1 경로의 차단은 일반적으로하지 않습니다세포가 HIV-1 개그 펩티드 풀로 자극 할 때 항원 자극없이 사이토 카인 분비에 큰 영향하지만 IFN-γ와 IL-2 분비를 향상시킵니다. CD3 세포가 된 PBMC에서 고갈 될 때, IFN-γ와 IL-2의 분비는 HIV 특정 CD4 T에 대한 응답으로 유도되는 것을 나타내는 자극 (그림 3B)를 항원에 반응하여 생산에는 IFN-γ 또는 IL-2는 없다 세포 항원 특이 자극. 이러한 IL-21 등의 일부 사이토 카인의 경우, 비드 어레이의 감도는 HIV 약한 항원 반응 후 단백질 수준의 검출을 허용하지 않습니다. 이러한 사이토 카인의 경우, mRNA의 정량은 12 대신 수행 할 수 있습니다.
이러한 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 일부 사이토킨은 세포 아형의 다양성에 의해 제조 할 수있다. CD8-고갈 된 PBMC에서 실험을 수행 할 때, 단백질 분비의 소스 identfy 때로는 곤란하고, 따라서, 셀의 서브 세트를 식별하기 어려운 것을 respon억제 분자의 봉쇄 공격 한. 우리는 자신의 표현형 특성에 따라 다른 세포 서브 세트를 정렬하여 사이토 카인 분비의 억제 분자를 차단의 영향보다 철저한 조사를 수행하는이 방법의 변형을 개발 한 이러한 이유로. 4 IFN에서 PD-1 봉쇄의 영향을 보여준다 -γ 정렬 CD4 T 세포에 의해 분비 및 IL-2. 이 실험을 위해, CD8-고갈 된 PBMC는 차단 PD-L1 항체 또는 이소 타입 컨트롤의 존재하에 12 시간 동안 자극 하였다. 12 시간 후, 세포는 형광 항체 및 CD4 T 세포 표면 염색은 셀 소터 플로우 사이토 미터를 사용하여 정렬 하였다되었습니다. 우선 CD4 T 세포는 그 다음 36 시간 동안 추가로 배양하고, 사이토 카인은 전술 한 바와 같이 비드 어레이를 이용하여 상등액에서 측정 하였다. 우리는 성공적으로 PD-1 표현의 수준에 따라 CD4 T 세포를 정렬하기 위해 과거에이 방법을 사용하고 PD-L1 봉쇄는 HIV-SP의 기능을 복원 할 수있는 것으로 나타났습니다 PD-1 12의 높은 수준을 표현 ecific CD4 T 세포.
HIV 감염의 지배 T 세포 기능으로 식별 면역 경로의 수가 지속적으로 증가하고있다. 우리는 성공적으로 HIV-1 특이 CD4 T 세포 8,13에 의한 IFN-γ와 IL-2 분비에 IL-10 봉쇄의 영향을 보여주기 위해 과거에이 분석을 사용했다. 이 방법의 장점 중 하나는 면역 분자는 항원 제시 세포와 HIV 특정 CD4 T 세포 (장갑차)의 상호 작용을 조절하는 방법을 평가하기위한 용량이다.도 5a부터 IL-12 분비를 복원에 대한 IL-10 봉쇄의 영향을 보여준다 항원 제시 세포. 이 기술의 적응으로, 자극 후 48 시간에서 ICS를 수행하여, 우리는 단핵 세포는 HIV-1 개그 펩티드 풀 (그림 5B)와 자극 후 IL-12의 기본 소스 것을 보여줄 수 있었다.
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그림 1. HIV에 감염된 과목에서 방법론. 고립 CD8 고갈 된 PBMC의 도식 표현은 15 분 이소 제어 항체 또는 PD-L1 또는 IL-10Rα에 대한 항체를 차단하거나 배양된다. HIV-1 개그 펩타이드 수영장과 48 시간 자극 한 후, 상층 액을 비드 어레이 및 세포 펠렛과 사이토 카인 분비의 측정을 위해 수집은 유동 세포 계측법 또는 QRT-PCR을 이용하여 mRNA 수준의 전사 분석하여 표현형 분석을 위해 하나를 수집하고 있습니다.
그림 2. 의 mRNA 또는 단백질 분비 항원 특이적인 T 세포 반응을 검출. A : HIV-1 개그 펩티드 풀과 자극 CD8 고갈 된 PBMC. IFN-γ의 분비가 자극 후 48 시간에서 측정 하였다 B :. IFN-γ mRNA 수준자극 후 48 시간에 세포 펠렛에 QRT-PCR로 측정되었다 C :. IFN-γ mRNA 수준과 상층 액에서 IFN-γ 농도의 상관 관계. D :. IFN-γ와 HIV-1 개그 펩타이드 풀 또는 파상풍 톡소이드로 자극 CD8 고갈 된 PBMC를 사이에 IL-13 단백질 수준의 비교는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. . 억제 경로의 조작 후 사이토 카인 분비의 변화는 CD4 T 세포에 의존하고 B : CD8 고갈 또는 CD3 고갈 된 PBMC는 이소 제어 또는 PD-L1 차단 항체의 존재 HIV-1 개그 펩티드 풀과 자극. IFN-γ와 IL-2의 분비는 자극 후 48 시간에 측정 하였다.
그림 4. PD-1 봉쇄 조작 후에 사이토 카인 분비를 감지하는 CD4 T 세포를 선별. AB : 세 만성 감염, 치료 과목에서 CD8 고갈 된 PBMC는 HIV-1 개그 펩티드 풀과 배양 또는 이소 제어 또는 PD-L1 차단 항체의 존재에 12 시간 동안 비자극 남았다. CD4 T 세포는 그 다음에 부정적인 림프구에 리니지 배제에 의해 선택하고 36 시간 동안 추가 배양 하였다.
그림 5. CD4 T 세포와 항원 제시 세포 사이의 상호 작용. A : CD8 고갈 된 PBMC는 이소 제어 또는 IL-10Rα 차단 항체의 존재 HIV-1 개그 펩티드 풀을 자극했다. . 상층 액에서 IL-12 수준은 자극 B 후 48 시간에 측정 하였다 :CD8 고갈 된 PBMC는 HIV-1 개그 펩티드 풀과 자극. 단핵구에 대한 IL-12 분비를 자극 후 48 시간에서 ICS로 측정 하였다.
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Discussion
뜨는 컬렉션이 실험 설계의 필수적인 부분입니다. 루미 넥스 분석을위한 상층 액을 수확하면, 분액 만들어주기 - 해동 동결에 의한 단백질 분해를 방지하기 위해 -80 ° C에 보관 하였다. 냉동과 해동 단백질 및 동결 해빙을 최소화하여 가혹한 과정이 될 수 있습니다, 신호 분석에 극대화 될 것입니다. 따라서, 동일한 횟수를 동결 - 해동 된 분액에서 작업 할 때 반복 가능하고보다 정확한 데이터를 구하는 것이 용이하다.
우리는 이전에 HIV-개그 펩티드 풀 (12)와 자극 후 사이토 카인의 분비와 mRNA 수준의 운동 분석을 수행했습니다. 이러한 동역학에 기초하여, 우리는 시토 킨 분비 측정을 수행하기 위해 48 시간 시점을 선택했다. mRNA와 단백질의 분비뿐만 아니라 다른 자극 사이에 관찰 된 차이를 감안할 때, 그것은 연구자들은 자극에 따라 자신의 운동 분석을 수행하는 것이 필수적입니다그들은 mRNA 발현 또는 단백질의 사이토 카인 분비를 측정되는지 여부 및 사용.
셀의 서브 세트는 (도 3에 도시 된 방식을 사용하여) 우선되는 경우는 우선 세포 수에 따른 배양의 볼륨을 조절하는 것이 중요하다. 표준 분석에서, 우리는 일반적으로 매체의 500 μL에 100 만 CD8 고갈 된 PBMC를 품어. 우리는 이러한 종류의 CD4 T 세포와 같은 하위 집합을, 세포 그러나, 우리는 일반적으로 10 만 셀을 정렬 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 세포를 희석부터 계속하고 비드 어레이와 검출 가능한 사이토 카인 농도를 달성하기 위해서는 200 μL로 매체의 부피를 감소시킨다. 각각의 실험을 위해, 세포 배양의 체적은 실험적 고려 세포 유형, 세포 수는 우선, 또한 사이토 카인, 및 검출 키트의 민감도를 가지고, 테스트되어야한다.
루미 넥스 어 세이를 수행하는 또 다른 중요한 측면은 바이러스이다 inactivati에. 바이러스는 안전하게 악기 샘플을 실행할 수 있도록 불 활성화 될 필요가있다. 트윈 -20이 이유로 사용되었다. 이전에는, 다른 세제는이 목적을 위해 시험되었다. 0.5 % 트윈, 5 ~ 10 % 트리톤 및 세척 버퍼의 다양한 희석 HIV에 감염된 세포에 첨가하고 noninactivated 세포에 대한 테스트되었습니다. 트윈 수행 분석과 최소한의 간섭하면서 최고의 바이러스를 불 활성화하는 것으로 확인되었다.
유세포 분석을 수행 할 때, 단구에 대한 오염성 필수적인 단계는 모노클로 날 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 된 Fc 시약의 Fc 수용체를 차단하기위한 것이다. 의 Fc 수용체는 항원 제시 세포의 표면에 존재하고, 항체의 Fc 부위에 결합한다. 이 수용체는 염색 전에 차단되지 않은 경우, 특정 마커를 대상으로 추가 된 단일 클론 항체 대신 그러므로 거짓 긍정적 인 결과를 제공,이 수용체에 결합 할 수 있습니다. 이는 분석시 피하기 위해 특히 중요이 수용체를 차단하지으로, 특정 세포 유형에서 파생되는 사이토 카인은 결과에 해가 될 수 있습니다. 인간 혈청을 포함하는 배지에서 배양 한 세포는 또한 구단 수용체에 결합 혈청에서 IgG의 풍부한 양이 있기 때문에,이 문제에 도움이 될 수 있습니다.
루미 넥스 분석은 ICS의 분석보다 더 민감 감지 할 수 있지만, 이러한 IL-21 또는 퍼포 같은 특정 이펙터 분자는 여전히이 방법으로 감지하기가 어렵습니다. 이 체외 접근 방식은 다른 이펙터 분자를 검출의 민감도를 제공 QRT-PCR을 이용하여 전사 분석 할 수 있습니다.
우리의 실험 방법의 한 가지 제한이 관심의 사이토 카인이 전체 PBMC를 또는 CD8 고갈 된 PBMC에 존재하는 백혈구의 유형이 혼합에서 다른 세포의 부분 집합에 의해 생성 될 때 그 결과의 해석이 곤란하다. 예를 들어, 이는 다른 세포 TY에서 상향 조절되는 사이토 카인 IL-10의 경우와진보적 인 HIV 질환 (8)의 설정에서 PES. 상층 액의 추가 배양 및 수집하기 전에 그 인구의 정렬은 우리가 성공적으로이 맥락에서 사용하고 다른 접근 방식이다.
요약하면, 본 논문에서 제시 한 기술은 PD-L1과 IL-10 면역 조절 경로의 차단의 존재에 HIV 특정 CD4 또는 CD8 T 세포에 의한 사이토 카인 생산의 회복을 측정하는 신뢰할 수있는 수단을 제공합니다. 이러한 기술은 사이토킨은 유동 세포 계측법에 의해 검출이 용이하지 않은 경우에 적용 할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 항 PD-L1 차단 항체를 제공 고든 프리먼 감사합니다. 우리는 매사 추세 츠 종합 병원이 프로젝트에 자신의 귀중한 역할에 대한 모든 연구 참가자의 임상 및 실험실 직원을 감사드립니다.
국립 심장 폐 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소 (RO1 HL-092565, DEK)이 연구는 알레르기의 국립 연구소와 국립 보건원 (DEK PO1 AI-080192)의 전염병에 의해 지원되었다. DEK는 퀘벡 건강 연구 기금의 연구 학술 경력 수상 (FRQS)에 의해 지원된다. FP는 연구와 하버드 글로벌 건강 연구소 (HGHI)에 매사 추세 츠 종합 병원 집행위원회의 화목 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
References
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