Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.
Abstract
שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.
Introduction
תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA.
תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב '), ומולקולות RNA 1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה 2.
חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5'-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a 3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות שאושר על ידי המועצה לביקורת האתית של לאוואל.
1. הכנת תרביות תאים ומניפולציה המוח
- תאי יונקים ודרוזופילה
- לגדול הלה תאי סרטן צוואר הרחם ותאים עובריים שניידר דרוזופילה כמומלץ על ידי התרבות האמריקנית אוסף סוג. עבודה עם תאים במעבר נמוך.
- פלייט תאים כדי להגיע למפגש 80% היום של הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ~ 12 x 10 6 תאים לכל תנאי ניסוי. לפני קבלת תמציות לניתוח polysome, לעורר תרגום על ידי הוספה בינונית מלא טרי לפחות 90 דקות.
- בידוד מוח: לבודד את המוח מעכברים בגילים שבין 9 ו16 ימים לאחר לידה. המתת חסד כרוך משאיפת CO 2 אחרי הרדמה ונקע בצוואר הרחם. בעקבות הקרבה, לבודד את המוח כולו וגם מקום שאניt ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות להעביר אותו לקר PBS 1X לשימוש מיידי.
2. מערכת ההיפוך החלוקה Gradient הכנת הצפיפות
- שטוף את מערכת צינורות עם 0.1% SDS למשך 5 דקות.
- שטוף את מערכת צינורות עם אתנול 70% למשך 5 דקות, ולאחר מכן עם RNaseZAP פתרון עבור 5 דקות לפני שטיפה עם מים DEPC.
- משאבת אוויר כדי לייבש את מערכת צינורות של המנגנון.
3. הכנת עירובי סוכרוז
- הפוך את פתרונות סוכרוז 15% ו55% ב20 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 1.25 מ"מ MgCl 2, 150 mM NaCl, ו1 מ"מ DTT.
- ליצור 15-55% שיפוע סוכרוז ליניארי באמצעות ISCO דגם 160 שיפוע לשעבר, כפי שתוארו על ידי הוראות היצרן. עם זאת, חשוב לשלוט גם על מהירות משאבת peristaltic טריס על מנת למנוע יצירה של בועות או מערבולות בהדרגות. שמור הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- במהלך הזמן שבו תכנית יצרנית השיפוע פועלת, לקרר את ultracentrifuge עד 4 ° C.
4. הכנת נייד ותמציות מוח עכבר
- הכנת תמציות סלולריים
- צלחת מקום (ים) בתאי קרח ולשטוף 3x עם PBS הקר 1X.
- קציר תאים (~ 12 x 10 6) במאגר 1 תמוגה מיליליטר (20 מ"מ טריס-HCl ב-pH 7.4, 1.25 מ"מ MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% P40 Nonidet, 5 מעכב U / מיליליטר RNase, בתוספת עם טבליות מעכבי פרוטאז קוקטייל מלאים מיני ללא EDTA), להעביר אותם לצינור Eppendorf, ומערבבים היטב על ידי העברתם 15x באמצעות מזרק אינסולין U100 1cc 28 G 1/2. בואו lysate התא לנוח על קרח במשך 15 דקות.
- שים כמה טיפות של lysate תא לשקופית להעריך תמוגה הסלולרית על ידי ההתבוננות במיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות מטרת 10X. גרעינים רק צריכים להיות גלויים ולא קרום תא צריך להיות מעיד גלוי לתמוגה תא. כמו שליטה, להתבונןתאי unlysed.
- להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשמור lysate המסיסים המכיל polyribosomes.
- הכנת תמציות מוח עכבר
- Homogenize המוח כולו המבודד (~ מ"ג 500) על ידי 10 משיכות בhomogenizer Dounce קר כקרח עם 2 מיליליטר של חיץ תמוגה ולהבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- טען את supernatant וכתוצאה מכך על כרית של סוכרוז 50% ולהמשיך עם שקיעה לשעה 2 ב 200,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C.
- Resuspend את הכדור השקוף המכיל polyribosomes ב 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בואו שאר ההשעיה על הקרח למשך 30 דקות לפני העמסתי על הדרגות.
5. טוען תמציות על סוכרוז הדרגות וultracentrifugation
- למדוד את הריכוזשל RNA הנמצא בתמצית cytoplasmic באמצעות ספקטרופוטומטר. לאט ובזהירות לטעון ~ 20 OD 260 יחידות של התמצית על גבי שיפוע סוכרוז 15% ל55%. ודא שיש 2-3 מ"מ של שטח פנוי על פני השטח של צינור כדי למנוע גדות הצינורות במהלך צנטריפוגה.
- צנטריפוגה הדרגתיים באמצעות אולטרה צנטריפוגות במשך שעה 2 30 דקות ב 230,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. כאשר מסתיימת צנטריפוגה, להסיר את הצינורות ומניח אותם על קרח בזהירות שלא להפריע את השיפועים.
6. היפוך חלוק של תמציות cytoplasmic לPolysomes פרופיל
- הנח הדרגתיים סוכרוז על מערכת היפוך חלוקה צפיפות אוטומטית ולהמשיך עם חלוקה ואיסוף אוטומטיים של שברים (0.5 מיליליטר כל אחד), כפי שתואר על ידי היצרן.
- לאסוף כל חלק (~ μl 500) לתוך צינורות Eppendorf אדם עם ניטור רציף של הספיגה ב 254 ננומטר. בparallאל של מבצע חלוקה השיפוע, פרופיל polyribosomal יהיה עריכה על נייר התרשים. לחלופין, השתמש ביחידת רכישת נתונים המצורפת למקליט התרשים יש רכישה אלקטרונית של פרופיל polysome.
- בסוף כל סיבוב, להעביר eppendorfs נאסף על קרח יבש. בשלב זה, גם חנות שנאספו שברים ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות משקע מתחמי החלבון-RNA באופן הבא.
7. מיצוי חלבון וניתוח
- לכל שבר שנאסף משיפוע סוכרוז, להוסיף 2 כרכים של 100% אתנול קר ולתת קומפלקסי RNA-חלבון לזרז ב -20 לילה מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה כל משקע RNA-חלבון ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. יבש וresuspend המשקע בחיץ מדגם SDS-PAGE לפני שתמשיך עם כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים (ראה איור 2).
8. RNA חילוץ וnalysis
- משקע מתחמי RNA-חלבון כמו בסעיף 7.1. Resuspend כל משקע RNA-חלבון במאגר תמוגה מכיל 0.1% SDS. לעכל את מרכיב החלבון של המשקע עם 2 מ"ג / מיליליטר proteinase K ל30 דקות באמבט מים C ° 55.
- לחלץ רכיבי RNA של המשקע על ידי הוספת נפח של 1 "פנול: כלורופורם", 2 כרכים של כלורופורם, ו0.1 נפח של 2-pH M NaOAc 4 וצנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. משקע RNA מהשלב וכתוצאה מהמימי של כל דגימת לילה בשעה -20 ° C על ידי הוספת נפח של 1 isopropanol ו0.2 מיקרוגרם / μl של גליקוגן. ספין המשקע עבור שעה 1 ב 10,000 XG ב 4 ° C. שטוף את כדור RNA עם 70% אתנול קר.
- Resuspend את כדור RNA לנפח קטן של מים חופשיים RNAse. להעריך את הכמות ואיכות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאמור, polysome פרופיל מאפשר הניתוח של שינויים של חניכה תרגום בתנאי לחץ. איור 1 היא תצוגה פשוטה של ייזום תרגום אשר כפי שתואר קודם לכן הוא תהליך רב שלבי מעורבים הרכבה מסודרת של מתחמי ייזום תרגום. תחת תנאי גידול רגילים, מתחמי ייזום תרגום מומרים לpolyribosomes גילויו על ידי פרופיל polysome מעיד על חניכה תרגום פעילה (איור 2; שלא טופל). תחת תנאי לחץ לעומת זאת, חניכה תרגום חסומה וכתוצאה מכך ההצטברות של monosomes 80S והפחתה של פסגות polysome (איור 2; מעכב הפרוטאזום).
איור 1. של תצוגת implified חניכה תרגום. חניכה תרגום כוללת מספר שלבים: 1) היווצרות eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכבת משולש, 2) ההתאחדות של המתחם המשולש עם 40S הריבוזומים יוצרים מורכב preinitiation 43s, 3) העמותה של מתחמי 43s עם mRNA יוצרי 48S preinitiation מורכב, 4) סריקת אזור 5'-מתורגם של ה-mRNA על ידי 48S הריבוזומים עד שהוא מגיע ומזהה את קודון אוגוסט הייזום, ו5) גיוס של 60S מקטע ריבוזומלי הגדול ל48S יוצרים המורכב 80S ובשלב זה פוליפפטידים מתחילה סינתזה. כל צעד של חניכה תרגום כרוך בפעילותם של מספר גורמי חניכה תרגום. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
"Width =" upload/51164/51164fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51164/51164fig2.jpg "/> 500px
. איור 2 פרופילי Polysomes וניתוח של polysomes קשורים חלבונים על ידי כתם מערבי בתאי הלה (א - ב). תמציות cytoplasmic הוכנו מתאי הלה גדלו גם בתנאים רגילים (א) או על טיפול עם מעכבי פרוטאזום ל4 שעות (B ) וcentrifuged על 15-55% v / שיפוע סוכרוז ליניארי w. פרופילי Polysomes מסומנים בלוח העליון. עמדותיהם של הריבוזומים 40S, 60S הריבוזומים, monosomes 80S, וpolysomes מצוינות בכל פרופיל. שברים מהחלק העליון (15%) לתחתית (55%) של השיפוע מוצגים משמאל לימין. שברים שנאספו ונותחו על ידי כתם מערבי (פנלים תחתון) עם נוגדנים כנגד חלבון ריבוזומלי L28 הגדול, כמו גם עם FMRP קשורים חלבון polysome המשמשים כבקרים לשלמות polysome 5,6. שים לב שtreatment עם המעכב הפרוטאזום מפחית פסגות polysomes עם עלייה במקביל ב80S monosomes המציין עיכוב של חניכה תרגום. פרופילים אופייניים המתקבלים מתאי שניידר דרוזופילה או מוח עכברים תוארו במקומות אחרים 7-10. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות 9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור 15, וכדי להעריך את ההשפעות של סוגים שונים של לחץ כוללים זיהומים נגיפיים, היפוקסיה 13,16, קרינה 17, ותרופות כימיות 18 משמשים בטיפול, בייזום תרגום. עם זאת, בעוד בטכניקה זו עובדת היטב להעריך חניכה תרגום של תרביות תאים ורקמות ספציפיות, כגון במוח ובכבד, הוא נשאר שיוקם, אם ניתן להשתמש בו כדי להשוות חניכה תרגום של נורמלי לעומת רקמות וגידולים חולים.
שינויים בפרופילי polysome יכולים להתרחש גם בתנאים שמשנים elonga תרגוםtion או סיום. במקרים אלה, העיכוב של שיעורי התארכות של תרגום יוביל לעלייה של פסגות polysomes תוך עיכוב של הפסקה צריך לגרום polysomes הגדול יותר יחסית לשליטה. לעומת זאת, מעכבים של חניכה תרגום למנוע הרפורמציה של polysomes בגלל היווצרות של קומפלקסי ייזום תרגום פעילים חסומה. זה בא לידי ביטוי בפרופילי polysomes על ידי הפחתה של פסגות polysomes עם גידול מקביל של monosomes 80S. בגלל מעכבי תרגום דוכן מתחמי חניכה תרגום, צפוי כי פסגות הן 40S 60S ותהיינה גם להגדיל. עם זאת, לעתים קרובות מאוד עלייה ב80S רק monosomes הוא ציין על עיכוב של חניכה תרגום. הסיבה לכך שהעלייה במתחמי ריבוזומלי האחרים אינה נצפתה כרגע לא ידועה. הסבר אפשרי אחד יכול להיות שקשר מקרי בין מתחמי ריבוזומלי נתקע עלול להתרחש במהלך החילוץ מוביל לaccumula נצפהtion של רק 80S monosomes.
לצד הניתוח של חניכה תרגום, polysome טכניקת פרופיל יכולה לעזור כדי לאשר את זהותם של גורמי חניכה תרגום (כגון eIF4E, eIF4A וeIF4G) ולזהות רגולטורים תרגום רומן. כגורמי חניכה התרגום משתחררים מהריבוזומים בשלב ייזום התרגום האחרון, הם לא צריכים להיות מזוהים על תרגום שברים הריבוזומים. העמותה של חלבונים כגון 14 FMRP, SMN 19,20, TDRD3 21 עם שני polysomes ושברים שאינם polysomes מציינת כי תפקיד הרגולציה של חלבונים אלה בתרגום אינו מוגבל לשלב החניכה. ניטור העמותה של חלבונים עם polysomes גם מהווה אמצעי רב עוצמה להעריך כיצד תנאי לחץ יכולים להשפיע על פעילות translational של חלבונים ספציפיים. עם זאת, הקשר של חלבונים ספציפיים עם polysomes בפני עצמו אינו מספיק כדי להסיק רול translationalדואר, שאז צריך להיות מאושרים על ידי מחקרים פונקציונליים. לבסוף, טכניקת פרופיל polysome מאפשרת קביעה של פעילות translational של mRNAs הספציפי בתנאים שונים, ולבדיקה של מנגנונים ספציפיים המווסתים את התרגום כגון דיכוי translational מירנה תיווך 22. השימוש הכללי של ניתוח polysome ניתן להאריך עוד יותר באמצעות מגוון של יישומים במורד הזרם כוללים ניתוח microarray הגנום ולאחרונה הריבוזום transcriptome בקנה מידת פרופיל 23-26 המאפשר חיזוי חזק של ביטוי חלבון ויותר מכך במתן כלי ניסיוני רב עוצמה חדש לניתוח של שליטת translational 23-27.
כמו בכל מתודולוגיה, אמצעי זהירות יש לנקוט בעת ביצוע אפיון polysome. במובן זה, מספר רב של פרמטרים, כגון מעבר תא, תמוגה תא, כמות תמצית תא שהועמס על השיפוע, ושלמות RNA צריכים להיות גם גontrolled. אופטימיזציה של תנאי ultracentrifugation נדרשה גם על מנת לקבל ההפרדה הטובה ביותר של אוכלוסיית ריבוזומלי דרך הדרגות סוכרוז. רכיבים המהווים את השיפועים ומאגר תמוגה כגון סוכרוז וחומרי ניקוי, עשויים לתת הספיגה באורך גל 254 ננומטר. זה כן חשוב לכלול שיפוע שליטה המכיל מאגר תמוגה בלבד. לבסוף, השיפועים עצמם צריכים להיות מטופלים בזהירות כהפרעה מינימאלית של הדרגתיים יכולה לגרום לתופעות עצומות על פרופילי polysomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הרשות הפלסטינית היא נמען של מלגה "פייר דוראן" בפקולטה לרפואה של האוניברסיטה לאוול. עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (MOP-CG095386) ל RM fractionator polysome נרכש באמצעות קרן קנדית עבור חדשנות מענק (MOP-GF091050) לRMR M מחזיק הפרס משכורת חוקר חדש CIHR.
אנו אסירי תודה לבני זוג. א Khandjian, י Gallouzi, ס 'Di-מרקו וא' Cammas לעצות מועילות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
