Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.
Abstract
Präzise Steuerung der mRNA-Translation ist von grundlegender Bedeutung für die eukaryotische Zelle Homöostase, insbesondere in Antwort auf physiologische und pathologische Stress. Änderungen dieses Programms können das Wachstum von geschädigten Zellen, ein Markenzeichen der Krebsentwicklung oder zu vorzeitigem Zelltod wie bei neurodegenerativen Erkrankungen gesehen führen. Vieles von dem, was bekannt ist über die molekulare Grundlage für die Translationskontrolle ist von Polysomen-Analyse unter Verwendung eines Dichtegradienten Fraktionierung System erhalten. Diese Technik beruht auf der cytoplasmatischen Extrakte Ultrazentrifugation auf einem linearen Sucrose-Gradienten. Sobald der Spinn abgeschlossen ist, kann das System Fraktionierung und Quantifizierung zentrifugiert Zonen entsprechend unterschiedlichen Übersetzungs Ribosomen Populationen, wodurch eine Polysomen-Profil. Änderungen in der Polysomen-Profil sind, die Änderungen oder Fehler in Translationsinitiation, die in Reaktion auf verschiedene Arten von Stress auftreten. Diese Technik ermöglicht auch bewerten, the Rolle von spezifischen Proteinen auf Translations-Initiations-und translationale Aktivität bestimmter mRNAs zu messen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zu Polysomprofile zur Translationsinitiation von eukaryotischen Zellen und Geweben, entweder unter normalen oder Stresswachstumsbedingungen durchführen zu beurteilen.
Introduction
Eukaryotischen Zellen ständig stoßen eine Reihe von physiologischen und schädlichen Umweltstressbedingungen, die eine schnelle Reaktion erfordern adaptive Zelle. Zellstressantwort beinhaltet eine präzise Balance zwischen anti-und pro-Überleben Überleben wirkende Faktoren. Die Störung dieses Gleichgewichts kann irreversible Folgen führend in der Entwicklung der menschlichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Krankheiten. Während der ersten Stufe der Reaktion auf Stress, Zellen zu aktivieren Proüberleben Wege, die die koordinierte Steuerung von Änderungen in der Genexpression auf der Ebene der mRNA-Translation beinhalten.
mRNA-Translation in Eukaryonten ist ein komplexer Prozess, der koordinierte zelluläre Wechselwirkungen zwischen Translationsinitiationsfaktoren (eIFs), spezifische RNA-bindende Proteine (FGE) und RNA-Moleküle 1 beinhaltet. Initiation, Elongation und Termination: mRNA-Translation ist in drei verschiedene Phasen unterteilt. Obwohl alle drei Phasen unterliegen regelRegelungsmechanismen, Mechanismen der Translationskontrolle zielen meist die Anfangsphase der Übersetzung, die auf diese Weise bildet die geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Proteinsynthese 2.
Translation Initiation ist eine hochgeordnete Prozess, der mit der Bildung der eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternären Komplex und die anschließende Bindung an die 40S-Untereinheit Ribosomen, die zur Bildung des Präinitiationskomplexes beginnt. Der nächste Schritt ist die Einstellung der Präinitiationskomplexes an mRNA, die die Aktivität des Translationsinitiationsfaktoren wie eIF4F und eIF3 beinhaltet. Der so gebildete 48S Präinitiationskomplexes erfährt spezifische Konformationsänderungen, die diese Maschinen ermöglichen, scannen, die 5'-untranslatierte Bereich der mRNA, bis er erkennt die Start-Codon August Die meisten der Translationsinitiationsfaktoren werden dann veröffentlicht und 60S-Untereinheiten werden rekrutiert, um eine 80S Ribosomen-Komplex bilden, der Übersetzung, eine kompetentet welchem Punkt beginnt die Proteinsynthese (Abbildung 1). Mehr als ein 80S monosome kann die Übersetzung der mRNA in einer gleichen Zeit produziert so genannte Polysomen (oder Polyribosomen). Die Dichte der Polysomen auf einer mRNA spiegelt die Initiation, Elongation und Terminierungsentgelte und ist somit ein Maß für die Übersetzbarkeit einer bestimmten Transkript. Allerdings ist Polysom Profil hauptsächlich verwendet, um Veränderungen in der mRNA-Translation bei der Einleitung Schritt zu beurteilen. Hier haben wir ein Proteasom-Inhibitor als Translationsinitiationsinhibitor verwendet. Die Behandlung von Krebszellen mit dieser Droge bewirkt eine Stressreaktion, gekennzeichnet durch die Aktivierung der Stresskinase HRI benannt, der die Translationsinitiationsfaktor eIF2a 3 phosphoryliert. Phosphorylierung von eIF2a ist eine der wichtigsten Ereignisse, die zur Inhibition der Translationsinitiation in Säugerzellen 4.
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Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien von Laval Ethical Review Board genehmigt.
1. Herstellung von Zellkulturen und Gehirnmanipulation
- Säuger-und Drosophila-Zellen
- Wachsen HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen und embryonale Zellen Drosophila Schneider wie von der American Type Culture Collection ist. Arbeiten mit Zellen auf einem niedrigen Gang.
- Teller Zellen, um den Tag des Experiments 80% Konfluenz erreichen. Für beste Ergebnisse verwenden ~ 12 x 10 6 Zellen für jede Versuchsbedingung. Vor Extrakte für Polysom Analyse, stimulieren Übersetzung durch Zugabe von frischem Vollmedium für mindestens 90 min.
- Gehirn-Trennung: Isolieren Gehirnen von Mäusen, zwischen 9 und 16 Tage nach der Geburt im Alter. Sterbehilfe beinhaltet CO 2-Inhalation nach der Narkose und Genickbruch. Nach der Tötung, zu isolieren, das ganze Gehirn und entweder den Ort, den icht bei -80 ° C oder direkt übertragen sie in kaltem PBS 1X für den sofortigen Einsatz.
2. Vorbereitung der Dichte Gradient-System Fraktionierung
- Waschen Sie das Schlauchsystem mit 0,1% SDS für 5 min.
- Mit 70% Ethanol für 5 min Waschen Sie das Schlauchsystem, dann mit RNaseZAP Lösung für 5 min vor dem Waschen mit DEPC Wasser.
- Luftpumpe, um das Rohrleitungssystem der Vorrichtung zu trocknen.
3. Vorbereitung der Saccharose-Gradienten
- Machen 15% und 55% Saccharose-Lösungen in 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl und 1 mM DTT.
- Erzeugen die lineare 15-55% Saccharose-Gradienten mit einem Isco Modell 160 Gradientenformer, wie von der Herstelleranleitung beschrieben. Es ist jedoch wichtig, um die Schaffung von Blasen oder Turbulenzen an den Steigungen zu vermeiden und steuern die TRIS Schlauchpumpe Geschwindigkeit. Halten Sie die Gradienten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Während der Zeit, wenn der Gradient Herstellerprogramm ausgeführt wird, kühlen die Ultrazentrifuge auf 4 ° C
4. Herstellung von Zell-und Maus-Gehirn-Extrakte
- Herstellung von Zellextrakten
- Platz Platte (n) auf Eis und Wasch Zellen 3x mit kaltem PBS 1X.
- Ernten der Zellen (~ 12 × 10 6) in 1 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl bei pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNase-Inhibitor ergänzt mit kompletter Mini-EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail Tabletten), übertragen Sie sie auf einem Eppendorf-Röhrchen, und gut mischen, indem man sie durch ein 15x 1cc U100 Insulinspritze 28 G 1/2. Lassen Sie das Zelllysat ruhen auf Eis für 15 min.
- Setzen einige Tropfen Zelllysats auf eine Folie, zelluläre Lyse durch Beobachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung eines 10X-Objektiv beurteilen. Nur Kerne sichtbar sein soll und keine Zellmembranen sichtbar Attesting für Zell-Lyse sein. Als Kontrolle beobachtenlysierten Zellen.
- Klärung des Zelllysats mittels Zentrifugation bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten das lösliche Lysat mit den Polyribosome.
- Vorbereitung der Maus Gehirnextrakten
- Homogenisierung des gesamten Gehirns isoliert (~ 500 mg) durch 10 Hübe in einem eiskalten Dounce-Homogenisator mit 2 ml Lyse-Puffer und Klärung des Homogenats durch Zentrifugation bei 11.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
- Laden des resultierenden Überstands auf ein Kissen aus 50% Saccharose und füllen Sedimentation für 2 Stunden bei 200.000 × g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C.
- Resuspendieren Sie das Pellet, das die schein Polyribosomen in 1 ml Lyse-Puffer und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Suspension Rest auf dem Eis für 30 Minuten, bevor sie auf Steigungen.
5. Einlegen der Auszüge auf Saccharose-Gradienten und Ultrazentrifugation
- Messen Sie die Konzentrationder in der cytoplasmatischen Extrakt mit einem Spektralphotometer vorhandenen RNA. 20 OD 260 Einheiten des Extraktes vorsichtig und langsam laden ~ auf die 15% bis 55% Saccharose-Gradienten. Stellen Sie sicher, dass es 2-3 mm der verfügbaren Raum an der Oberfläche des Rohres zu vermeiden, während der Zentrifugation Überlaufen der Rohre.
- Zentrifugieren der Gradienten unter Verwendung einer Ultrazentrifuge für 2 h 30 min bei 230.000 x g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C. Beim Zentrifugieren endet, entfernen Sie die Rohre und legen sie auf Eis vorsichtig, nicht die Steigungen stören.
6. Fraktionierung von Cytoplasmic Extrakte für Polysomen Profiling
- Zeigen Saccharose-Gradienten auf automatischer Dichte Fraktionierung System und fahren Sie mit Fraktionierung und automatisierte Sammlung von Fraktionen (jeweils 0,5 ml), wie vom Hersteller beschrieben.
- Sammeln jeder Fraktion (~ 500 &mgr; l) in einzelne Eppendorf-Röhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 254 nm auf. In parallel Fraktionierung des Gradienten Betrieb wird der polyribosomal Profil auf dem Diagrammpapier bearbeiten werden. Alternativ können Sie einen Datenerfassungseinheit auf den Schreiber, eine elektronische Erfassung der Polysom Profil befestigt.
- Am Ende jeder Fahrt, Transfer gesammelt Eppendorfs auf Trockeneis. Zu diesem Zeitpunkt entweder Speicher gesammelten Fraktionen bei -80 ° C ausgefällt oder direkt Protein-RNA-Komplexe wie folgt.
7. Proteinextraktion und-analyse
- Zu jeder gesammelten Fraktion der Saccharose-Gradienten, fügen 2 Volumen 100% kaltem Ethanol und lassen RNA-Protein-Komplexe zu fällen bei -20 ° C über Nacht.
- Zentrifuge jeder RNA-Protein-Niederschlag bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und dann Waschen mit 70% Ethanol. Trockene und resuspendieren den Niederschlag in der SDS-PAGE-Probenpuffer, bevor Sie fortfahren mit Western-Blot mit spezifischen Antikörpern (siehe Abbildung 2).
8. RNA-Extraktion und Analyse
- Man fällt RNA-Protein-Komplexe, wie in Abschnitt 7.1. Resuspendieren jeder RNA-Protein-Niederschlag in dem Lysepuffer, enthaltend 0,1% SDS. Verdauen die Proteinkomponente des Niederschlags mit 2 mg / ml Proteinase K für 30 Minuten in einem 55 ° C Wasserbad.
- Extrahieren RNA-Komponenten des Niederschlags durch Zugabe von 1 Volumen "Phenol: Chloroform", 2 Volumina Chloroform und 0,1 Volumen 2 M NaOAc pH 4 und Zentrifugieren bei 10.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Ausfällung von RNA aus der resultierenden wässrigen Phase von jeder Probe über Nacht bei -20 ° C durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol und 0,2 ug / ul Glykogen. Spin der Niederschlag 1 Stunde lang bei 10.000 × g bei 4 ° C. Mit 70% kaltem Ethanol waschen das RNA-Pellet.
- Die RNA-Pellet in einem kleinen Volumen RNAse freies Wasser. Bewerten Sie die Menge und Qualität von RNA mit dem Spektralphotometer.
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Representative Results
Wie zuvor erwähnt, ermöglicht die Polysomen Profil Analyse der Veränderungen der Translationsinitiation unter Stressbedingungen. Fig. 1 ist eine vereinfachte Ansicht, die die Translationsinitiation, wie zuvor beschrieben ist ein mehrstufiger Prozess, der eine geordnete Anordnung von Translationsinitiationskomplexen. Unter normalen Wachstumsbedingungen sind Translationsinitiationskomplexen in Polyribosome deren Erfassung durch Polysomen Profil zeugen für eine aktive Translationsinitiation (, unbehandelt Abb. 2) umgewandelt. Unter Stressbedingungen jedoch Translationsinitiations was zur Akkumulation von 80S monosomes und eine Verringerung der Polysomen-Peaks (; Proteasom-Inhibitor 2) blockiert.
Abbildung 1. A s implified Ansicht der Übersetzung Einweihung. Translation Initiation umfasst mehrere Schritte: 1) Die Bildung der eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternären Komplex, 2), der Verband der ternären Komplex mit 40S Ribosomen Bildung der 43S Präinitiationskomplexes, 3), der Verband der 43S-Komplexen mit mRNA Bildung der 48S Präinitiationskomplexes, 4) Scannen der 5'-untranslatierten Region der mRNA durch 48S Ribosomen, bis es erreicht und identifiziert die Einleitung AUG-Codon und 5) Rekrutierung der großen ribosomalen Untereinheit 60S zu 48S Bildung der 80S-Komplex, an welcher Stelle Polypeptide Synthese beginnt. Jeder Schritt des Translationsinitiations beinhaltet die Aktivität von mehreren Übersetzung Initiationsfaktoren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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. 2 Polysomen Profile und Analyse von Polysomen-assoziierten Proteinen durch Western-Blot in HeLa-Zellen (A - B). Cytoplasmatische Extrakte wurden aus HeLa-Zellen entweder unter normalen Bedingungen (A) oder nach Behandlung mit Proteasom-Inhibitor für 4 Stunden (B anbaut ) und auf einem 15-55% v / w linearen Sucrosegradienten zentrifugiert. Polysomen-Profile werden im oberen Bereich angezeigt. Die Positionen der 40S Ribosomen, 60S Ribosomen, 80S monosomes und Polysomen sind in jedem Profil angezeigt. Fraktionen von der Spitze (15%) an der Unterseite (55%) des Gradienten werden von links nach rechts dargestellt. Fraktionen wurden gesammelt und mit Antikörpern gegen die große ribosomale Protein L28 als auch mit der Polysomen-assoziierten Protein FMRP, die als Kontrollen für Polysomen Integrität 5,6 dienen mittels Western Blot (untere Tafeln) analysiert. Beachten Sie, dass treatment mit dem Proteasom-Inhibitor reduziert Polysomen Spitzen mit gleichzeitiger Erhöhung der 80S monosomes was auf eine Hemmung der Translation Initiation. Typische Profile Schneider Drosophila-Zellen oder Mäuse Gehirn erhalten haben, anderswo 7-10 beschrieben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Die Polysomen-Profilanalyse auf Sucrosegradienten ermöglicht die Messung der Translationsinitiation durch Analysieren der Dichte von Polysomen aus Zellen oder Geweben isoliert 9,11-14. Diese Technik ist die besten (wenn nicht der einzige) Ansatz zur Initiation der Translation in vivo zu messen. Es wird verwendet, um den Status der Translations wachsenden Zellen während des Zellzyklus 15 zu überwachen, und um die Effekte von verschiedenen Arten von Stress, einschließlich viraler Infektionen, Hypoxie 13,16, Strahlung 17, 18 und chemische Wirkstoffe in der Therapie zu beurteilen, auf die Translationsinitiation. Obwohl dieses Verfahren gut funktioniert, um die Translation Initiation der Zellkulturen und die spezifischen Geweben, wie Gehirn und Leber festzustellen, bleibt es eingerichtet werden, wenn sie verwendet werden, um Translations-Initiations von normalen gegenüber erkranktem Gewebe und Tumoren zu vergleichen ist.
Änderungen in Polysom Profile können auch unter Bedingungen, die Übersetzung zu ändern Dehnung auftretention oder Kündigung. In diesen Fällen wird die Hemmung der Dehnungsraten der Übersetzung einer Steigerung von Polysomen Spitzen führen, während eine Hemmung der Kündigung sollte in größeren Polysomen relativ zur Kontrolle führen. Im Gegensatz dazu, Inhibitoren der Translationsinitiations verhindern Reformation der Polysomen, da die Bildung von aktiven Translationsinitiationskomplexen blockiert. Dies ist in Polysomen Profile durch eine Reduktion der Polysomen Peaks mit einer gleichzeitigen Zunahme des 80S monosomes reflektiert. Weil Übersetzung Inhibitoren blockieren Translations-Initiations-Komplexe, ist zu erwarten, dass sowohl 40S-und 60S-Peaks wird ebenfalls zunehmen. Doch sehr oft eine Erhöhung nur 80S monosomes wird auf die Hemmung der Translationsinitiations beobachtet. Der Grund, warum eine Erhöhung in den anderen ribosomale Komplexe nicht beobachtet wird, ist derzeit nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass zufällige Assoziation zwischen Stillstand ribosomale Komplexe können während der Extraktion, die zu der beobachteten Häufung auftretention von nur 80S monosomes.
Neben der Analyse der Translationsinitiations kann Polysom Profil-Technik helfen, die Identität des Translationsinitiationsfaktoren (wie eIF4E, eIF4A und eIF4G) zu bestätigen und neue Translationsregulatoren zu identifizieren. Als Translationsinitiationsfaktoren aus Ribosomen bei der letzten Übersetzung Initiierungsschritt freigesetzt wird, sollte sie nicht über die Übersetzung Ribosomen Fraktionen nachgewiesen werden. Die Assoziation von Proteinen wie FMRP 14, SMN 19,20, TDRD3 21 mit beiden Polysomen und nicht-Polysomen Fraktionen zeigt, dass die regulatorische Rolle dieser Proteine in der Übersetzung nicht auf den Initiierungsschritt beschränkt. Die Überwachung der Vereinigung von Proteinen mit Polysomen stellt auch ein mächtiges Mittel, um zu beurteilen, wie Stressbedingungen könnte die Translationsaktivität von spezifischen Proteinen beeinflussen. , Der Verband der spezifischen Proteine mit Polysomen an sich ist jedoch nicht ausreichend, um eine translatorische rol schließene, die dann muss durch funktionelle Studien bestätigt werden. Schließlich erlaubt die Bestimmung der Translationsaktivität von spezifischen mRNAs unter verschiedenen Bedingungen und für die Prüfung der spezifischen Mechanismen, die Übersetzung wie miRNA-vermittelte Repression Translations 22 regulieren die Polysomen-Profil-Technik. Die allgemeine Verwendung von Polysomen-Analyse kann weiter mit einer Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich genomweiten Microarray-Analyse erweitert werden und in jüngerer Zeit die Transkriptom-Profiling-Skala Ribosom 23-26 so dass für robuste Vorhersage von Protein-Expression und vor allem die eine neue leistungsfähige experimentelles Werkzeug für die Analyse der Translationskontrolle 23-27.
Wie bei jeder Methode, müssen Vorkehrungen getroffen werden, während der Durchführung Polysom Profilierung. In dieser Hinsicht sollten mehrere Parameter wie Zellpassage, Zelllyse Menge an Zellextrakt auf den Gradienten geladen werden, und die Integrität der RNA und Cfeuere. Optimierung der Ultrazentrifugation Bedingungen ist auch erforderlich, um die beste Trennung der ribosomalen Bevölkerung durch die Saccharose-Gradienten zu erhalten. Komponenten, die die Steigungen und Lysepuffer, wie Saccharose und Detergentien darstellen, kann die Absorption in der 254 nm Wellenlänge zu ergeben. Es ist daher wichtig, um ein Steuer Gradienten, der nur Lysepuffer enthalten. Schließlich sollten die Steigungen sich mit Vorsicht behandelt werden, als minimale Störung des Gradienten können große Auswirkungen auf die Polysomen-Profilen führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
PA ist ein Empfänger eines Stipendiums "Pierre Durand" von der Fakultät für Medizin der Universität Laval. Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MOP-CG095386) gestützt auf RM Die Polysom Fraktionators wurde durch einen kanadischen Stiftung für Innovation Zuschuss (MOP-GF091050) bis RMR M hat einen neuen Ermittler CIHR Gehalts Auszeichnung erworben.
Wir sind dankbar, dass DRS. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco und A. Cammas für hilfreiche Ratschläge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
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