Summary
在这里，我们描述一个变化来分析真核细胞中的mRNA的翻译的响应于胁迫条件的启动方法。此方法是基于换算从非翻译的核糖体的核糖体的蔗糖梯度的速度分离。
Abstract
mRNA翻译的精确控制是基本的真核细胞内环境稳定，特别是在应对生理和病理的压力。这个方案的改变可导致受损细胞的生长，癌症发展的一个标志，或过早的细胞死亡如见于神经变性疾病。多的关于对翻译控制的分子基础所谓已经从多核糖体分析使用密度梯度分级分离系统获得的。这种技术依赖于细胞质提取物对超速的线性蔗糖梯度。一旦旋转完成时，该系统允许分馏对应于不同翻译离心分离区与定量核糖体种群，从而导致多核糖体模式。变化多核糖体轮廓是指示发生在响应各类应力的翻译起始的变化或缺陷。此技术还允许以评估日特定蛋白对翻译起始é角色，并衡量特定mRNA的翻译活动。这里我们描述的协议，以便评估在正常或胁迫生长条件下的真核细胞和组织的翻译起始执行多核糖访问。
Introduction
真核细胞中不断遇到各种需要快速适应性细胞反应有害的生理和环境应激条件。细胞应激反应涉及抗生存和促存活作用因子之间的精确平衡。破坏这种平衡可以有不可逆的后果导致人类疾病如癌症和神经退行性疾病的发展。在应激反应的第一步骤中，细胞激活，涉及改变基因表达在mRNA翻译水平的协调控制促存活途径。
在真核生物mRNA的翻译是涉及翻译起始因子（EIFS），特定的RNA结合蛋白（其中，RBD）和RNA分子1之间协调的相互作用复杂的细胞过程。 mRNA翻译被分成三个不同的阶段：起始，延伸和终止。虽然所有三个阶段都受到REGUlatory机制，平移控制机制，针对翻译的大多是起始阶段，这足以构成蛋白质的合成2的限速步骤。
翻译起始是一个高度有序的过程，开始于eIF2a.GTP.Met-tRNA的形成我遇到了三元复合物及其随后的结合到40S核糖体亚单位，从而导致预起始复合物的形成。接下来的步骤是将起始前复合物的mRNA，它涉及到翻译起始因子如eIF4F和eIF3的活性的募集。由此形成的48S起始前复合物经受特定的构象变化，使此机器开始扫描mRNA的5'-非翻译区，直到它识别起始密码子八月大部分的翻译起始因子，然后释放，60S亚基招募形成80S核糖体复合胜任翻译，一吨点蛋白质合成开始（ 图1），其中。多个80S monosome可翻译的mRNA相同的时间产生所谓的多聚核糖体（或者多聚核糖体）。多聚核糖体上的mRNA的密度反映了起始，延长和终止率，因而是一种特殊的转录物的可译性的度量。然而，多核糖更新主要用于在启动步骤，以评估变化的mRNA的翻译。在这里，我们使用了蛋白酶体抑制剂作为翻译起始抑制剂。癌细胞与这种药物治疗引起应激反应特点是激活的磷酸化翻译起始因子eIF2a 3名为HRI应力激酶。 eIF2a的磷酸化是重要的事件，导致翻译起始的在哺乳动物细胞中4的抑制作用1。
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Protocol
该协议遵循的指导方针 经伐的伦理审查委员会。
1，制备细胞培养和脑操作
- 哺乳动物和果蝇细胞
- 生长的HeLa宫颈癌细胞和施奈德果蝇胚胎细胞所推荐的美国典型培养物保藏中心。与细胞在低通道工作。
- 板单元，以达到80％汇合的实验当天。为获得最佳结果，用〜12×10 6个细胞的每个实验条件。在进行提取物为多核糖体分析，刺激翻译，加入新鲜的完全培养基为至少90分钟。
- 脑隔离：从年龄出生后9天和16天之间隔离的小鼠大脑。安乐死涉及麻醉和颈椎脱位后的CO 2吸入。下面的牺牲，隔离整个大脑和任何地方，我T AT -80°C或直接将其传送到冷PBS 1X立即使用。
2，密度的制备梯度分馏系统
- 用0.1％SDS洗管路系统5分钟。
- 用DEPC水洗涤前5分钟，用70％的乙醇5分钟，洗管路系统，然后用RNaseZAP解。
- 泵空气以干燥装置的管道系统。
在蔗糖梯度的3制备
- 使在20mM的Tris-HCl pH 7.4的，1.25毫摩尔MgCl 2，150 mM氯化钠，和1mM DTT的15％和55％的蔗糖溶液。
- 生成 使用ISCO型号160梯度前，所描述的制造商的说明书线性15-55％的蔗糖梯度。然而，重要的是要控制好将TRIS蠕动泵的速度，以避免建立在梯度气泡或湍流。保持梯度在4℃直至使用。
- 在梯度壶程序运行时的时间，冷却超速离心机到4°C。
4，制备细胞和小鼠脑提取物
- 细胞提取物的制备
- 地方板置于冰上和洗细胞（S）3倍用冷PBS 1X。
- 收获细胞（〜12×10 6）在1ml裂解缓冲液（20mM的Tris-HCl pH为7.4，1.25毫摩尔MgCl 2，150 mM氯化钠，1mM的DTT，1％诺乃洗涤剂P40，5单位/毫升RNA酶抑制剂，补充具有完整的迷你EDTA蛋白酶抑制剂混合片），将它们传输到Eppendorf管中，并通过一个1CC U100胰岛素注射器28 G 1/2通过他们15X拌匀。让细胞裂解物搁置在冰上15分钟。
- 放几滴细胞裂解物上的滑动通过使用10X物镜在相衬显微镜观察，以评估细胞的裂解。只有原子核应该是可见的，并没有细胞膜应该是可见的公证人进行细胞裂解。作为对照，观察未裂解细胞。
- 通过离心澄清的细胞裂解物在11,000×g离心20分钟，在4℃，并保持含有多聚核糖体的可溶性裂解物。
- 小鼠脑组织提取物的制备
- 由10个冲程在冰冷的Dounce匀浆2毫升的裂解缓冲液中匀化整个孤立大脑（〜500mg）和通过离心澄清的匀浆液以11,000×g离心15分钟，在4℃下
- 加载得到的上清液至50％蔗糖的缓冲垫，并使用超速离心机转子TH-641在4℃下进行沉淀2小时以200,000×g离心
- 重悬含在1ml裂解缓冲液中的多聚核糖体的半透明颗粒和通过上下吹打混匀。装载到梯度之前让在冰上30分钟，悬浮液其余部分。
5，加载到提取蔗糖梯度超速离心和
- 测量浓度的RNA存在于使用分光光度计的胞质提取物。小心缓慢地加载〜20 OD 260单位提取物到15％至55％的蔗糖梯度。确保有2-3毫米的可用空间在管的表面，以避免在离心过程中溢流管。
- 使用超离心2小时30分钟，在230000×g离心使用超速离心机转子TH-641在4℃下离心梯度当离心结束后，取出试管，并将其放置在冰小心不要打扰梯度。
细胞质提取物6。分级为多聚核糖体剖析
- 将蔗糖梯度的密度自动分级系统，并进行分数的自动分离和收集（每次0.5毫升），所描述的制造商。
- 收集各馏分（〜500μl）入个人Eppendorf管在254 nm处连续监测吸光度。在parall梯度分馏操作的EL中，polyribosomal配置文件将被编辑在记录纸上。或者，使用附加到图表记录器有一个电子采集的多核糖体轮廓的数据采集单元。
- 在每次运行结束后，转移干冰收集Eppendorfs。此时，无论是存储收集的馏分在-80℃或直接沉淀蛋白质-RNA复合物，如下所示。
7，蛋白提取及分析
- 蔗糖梯度的每个收集到的馏分，加入2倍体积的100％冷乙醇，并让RNA-蛋白复合物沉淀在-20℃下过夜。
- 离心每个RNA-蛋白沉淀于11000×g离心20分钟，在4℃下然后用70％的乙醇。干燥并在继续进行Western印迹使用特异性抗体（参见图2）之前悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中的沉淀物。
8，RNA提取和Analysis
- 沉淀RNA-蛋白质复合物在7.1节。每个重悬RNA-蛋白质沉淀中含有0.1％SDS裂解缓冲液。消化与2在55℃水浴中30分钟毫克/毫升蛋白酶K的析出物的蛋白质组分。
- “：氯仿酚”，2倍体积的氯仿和0.1体积的2M醋酸钠pH值为4，以10000×g离心，在4℃下进行20分钟，加入1倍体积的提取沉淀的RNA元件。沉淀的RNA从每个样品中加入1倍体积的异丙醇和0.2微克/微升糖原的所得水相过夜，在-20℃下。旋转沉淀1小时以10000×g在4℃下用70％冷乙醇洗涤RNA沉淀。
- 重悬RNA沉淀成小体积的无RNA酶的水。评估的数量 和质量 RNA的使用分光光度计。
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Representative Results
如前面提到的，多核糖体轮廓允许翻译起始的胁迫条件下的变化的分析， 图1是如前面所述是一个涉及翻译起始复合物的有序组装多步骤的过程翻译起始的简化视图。在正常生长条件下，翻译起始复合物被转化为多核糖体，其检测由多核糖更新证实为一个活跃的翻译起始（ 图2;未处理）。根据应力条件然而，翻译起始被阻断导致80S monosomes积累和减少的多核糖体的峰（ 图2;蛋白酶体抑制剂）。
图1。一个S翻译起始implified看法。 翻译起始包括几个步骤：1）eIF2a.GTP.Met酰-tRNA的形成， 我遇到了三元复合物，2）的三元复合物与40S的核糖体的关联形成43S起始前复杂，43S复合物与mRNA的3）的关联形成48S起始前复合物，4）扫描所述mRNA的5'-非翻译区由48S核糖体，直到它到达与识别起始AUG密码，以及5）招募的核糖体大亚基60S到48S形成在该点的80S复杂多肽合成开始。翻译起始的每一步都涉及到几个翻译起始因子的活性。 点击这里查看大图 。
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图2的多核糖体访问和多核糖体的分析通过在HeLa细胞蛋白质印迹相关蛋白 （A - B）。细胞质提取物从无论是在正常条件（A）或在与蛋白酶体抑制剂为4小时（B治疗生长的HeLa细胞制备的），并离心以15-55％V / W线性蔗糖梯度。多聚核糖体配置文件显示在顶部面板。的40S核糖体，核糖体60S，80S monosomes和多聚核糖体的位置显示在每个配置文件。馏分从顶部（15％）的梯度的底部（55％）显示由左到右。收集级份，并通过蛋白印迹分析（底部小图）进行分析以抗核糖体大L28蛋白以及与多核糖体相关蛋白FMRP是作为核糖体完整性5,6的控制。需要注意的是TREatment与蛋白酶体抑制剂可减少多核糖体的峰与伴随增加的80S monosomes指示翻译起始的抑制。施耐德果蝇细胞或小鼠大脑获得的典型配置文件已在别处7-10描述。 点击这里查看大图 。
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Discussion
在蔗糖梯度上的多核糖体轮廓分析允许翻译起始的测量通过分析多核糖体从细胞或组织9,11-14孤立的密度。这种技术是最好的（如果不是唯一的）方法来衡量翻译起始体内 。它是用来监视在细胞周期15生长的细胞的平移状态，并评估各种类型的应力，包括病毒感染，缺氧13,16，辐射17，和化学药物治疗中使用的18的作用，对翻译起始。然而，尽管这种技术能够很好地评估细胞培养物和特定的组织如脑和肝的翻译起始，它仍然是，如果它可以被用来比较的正常翻译起始与患病的组织和肿瘤中建立的。
也可以说改变翻译elonga条件下发生变化，多聚核糖体型材化或终止。在这些情况下，翻译的伸长率的抑制将导致增加的多核糖体的峰而终止的抑制应该导致相对于对照更大的多核糖体。相比之下，翻译起始的抑制剂防止核糖体的改造，因为形成积极的翻译起始复合物的被封锁。这是通过与80S monosomes随之增加减少的多核糖体的峰反映在多聚核糖体访问。因为翻译抑制剂搪塞翻译起始复合物，因此预计这两个40S和60S高峰也将增加。可是，很多时候增加只有80S monosomes是在抑制翻译起始的观察。为什么增加另一个核糖体复合物是不遵守的原因目前还不清楚。一个可能的解释可能是提取导致观察到的积累过程中可能出现停滞核糖体复合物之间的偶然协会化的只有80S monosomes。
除了翻译起始的分析，核糖体配置技术可以帮助确认翻译起始因子（如eIF4E的，eIF4A和eIF4G）的身份，并确定新的翻译稳压器。作为翻译起始因子被释放从核糖体上一次翻译起始步骤，它们不应该被过度翻译的核糖体组分进行检测。蛋白质如FMRP 14，SMN 19,20，TDRD3 21与两个多聚核糖体和非核糖体组分的关联表明这些蛋白在翻译的调控作用并不限于起始步骤。监测与多聚核糖体蛋白的协会也构成了强有力的手段来评估应力条件如何影响特定蛋白质的翻译活动。然而，特定的蛋白质与多聚核糖体本身的关联是不足以得出结论平移ROLE，然后需要通过功能研究证实。最后，将多核糖更新技术允许确定在各种条件下特异mRNAs的翻译活性，并进行检查的调控翻译如的miRNA介导的翻译抑制22特定的机制。一般使用多核糖体的分析可以进一步延长使用各种下游应用，包括全基因组微阵列分析，以及最近的转录组尺度核糖体分析23-26允许蛋白表达和更重要的是提供一种新的强有力的实验工具的鲁棒预测平移控制23-27的分析。
正如任何方法，注意事项需要同时执行多核糖体分析才能作出。在这方面，多个参数，例如孔通道，细胞裂解，细胞提取物被装载到该梯度量和RNA完整性应该是C井ontrolled。还需要以超离心条件的优化，得到核糖体人口通过蔗糖梯度上最好分离。构成该梯度和裂解缓冲液，例如蔗糖和洗涤剂组分，可在254纳米波长的吸光度得到。因此，这是重要的，包括只含有裂解缓冲液的控制梯度。最后，梯度本身应谨慎处理，因为梯度极小扰动可引起多聚核糖体型材巨大的影响。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
PA是奖学金“皮埃尔·杜兰德”的拉瓦尔大学医学院收件人。这项工作是支持由加拿大自然科学和工程研究理事会（MOP-CG095386）马币的多核糖体分馏是通过加拿大创新基金会赠款（MOP-GF091050）所收购，以RMR M拥有一个新的CIHR研究员薪水奖。
我们感谢博士。 E. Khandjian，一Gallouzi，S.迪 - 马可和A. Cammas的有益建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
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