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Biology

Polysome रूपरेखा से तनाव की स्थिति के दौरान अनुवाद दीक्षा का विश्लेषण

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51164
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Faculty of Medicine, Laval University, 2CHU de Quebec Research Center
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम स्थितियां तनाव के जवाब में कोशिकाओं की mRNA अनुवाद की दीक्षा में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि गैर अनुवाद राइबोसोम से राइबोसोम का अनुवाद करने में सुक्रोज ढ़ाल पर वेग जुदाई पर आधारित है.

Abstract

MRNA अनुवाद के सटीक नियंत्रण विशेष रूप से शारीरिक और रोग तनाव के जवाब में, यूकेरियोटिक सेल homeostasis के लिए मौलिक है. इस कार्यक्रम के बदलाव कैंसर के विकास की एक बानगी, या ऐसे neurodegenerative रोगों के रूप में देखा समयपूर्व कोशिका मृत्यु को क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Translational नियंत्रण के लिए आणविक आधार के विषय में जाना जाता है की ज्यादातर एक घनत्व ढाल fractionation प्रणाली का उपयोग कर polysome विश्लेषण से प्राप्त किया गया है. इस तकनीक को एक रैखिक sucrose ढाल पर cytoplasmic अर्क के ultracentrifugation पर निर्भर करता है. स्पिन के पूरा होने पर, सिस्टम अलग अनुवाद करने के लिए इसी centrifuged क्षेत्रों का विभाजन और मात्रा का ठहराव इस प्रकार एक polysome प्रोफाइल में जिसके परिणामस्वरूप, आबादी राइबोसोम की अनुमति देता है. Polysome प्रोफ़ाइल में परिवर्तन तनाव के विभिन्न प्रकार के जवाब में होते हैं कि अनुवाद दीक्षा में परिवर्तन या दोष का संकेत कर रहे हैं. इस तकनीक को भी वें आकलन करने के लिए अनुमति देता हैई अनुवाद दीक्षा पर विशेष प्रोटीन की भूमिका, और विशिष्ट mRNAs का translational गतिविधि को मापने के लिए. यहाँ हम सामान्य या तनाव या तो विकास शर्तों के तहत कोशिकाओं और ऊतकों का अनुवाद दीक्षा का आकलन करने के क्रम में polysome प्रोफाइल के प्रदर्शन करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन.

Introduction

कोशिकाओं को लगातार एक तेजी से अनुकूली सेल प्रतिक्रिया की आवश्यकता है कि हानिकारक शारीरिक और पर्यावरण के तनाव की स्थिति की एक श्रृंखला का सामना. सेल तनाव प्रतिक्रिया विरोधी अस्तित्व और समर्थक अस्तित्व अभिनय कारकों के बीच एक सटीक संतुलन शामिल है. इस संतुलन में खलल न डालें इस तरह के कैंसर और neurodegenerative रोगों के रूप में मानव विकृतियों के विकास में अग्रणी अपरिवर्तनीय परिणाम हो सकते हैं. तनाव की प्रतिक्रिया के पहले चरण के दौरान, कोशिकाओं mRNA अनुवाद के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के समन्वित नियंत्रण शामिल है कि समर्थक अस्तित्व के रास्ते को सक्रिय करें.

eukaryotes में mRNA अनुवाद अनुवाद दीक्षा कारक (EIFS), विशिष्ट शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBDs), और शाही सेना अणु 1 के बीच समन्वित बातचीत शामिल है कि एक जटिल सेलुलर प्रक्रिया है. दीक्षा, बढ़ाव, और समापन: mRNA अनुवाद तीन अलग चरणों में बांटा गया है. सभी तीन चरणों नियमित यद्यपिtranslational नियंत्रण तंत्र इस प्रकार प्रोटीन संश्लेषण 2 की दर सीमित कदम का गठन किया जो अनुवाद के ज्यादातर दीक्षा चरण लक्षित latory तंत्र.

अनुवाद दीक्षा मैं पूर्व दीक्षा परिसर के गठन के लिए अग्रणी, त्रिगुट जटिल और 40 राइबोसोम सबयूनिट के लिए इसके बाद के बंधन मेट eIF2a.GTP.Met-tRNA के गठन के साथ शुरू होता है कि एक उच्च आदेश दिया प्रक्रिया है. अगले कदम के लिए eIF4F और eIF3 के रूप में अनुवाद दीक्षा कारकों की गतिविधि शामिल है mRNA, जो करने के लिए preinitiation परिसर की भर्ती है. इस प्रकार का गठन 48S preinitiation जटिल यह अगस्त कोडोन दीक्षा पहचानता तक mRNA की 5'-untranslated क्षेत्र स्कैनिंग शुरू करने के लिए इस तंत्र को सक्षम है कि विशिष्ट गठनात्मक परिवर्तन आए. अनुवाद दीक्षा कारकों में से अधिकांश तो जारी कर रहे हैं और 60 सब यूनिटों एक 80 फार्म को भर्ती कर रहे हैं राइबोसोम जटिल अनुवाद, के लिए सक्षम एकटी जो बिंदु प्रोटीन संश्लेषण शुरू होता है (चित्रा 1). अधिक एक 80S से monosome तथाकथित polysomes (या polyribosomes) के उत्पादन के लिए एक समय में एक ही mRNA अनुवाद किया जा सकता है. एक mRNA पर polysomes का घनत्व दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति दरों को दर्शाता है और इस प्रकार एक विशेष प्रतिलेख के translatability का एक उपाय है. हालांकि, polysome प्रोफाइल मुख्य रूप से दीक्षा कदम पर mRNA के अनुवाद में परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम अनुवाद दीक्षा अवरोध करनेवाला के रूप में एक एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला का इस्तेमाल किया है. इस दवा के साथ कैंसर की कोशिकाओं के उपचार अनुवाद दीक्षा कारक eIF2a 3 phosphorylates जो HRI नामित तनाव kinase के सक्रियण द्वारा विशेषता तनाव प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. EIF2a की phosphorylation स्तनधारी कोशिकाओं 4 में अनुवाद दीक्षा का निषेध करने के लिए अग्रणी प्रमुख घटनाओं में से एक है.

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Protocol

प्रोटोकॉल दिशा निर्देशों के बाद Laval की नैतिक समीक्षा बोर्ड ने मंजूरी दे दी.

1. सेल संस्कृति की तैयारी और ब्रेन हेरफेर

  1. स्तनधारी और ड्रोसोफिला कोशिकाओं
    1. अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह की सिफारिश के अनुसार हेला गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर की कोशिकाओं और श्नाइडर ड्रोसोफिला भ्रूण कोशिकाओं को विकसित. एक कम बीतने पर कोशिकाओं के साथ काम करते हैं.
    2. 80% संगम प्रयोग के दिन तक पहुँचने के क्रम में प्लेट कोशिकाओं. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए कक्षों की ~ 12 x 10 6 का उपयोग करें. Polysome विश्लेषण के लिए अर्क बनाने से पहले, कम से कम 90 मिनट के लिए नए सिरे से पूरा मध्यम जोड़कर अनुवाद को प्रोत्साहित.
  2. ब्रेन अलगाव: जन्म के बाद 9 और 16 दिनों के बीच आयु वर्ग के चूहों से दिमाग अलग. इच्छामृत्यु संज्ञाहरण और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 साँस लेना शामिल है. बलिदान के बाद, पूरे दिमाग और या तो जगह अलग मैंटी -80 डिग्री सेल्सियस पर या सीधे तत्काल उपयोग के लिए ठंड पीबीएस 1X में स्थानांतरण.

2. घनत्व की तैयारी ढाल Fractionation सिस्टम

  1. 5 मिनट के लिए 0.1% एसडीएस के साथ ट्यूबिंग प्रणाली धो लें.
  2. DEPC पानी से धोने से पहले 5 मिनट के लिए RNaseZAP समाधान के साथ तो, 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबिंग प्रणाली धो लें.
  3. तंत्र की ट्यूबिंग प्रणाली सुखाने के लिए आदेश में वायु पंप.

सुक्रोज ढ़ाल के 3. तैयारी

  1. 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.4, 1.25 मिमी 2 MgCl, 150 मिमी NaCl, और 1 मिमी डीटीटी में 15% और 55% sucrose के समाधान करें.
  2. उत्पन्न निर्माता के निर्देशों के द्वारा वर्णित के रूप में, पूर्व एक Isco मॉडल 160 ढाल का उपयोग कर रैखिक 15-55% sucrose ढाल. हालांकि, यह ढ़ाल में बुलबुले या turbulences के निर्माण से बचने के लिए अच्छी तरह से TRIS क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ढ़ाल रखें.
  3. ढाल निर्माता कार्यक्रम चल रहा है, जब समय के दौरान, 4 डिग्री सेल्सियस तक ultracentrifuge शांत

4. सेल की तैयारी और माउस ब्रेन अर्क

  1. सेल के अर्क की तैयारी
    1. बर्फ और धोने कोशिकाओं पर जगह प्लेट (ओं) ठंड पीबीएस 1X के साथ 3x.
    2. हार्वेस्ट कोशिकाओं पीएच 7.4, 1.25 मिमी 2 MgCl, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 1% Nonidet P40, 5 यू / मिलीलीटर RNase अवरोध करनेवाला, पूरक में 1 मिलीलीटर lysis बफर (20 ​​मिमी Tris-एचसीएल में (~ 12 x 10 6) पूरा मिनी EDTA मुक्त protease अवरोध कॉकटेल गोलियों के साथ), एक Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण, और एक 1cc U100 इंसुलिन सिरिंज 28 जी 1/2 के माध्यम से उन्हें 15x गुजर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. सेल lysate 15 मिनट के लिए बर्फ पर आराम करते हैं.
    3. एक 10x उद्देश्य का उपयोग एक चरण विपरीत खुर्दबीन पर देख द्वारा सेलुलर सेल का आकलन करने के लिए एक स्लाइड पर सेल lysate की कुछ बूँदें डाल. केवल नाभिक को दिखाई देना चाहिए और कोई कोशिका झिल्ली सेल के लिए दिखाई Attesting होना चाहिए. एक नियंत्रण के रूप में, निरीक्षणunlysed कोशिकाओं.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 11,000 XG पर centrifugation द्वारा सेल lysate स्पष्ट करें और polyribosomes युक्त घुलनशील lysate रखना.
  2. माउस ब्रेन निष्कर्षों की तैयारी
    1. Lysis बफर के 2 मिलीलीटर के साथ एक ठंडा Dounce homogenizer में 10 स्ट्रोक से पूरी अलग मस्तिष्क (~ 500 मिलीग्राम) homogenize और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 11,000 XG पर centrifugation द्वारा homogenate स्पष्ट
    2. 50% sucrose के एक तकिया पर जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला लोड और 4 डिग्री सेल्सियस पर वें-641 ultracentrifuge एक रोटर का उपयोग 200,000 XG पर 2 घंटे के लिए अवसादन के साथ आगे बढ़ना
    3. Lysis बफर के 1 मिलीलीटर में polyribosomes युक्त पारदर्शी गोली Resuspend और नीचे से ऊपर pipetting और से अच्छी तरह मिला लें. ढ़ाल पर लोड करने से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन आराम करते हैं.

5. सुक्रोज gradients और ultracentrifugation पर अर्क लोड हो रहा है

  1. एकाग्रता उपायएक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग cytoplasmic निकालने में मौजूद आरएनए की. ध्यान से और धीरे धीरे 15% से 55% sucrose ढाल पर ~ निकालने की 20 आयुध डिपो 260 इकाइयों लोड. उपलब्ध स्थान के 2-3 मिमी centrifugation के दौरान ट्यूबों बह निकला से बचने के लिए ट्यूब की सतह पर है कि सुनिश्चित करें.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर वें-641 ultracentrifuge एक रोटर का उपयोग 230,000 XG पर 2 घंटे 30 मिनट के लिए एक अति अपकेंद्रित्र का उपयोग ढ़ाल अपकेंद्रित्र Centrifugation के समाप्त होने पर, ट्यूब को हटाने और ढ़ाल परेशान करने के लिए नहीं ध्यान से बर्फ पर उन्हें जगह है.

Polysomes रूपरेखा के लिए Cytoplasmic अर्क के 6. Fractionation

  1. निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में, (0.5 मिलीलीटर प्रत्येक) स्वचालित घनत्व Fractionation सिस्टम पर सुक्रोज ढ़ाल प्लेस और अंशों की स्वचालित विभाजन और संग्रह के साथ आगे बढ़ना.
  2. 254 एनएम पर absorbance की सतत निगरानी के साथ व्यक्तिगत Eppendorf ट्यूबों में प्रत्येक अंश (~ 500 μl) लीजिए. Parall मेंढाल fractionation आपरेशन के एल, polyribosomal प्रोफाइल चार्ट पेपर पर संपादन किया जाएगा. वैकल्पिक रूप से, polysome प्रोफाइल की एक इलेक्ट्रॉनिक अधिग्रहण किया है के लिए चार्ट रिकॉर्डर से जुड़ी एक डाटा अधिग्रहण इकाई का उपयोग करें.
  3. प्रत्येक चलाने के अंत में, सूखी बर्फ पर एकत्र Eppendorfs हस्तांतरण. इस समय, दुकान या तो -80 डिग्री सेल्सियस पर भिन्न एकत्र या रूप में इस प्रकार सीधे प्रोटीन शाही सेना परिसरों वेग.

7. प्रोटीन निष्कर्षण और विश्लेषण

  1. सुक्रोज ढाल का प्रत्येक एकत्र अंश के लिए, 100% ठंड इथेनॉल की 2 संस्करणों को जोड़ने और आरएनए प्रोटीन परिसरों -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर वेग चलो.
  2. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 11,000 XG पर प्रत्येक आरएनए प्रोटीन वेग तो 70% इथेनॉल के साथ धो लो. सूखी और (देखें चित्र 2) विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग वेस्टर्न ब्लॉट साथ आगे बढ़ने से पहले एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में वेग resuspend.

8. शाही सेना निष्कर्षण और एकnalysis

  1. खंड 7.1 में के रूप में आरएनए प्रोटीन परिसरों वेग. एसडीएस 0.1% से युक्त lysis बफर में प्रत्येक आरएनए प्रोटीन वेग Resuspend. एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के साथ वेग के प्रोटीन घटक डाइजेस्ट.
  2. ": क्लोरोफॉर्म फिनोल", क्लोरोफॉर्म के 2 संस्करणों, और 2 एम NaOAc 4 पीएच 0.1 मात्रा और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर centrifuging की 1 मात्रा जोड़कर वेग की शाही सेना घटकों को निकालने के. Isopropanol के 1 मात्रा और ग्लाइकोजन की 0.2 ग्राम / μl जोड़कर -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रत्येक नमूने के परिणामस्वरूप जलीय चरण से वेग आरएनए. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर 1 घंटे के लिए वेग स्पिन 70% ठंड इथेनॉल के साथ शाही सेना गोली धो लें.
  3. RNase मुफ्त पानी की एक छोटी मात्रा में शाही सेना गोली Resuspend. मात्रा का आकलन और गुणवत्ता शाही सेना के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग.

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Representative Results

Aforementioned के रूप में, polysome प्रोफाइल तनाव परिस्थितियों में अनुवाद दीक्षा के परिवर्तन का विश्लेषण. 1 पहले अनुवाद दीक्षा परिसरों का आदेश दिया विधानसभा से जुड़े एक multistep प्रक्रिया है वर्णित के रूप में जो अनुवाद दीक्षा का एक सरलीकृत दृश्य है चित्रा की अनुमति देता है. सामान्य विकास शर्तों के तहत, अनुवाद दीक्षा परिसरों जिसका पता लगाने polysome प्रोफाइल द्वारा एक सक्रिय अनुवाद दीक्षा (, अनुपचारित चित्रा 2) के लिए attest polyribosomes में परिवर्तित कर रहे हैं. तनाव की स्थिति के तहत हालांकि, अनुवाद दीक्षा 80S monosomes के संचय और polysome चोटियों की कमी (; एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला चित्रा 2) में जिसके परिणामस्वरूप अवरुद्ध है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक एस अनुवाद दीक्षा का implified देखें.   अनुवाद दीक्षा कई चरण शामिल हैं: 1) eIF2a.GTP.Met-tRNA के गठन मैं त्रिगुट जटिल मेट, 2) 40S के साथ त्रिगुट परिसर के संघ 43S preinitiation जटिल बनाने राइबोसोम, mRNA के साथ 43S परिसरों की 3) संघ 48S preinitiation गठन जटिल, यह पहुँचता है और दीक्षा अगस्त कोडोन को दिखाता है, और 48S के लिए बड़े ribosomal सबयूनिट 60 के दशक के 5) भर्ती पर जो बात 80S जटिल बनाने तक 4) 48S राइबोसोम द्वारा mRNA की 5'-untranslated क्षेत्र स्कैनिंग संश्लेषण शुरू होता है polypeptides. अनुवाद दीक्षा के हर कदम कई अनुवाद दीक्षा कारकों की गतिविधि शामिल है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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. चित्रा 2 Polysomes प्रोफाइल और polysomes का विश्लेषण HELA कोशिकाओं में वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन जुड़े (क - ख). Cytoplasmic अर्क सामान्य शर्तों (ए) में या 4 घंटा (बी के लिए एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला के साथ इलाज पर या तो बड़े हो HELA कोशिकाओं से तैयार किया गया ) और एक 15-55% v / डब्ल्यू रैखिक sucrose ढाल पर centrifuged. Polysomes प्रोफाइल के शीर्ष पैनल में संकेत कर रहे हैं. 40S राइबोसोम, 60 राइबोसोम, 80 monosomes, और polysomes के पदों पर प्रत्येक प्रोफ़ाइल में संकेत कर रहे हैं. ढाल के नीचे (55%) के लिए ऊपर (15%) से अंशों बाईं से दाईं ओर दिखाया गया है. Fractions बड़े ribosomal L28 प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ के साथ ही polysome अखंडता 5,6 के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा है कि polysome जुड़े प्रोटीन FMRP साथ एकत्र और वेस्टर्न ब्लॉट (नीचे पैनल) द्वारा विश्लेषण किया गया. कि Tre नोटएंटीबॉडी अवरोध करनेवाला अनुवाद दीक्षा का एक अवरोध का संकेत 80S monosomes में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ polysomes चोटियों कम कर देता है साथ atment. श्नाइडर ड्रोसोफिला कोशिकाओं या चूहों के मस्तिष्क से प्राप्त विशिष्ट प्रोफाइल के अन्यत्र 7-10 वर्णित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

सुक्रोज ढ़ाल पर polysome प्रोफाइल विश्लेषण कोशिकाओं या ऊतकों 9,11-14 से अलग polysomes के घनत्व का विश्लेषण करके अनुवाद दीक्षा की माप की अनुमति देता है. इस तकनीक को सबसे अच्छा है दृष्टिकोण नहीं है (अनूठा अगर) विवो में अनुवाद दीक्षा को मापने के लिए. यह सेल चक्र के दौरान 15 कोशिकाओं से बढ़ के translational स्थिति पर नजर रखने के लिए, और अनुवाद दीक्षा पर, वायरल संक्रमण, हाइपोक्सिया 13,16, विकिरण 17, और रासायनिक दवाओं के उपचार में प्रयुक्त 18 सहित तनाव के विभिन्न प्रकार के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक सेल संस्कृतियों और इस तरह के मस्तिष्क और जिगर के रूप में विशिष्ट ऊतकों का अनुवाद दीक्षा का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जबकि हालांकि, यह यह रोगग्रस्त ऊतकों और ट्यूमर बनाम सामान्य से अनुवाद दीक्षा तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित किया जाना है.

Polysome प्रोफाइल में परिवर्तन भी अनुवाद elonga बदल कि परिस्थितियों में हो सकता हैtion या समाप्ति. समाप्ति की एक अवरोध नियंत्रण के सापेक्ष बड़ा polysomes में परिणाम चाहिए, जबकि इन मामलों में, अनुवाद के बढ़ाव दरों के निषेध polysomes चोटियों की वृद्धि को बढ़ावा मिलेगा. सक्रिय अनुवाद दीक्षा परिसरों के गठन अवरुद्ध है क्योंकि इसके विपरीत, अनुवाद दीक्षा के inhibitors polysomes के सुधार को रोकने के. इस 80S monosomes की एक सहवर्ती वृद्धि के साथ polysomes चोटियों की कमी से polysomes प्रोफाइल में परिलक्षित होता है. अनुवाद inhibitors अनुवाद दीक्षा परिसरों स्टाल, क्योंकि यह 40 और 60 दोनों चोटियों भी वृद्धि होगी उम्मीद है. हालांकि, बहुत बार केवल 80 monosomes में वृद्धि अनुवाद दीक्षा के निषेध पर मनाया जाता है. अन्य ribosomal परिसरों में वृद्धि नहीं मनाया जाता है कारण वर्तमान में अज्ञात है. एक संभावित व्याख्या ठप ribosomal परिसरों के बीच आकस्मिक संघ ने कहा accumula के लिए अग्रणी निकासी के दौरान हो सकता है कि हो सकता हैकेवल 80 monosomes की tion.

अनुवाद दीक्षा के विश्लेषण के अलावा, polysome प्रोफाइल तकनीक (जैसे eIF4E, eIF4A और eIF4G के रूप में) अनुवाद दीक्षा कारकों की पहचान की पुष्टि करने और उपन्यास का अनुवाद नियामकों की पहचान में मदद कर सकते हैं. अनुवाद दीक्षा कारकों पिछले अनुवाद दीक्षा कदम पर राइबोसोम से जारी कर रहे हैं, वे राइबोसोम अंशों का अनुवाद खत्म नहीं पाया जा चाहिए. ऐसे FMRP 14, SMn 19,20, polysomes और गैर polysomes भिन्न दोनों साथ TDRD3 21 के रूप में प्रोटीन की एसोसिएशन अनुवाद में इन प्रोटीनों की नियामक भूमिका दीक्षा कदम तक ही सीमित नहीं रहा है. Polysomes साथ प्रोटीन की एसोसिएशन निगरानी भी तनाव की स्थिति विशिष्ट प्रोटीन की translational गतिविधि को प्रभावित कर सकता का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली साधन का गठन किया. हालांकि, अपने आप polysomes साथ विशिष्ट प्रोटीन के सहयोग से एक translational rol समाप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं हैई, फिर कार्यात्मक अध्ययन से इसकी पुष्टि किए जाने की आवश्यकता है. अंत में, polysome प्रोफाइल तकनीक विभिन्न परिस्थितियों में विशिष्ट mRNAs का translational गतिविधि का दृढ़ संकल्प, और इस तरह के miRNA मध्यस्थता translational दमन के रूप में 22 अनुवाद विनियमित कि विशिष्ट तंत्र की परीक्षा के लिए अनुमति देता है. polysome विश्लेषण के सामान्य उपयोग के आगे जीनोम चौड़ा माइक्रोएरे विश्लेषण सहित बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म का उपयोग बढ़ाया जा सकता है और अभी हाल ही में transcriptome पैमाने राइबोसोम प्रोटीन अभिव्यक्ति और अधिक महत्वपूर्ण बात यह एक नया शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण उपलब्ध कराने की मजबूत भविष्यवाणी के लिए अनुमति 23-26 रूपरेखा translational नियंत्रण 23-27 के विश्लेषण के लिए.

किसी भी पद्धति के रूप में, सावधानियों polysome रूपरेखा प्रदर्शन करते हुए उठाए जाने की जरूरत है. इस संबंध में, इस तरह के सेल बीतने, सेल, ढाल पर लोड करने की सेल निकालने की राशि, और शाही सेना अखंडता के रूप में कई मापदंडों अच्छी तरह से ग होना चाहिएontrolled. Ultracentrifugation शर्तों का अनुकूलन भी सुक्रोज ढ़ाल के माध्यम से ribosomal आबादी का सबसे अच्छा जुदाई प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. ऐसे sucrose और डिटर्जेंट के रूप में ढ़ाल और lysis बफर है कि गठन अवयव, 254 एनएम तरंगदैर्ध्य में absorbance दे सकता है. यह केवल lysis बफर युक्त नियंत्रण ढाल शामिल करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. ढ़ाल के न्यूनतम गड़बड़ी polysomes प्रोफाइल पर बहुत बड़ा प्रभाव पैदा कर सकता है के रूप में अंत में, ढ़ाल खुद को सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

पीए Laval विश्वविद्यालय के मेडिसिन के संकाय से एक छात्रवृत्ति "पियरे डूरंड" के एक प्राप्तकर्ता है. इस काम polysome fractionator RMR एम एक नया CIHR अन्वेषक वेतन पुरस्कार धारण करने के लिए नवाचार के अनुदान के लिए एक कनाडाई फाउंडेशन (एमओपी GF091050) के माध्यम से हासिल किया गया था आरएम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (एमओपी CG095386) द्वारा समर्थित किया गया.

हम डीआरएस के लिए आभारी हैं. उपयोगी सलाह के लिए ई. Khandjian, मैं Gallouzi, एस डी-मार्को और ए Cammas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium Sigma-Aldrich SO146-500ml  
DMEM Life technologies 11995-073  
FBS Fisher Scientist Scientist SH30396-03  
Penicillin/streptomycin Life technologies 15140122
Sucrose solutions
D-sucrose Fisher Scientist BP220-212  
Glycerol Sigma-Aldrich 49767  
Bromophenol blue Fisher Scientist B3925
Lysis buffer
Tris HCl Fisher Scientist BP153-500
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-100G
NaCl Tekniscience 3624-05  
DTT Sigma-Aldrich D 9779  
Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) MJS Biolynx 19628  
SDS Tekniscience 4095-02  
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) Life technologies 10777-019  
Antiproteases (complete, mini, EDTA free) Roche 11,836,170,001  
RNA Extraction
Proteinase K Life technologies AM2542  
Phenol:chloroform Fisher Scientist BP1754I-400  
Chloroform Fisher Scientist C298-500  
Glycogen Life technologies 10814-010  
Isopropanol Acros organics 327270010  
Antibodies
anti-FMRP antibody Fournier et al., Cancer Cell International, 2010  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
  2. Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
  3. Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
  4. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
  5. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  6. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
  7. Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
  8. Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  9. Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  10. Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
  11. Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
  12. Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
  13. Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
  14. Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
  15. Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
  16. Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
  17. Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
  18. Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
  19. Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
  20. Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
  21. Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
  22. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
  23. Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
  24. Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
  25. Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  27. Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 87 अनुवाद दीक्षा polysome प्रोफाइल sucrose ढाल प्रोटीन और शाही सेना अलगाव तनाव की स्थिति
Polysome रूपरेखा से तनाव की स्थिति के दौरान अनुवाद दीक्षा का विश्लेषण
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Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui,… More

Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (87), e51164, doi:10.3791/51164 (2014).

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