Summary
ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。
Abstract
mRNA翻訳の正確な制御は、特に、生理学的および病理学的ストレスに応答して、真核細胞の恒常性に必須である。このプログラムの変更は、損傷した細胞の増殖、癌発生の顕著な特徴、または例えば神経変性疾患において見られるような時期尚早の細胞死につながることができる。翻訳調節の分子基盤について知られていることの多くは、密度勾配分画システムを用いてポリソーム分析から得られた。この手法は、線形スクロース勾配上で細胞質抽出物の超遠心分離に依存しています。回転が完了すると、システムは、異なる翻訳に対応し、遠心分離ゾーンの分画および定量化は、このようにポリソームプロファイルをもたらす、リボソーム集団を可能にする。ポリソームプロフィールの変化は、ストレスの種々のタイプに応答して生じる翻訳開始の変化や欠陥の指標である。この技術は、目を評価することができ電子翻訳開始の特定のタンパク質の役割、および特定のmRNAの翻訳活性を測定する。ここでは、正常または応力のいずれかの培養条件で、真核細胞および組織の翻訳開始を評価するために、ポリソームプロファイルを実行するために我々のプロトコルが記載されている。
Introduction
真核細胞は、常に迅速な適応細胞応答を必要とする有害な生理学的および環境ストレス条件の範囲に遭遇する。細胞ストレス応答は、抗生存と生存促進作用性因子との間の正確なバランスを必要とする。このバランスを崩壊させることは、癌や神経変性疾患などのヒトの病理の発展をリードする不可逆的な結果をもたらす可能性がある。ストレス反応の第一段階の間、細胞は、mRNAの翻訳のレベルでの遺伝子発現の変化の協調制御を伴う生存促進経路を活性化する。
真核生物のmRNAの翻訳は、翻訳開始因子（EIFS）、特異的なRNA結合タンパク質（のRBD）と、RNA分子の1との間の協調的な相互作用を伴う複雑な細胞プロセスである。開始、伸長、および終結：mRNA翻訳、3つの異なるフェーズに分割される。すべての3つのフェーズがレギュレーションの対象となりますがlatory機構は、翻訳制御メカニズムは、主にこのようにしてタンパク質合成2の律速段階を構成する翻訳の開始位相を、標的とする。
翻訳開始は 、 私は開始前複合体の形成につながる、三元複合体と40Sリボソームサブユニットへのその後の結合に会った eIF2a.GTP.Met-tRNAの形成に始まる高度に秩序プロセスです。次のステップは、そのようなeIF4F複合eIF3と、翻訳開始因子の活性が関与するmRNAに前開始複合体の動員である。このように形成された48S開始前複合体は、開始コドンAUGを認識するまで、mRNAの5 '非翻訳領域のスキャンを開始するには、この機械を有効に特定の立体構造変化を受ける。翻訳開始因子の多くは、その後解放され、60Sサブユニットが翻訳のために、複雑な有能なリボソーム80Sを形成するために動員され、Aトンその時点でタンパク質合成を開始する（ 図1）。一染色体は、いわゆるポリソーム（またはポリリボソーム）の製造時に同じmRNAを翻訳することができ、複数の80S。ポリソームmRNA上の密度は、開始、伸長および終結率を反映し、したがって、特定の転写物の翻訳可能性の尺度である。しかしながら、ポリソームプロファイルは、主に開始段階におけるmRNA翻訳の変化を評価するために使用される。ここでは、翻訳開始阻害剤としてのプロテアソーム阻害剤を使用している。この薬物による癌細胞の処理は、翻訳開始因子eIF2a をリン酸化し、3 HRIというストレスキナーゼの活性化によって特徴付けストレス応答を誘導する。 eIF2aのリン酸化は、哺乳動物細胞4における翻訳開始の阻害を引き起こす主要なイベントの一つです。
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Protocol
プロトコルは、ガイドラインに従っています ラバルの倫理審査委員会により承認されました。
1。細胞培養の準備と脳の操作
- 哺乳類とショウジョウバエ細胞
- アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションが推奨するようにしたHeLa子宮頸癌細胞とシュナイダーショウジョウバエの胚細胞を増殖させる。低継代の細胞を操作します。
- 80％の集密度の実験日に到達するために、プレートの細胞。最良の結果を得るには、各実験条件についての細胞の〜12×10 6を使用しています。ポリソーム分析のための抽出物を加える前に、少なくとも90分間、新鮮な完全培地を添加することにより翻訳を刺激する。
- 脳の分離：生後9〜16日の間、老齢マウスの脳を分離します。安楽死は、麻酔および頸椎脱臼した後、CO 2吸入を必要とする。犠牲に続いて、脳全体のどちらかの場所を隔離I-80℃でTまたは直接すぐに使用冷PBS 1Xにそれを転送します。
2。密度勾配分画系の製造に
- 5分間、0.1％SDSで配管システムを洗浄します。
- DEPC水で洗浄する前に、5分間RNaseZAPソリューションで、その後、5分間、70％エタノールでチューブシステムを洗浄します。
- 装置の配管系を乾燥させるために空気をポンプ。
ショ糖勾配の3。準備
- 20mMのトリス-HCl、pH7.4、1.25のMgCl 2、150mMのNaCl、および1mM DTT、15％、55％ショ糖溶液を作る。
- 生成する 製造業者の使用説明書に記載されているように、前者イスコモデル160勾配を用いて15％から55％線形スクロース勾配。しかし、勾配の気泡や乱流の生成を避けるために、周知TRIS蠕動ポンプの速度を制御することが重要である。使用するまで4℃で勾配を維持する。
- 勾配メーカープログラムが実行されている時間の間、4℃で超遠心機を冷却する
4。細胞の作製とマウスの脳の抽出物
- 細胞抽出物の準備
- 氷と洗浄細胞の上に置いてプレート（S）は、冷PBS 1Xで3回。
- 補充した溶解緩衝液1ml（pH7.4の20mMトリス塩酸、1.25のMgCl 2、150mMのNaCl、1mMのDTT、1％ノニデットP40、5 U / mlのRNase阻害剤、収穫細胞（〜12×10 6個）完全なミニEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠付き）、エッペンドルフチューブに転送し、1ccののU100インスリン注射器28 G 1/2を介してそれらを15Xを渡すことでよく混ぜる。細胞溶解物を氷上で15分間休憩しましょう。
- 10×対物レンズを用いた位相差顕微鏡で観察することにより細胞溶解を評価するためにスライド上に細胞溶解物を数滴入れた。唯一の核は見えるはずず、細胞膜は、細胞溶解のために証明する見えないはずです。対照として、観察未溶解細胞。
- 4℃で20分間、11,000×gでの遠心分離によって細胞溶解物を明確にし、ポリリボソームを含む可溶性ライセートを保つ。
- マウス脳抽出物の調製
- 溶解緩衝液2mlの氷冷Dounceホモジナイザーで10ストロークにより単離された脳全体（〜500mg）をホモジナイズし、4℃で15分間、11,000×gで遠心分離することによってホモジネートを明らかにする
- 50％ショ糖のクッションの上に得られた上清をロードし、4℃で、TH-641超遠心ローターを用い20万×gで2時間沈降を進める
- 溶解緩衝液1ミリリットル中にポリリボソームを含む半透明のペレットを再懸濁し、上下にピペッティングしてよく混ぜます。勾配上にロードする前に30分間氷上サスペンション残りをしましょう。
5。ショ糖勾配超遠心分離に抽出ロード
- 濃度を測定分光光度計を用いて、細胞質抽出物中に存在するRNAの。慎重にゆっくりと15パーセント〜55％ショ糖勾配上に〜抽出物の20 OD 260単位をロードします。利用可能なスペース2-3 mmは遠心分離中のチューブをオーバーフローを回避するために、管の表面に存在することを確認してください。
- 4℃で、TH-641超遠心ローターを用い23万×gで2時間30分の超遠心機を用いて勾配を遠心分離遠心分離が終了すると、チューブを外し、勾配を乱さないように注意深く氷の上に置きます。
ポリソームプロファイリングのための細胞質抽出物の6。画
- 製造者によって記載されているように、自動化された密度分画システムにショ糖勾配を配置し、分画の自動分別と収集を進める（0.5ミリリットルずつ）。
- 254 nmの吸光度を連続的に監視して、個々のエッペンドルフチューブに各画分（〜500μl）を収集します。 parall中勾配分別操作のELは、polyribosomalプロファイルはチャート紙で編集されます。代わりに、ポリソームプロファイルの電子買収を持つようにチャートレコーダーに接続され、データ取得手段を使用しています。
- 各実行の最後に、ドライアイス上で収集したエッペンドルフを転送します。このとき、ストアのいずれかを-80℃で画分を集め、以下のように直接またはタンパク質-RNA複合体を沈殿させる。
7。タンパク質抽出および分析
- ショ糖勾配の各収集画分に、100パーセントの冷エタノール2容量を追加して、RNA-タンパク質複合体は、-20℃で一晩沈殿させてみましょう。
- 遠心機で4℃で20分間11,000 xgで各RNA-タンパク質沈殿物を70％エタノールで洗浄する。乾燥した特異的抗体を用いたウェスタンブロットに進む前に、SDS-PAGEサンプル緩衝液中に沈殿物を再懸濁する（ 図2参照）。
8。RNA抽出およびAnalysis
- セクション7.1のように、RNA-タンパク質複合体を沈殿させる。 0.1％SDSを含有する溶解緩衝液中の各RNA-タンパク質沈殿物を再懸濁する。 55℃の水浴中で30分間、2 mg / mlのプロテイナーゼKを有する沈殿物のタンパク質成分を消化する。
- "：クロロホルムフェノール」、クロロホルム2ボリューム、2 MのNaOAc pHが4の0.1ボリュームと20分間、4℃で万×gで遠心分離の1ボリュームを追加することにより、沈殿物のRNA成分を抽出。 1容量のイソプロパノールおよびグリコーゲン0.2μgの/μLを添加することにより、-20℃で一晩、各試料の得られた水相から沈殿物のRNA。 4℃で10,000×で1時間沈殿物を回転70％冷エタノールでRNAペレットを洗浄します。
- RNA分解酵素を含まない水を少量にRNAペレットを再懸濁します。量を評価 と品質 RNAを分光光度計を用いて。
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Representative Results
前述のように、ポリソームプロフィールはストレス条件下で翻訳開始の変化の分析を可能にする。 図1は、前述のように、翻訳開始の簡略図が翻訳開始複合体の順序付けられたアセンブリーを含む多段階プロセスである。正常な成長条件下で、翻訳開始複合体は、その検出ソームプロファイルによる活性翻訳開始のための証明（;未処理図2）ポリリボソームに変換される。ストレス条件下しかしながら、翻訳開始は、80Sモノソームやポリソームの蓄積のピークの減少（;プロテアソームインヒビター図2）で得られたブロックされている。
図1。S翻訳開始のimplified眺め。 翻訳開始には、いくつかのステップが含まれます。1）eIF2a.GTP.Met-tRNAの形成は、 私が三元複合体と出会い 、2）40Sとの三元複合体の会合が43S前開始複合体を形成するリボソーム、mRNAと43S複合体の3）協会48Sを形成することは、開始コドンAUGに到達し、識別するまで4）48SリボソームによるmRNAの5 '非翻訳領域を走査し、及び5）48Sリボソームサブユニットの大60Sの動員は、その時点での80S複合体を形成し、前開始複合体合成開始をポリペプチドが含まれる。翻訳開始の各ステップは、複数の翻訳開始因子の活性を伴う。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2ポリソームプロファイルおよびHeLa細胞においてウエスタンブロットによってタンパク質を関連したポリソームの分析 （A - B）。細胞質抽出物を通常の条件（A）または4時間（Bためのプロテアソーム阻害剤で処理するとどちら増殖させたHeLa細胞から調製した）と、15から55までパーセントのV / Wの直線スクロース勾配で遠心分離した。ポリソームプロファイルはトップパネルに示されている。 40Sリボソーム、60Sリボソーム、80Sモノソーム、およびポリソームの位置が各プロファイルに示されている。トップ（15％）の勾配の一番下（55％）の画分を左から右に表示されます。画分を大リボソームL28タンパク質に対する抗体を用いただけでなく、ポリソームの整合5,6のための対照として用いるポリソーム関連タンパク質FMRPと（下のパネル）、ウエスタンブロットによって収集され、分析された。そのTREに注意してくださいプロテアソーム阻害剤は、翻訳開始の阻害を示す80Sモノソームの同時増加にポリソームピークを低減してatment。シュナイダーショウジョウバエ細胞やマウス脳から得られた典型的なプロファイルは、他の場所で7月10日に記載されている。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
スクロース勾配上のポリソームプロファイル解析は、細胞または組織から単離したポリソーム9,11-14の濃度を分析することによって、翻訳開始の測定を可能にする。この手法は、 生体内で翻訳開始を測定するのに最適な（ない場合は一意の）アプローチである。これは、細胞周期15の間、細胞を増殖させるの並進状態を監視するために、及び翻訳開始には、ウイルス感染症、低酸素13,16、放射線17、および化学薬物療法で使用される18を含むストレスの様々な種類の効果を評価するために使用される。この技術は、細胞培養物ならびに脳および肝臓などの特定の組織の翻訳開始を評価するためにうまく機能している間しかし、それは病変組織および腫瘍対正常の翻訳開始を比較するために使用することができる場合に確立されていない。
ポリソームプロファイルの変化はまた、翻訳elongaを変更する条件の下で発生する可能性がありますのTiONまたは終了。終結の抑制は対照と比較し、より大きなポリソームをもたらすはずである、一方、これらの場合には、翻訳の伸長速度の抑制は、ポリソームピークの増加につながる。アクティブな翻訳開始複合体の形成がブロックされるためこれとは対照的に、翻訳開始の阻害剤は、ポリソームの再形成を防止する。これは、80Sモノソームの同時増加とポリソームピークの減少によってポリソームプロファイルに反映される。翻訳阻害剤は翻訳開始複合体はストールので、40S及び60Sの両方のピークも増加することが予想される。しかしながら、非常にしばしば80Sモノソームの増加は、翻訳開始の阻害時に観察される。他のリボソームの複合体の増加が観測されない理由は、現在のところ不明である。一つの可能な説明は、失速したリボソーム複合体との間に偶然の関連が認められアキュムレータにつながる抽出中に発生する可能性があることかもしれない唯一80SモノソームのTiONから。
翻訳開始の分析のほかに、ポリソームプロファイル技術は、（例えば、のeIF4E、eIF4AはとのeIF4Gなど）の翻訳開始因子の同一性を確認し、新規な翻訳調節因子を同定することを助けることができる。翻訳開始因子が、翻訳開始最後のステップでリボソームから放出されると、それらはリボソーム分画を平行移動にわたって検出されるべきではない。ポリソームと非ポリソーム画分の両方を持つようFMRP 14、SMN 19,20、TDRD3 21のようなタンパク質の会合は、翻訳におけるこれらのタンパク質の調節の役割を開始段階に限定されるものではないことを示しています。ポリソームとのタンパク質の会合をモニターすることもストレス条件は、特定のタンパク質の翻訳活性にどのような影響を与えるかを評価するための強力な手段を構成する。しかし、それだけでポリソームとの特異的なタンパク質の会合は、翻訳ROLを締結するのに十分ではありません電子は、機能的研究により確認される必要がある。最後に、ポリソームプロファイル技術は、種々の条件下で特定のmRNAの翻訳活性の決定を可能にする、そのようなmiRNA媒介翻訳抑制22として翻訳を調節する特異的なメカニズムを調べるため。ソーム解析の一般的な使用は、ゲノムワイドなマイクロアレイ解析を含む下流の様々なアプリケーションを使用して拡張することができ、最近23〜26のプロファイリングトランスクリプトースケールのリボソームはタンパク質発現の強固な予測を可能にし、より重要なのは、新しい強力な実験的なツールを提供翻訳制御23〜27の解析のための。
いずれの方法論と同様に、予防措置はポリソームプロファイリングを実行している間取られる必要がある。この点において、そのような細胞継代、細胞溶解、勾配上にロードされる細胞抽出物の量、およびRNA完全性のような複数のパラメータは、当cとすべきontrolled。超遠心分離条件の最適化もまた、ショ糖勾配を通してリボソーム集団の最良の分離を得るために必要とされる。スクロースおよび界面活性剤などの勾配および溶解緩衝液を構成する成分は、254 nmの波長で吸光度を与えることができる。それだけで、溶解緩衝液を含む対照勾配を含めることが重要である。最後に、自身が勾配の最小限の摂動として慎重に扱われるべき勾配がポリソームプロファイルに大きな影響を与えます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
PAは、ラバル大学の医学部からの奨学金の受取人 "ピエール·デュラン」です。ポリソーム精留塔をRMに自然科学とカナダの工学研究会（MOP-CG095386）によってサポートされていたこの作品は、RMR Mにイノベーション助成金のためのカナダの財団（MOP-GF091050）を通じて取得した新しいCIHR研究者の給与賞を保持している。
私たちは、博士に感謝しています。有益な助言のためのE. Khandjian、I. Gallouzi、S.ジ - マルコとA. Cammas。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
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