Summary
Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.
Abstract
O controle preciso da tradução do mRNA é fundamental para a homeostase da célula eucariótica, em particular na resposta ao stress fisiológico e patológico. Alterações deste programa pode conduzir ao crescimento de células danificadas, uma indicação de desenvolvimento de cancro, ou a morte prematura das células, tal como visto nas doenças neurodegenerativas. Muito do que se conhece sobre a base molecular para o controlo da tradução foi obtido a partir de análise de polissoma usando um sistema de fraccionamento de gradiente de densidade. Esta técnica baseia-se na ultracentrifugação de extractos citoplasmáticos de um gradiente linear de sacarose. Uma vez que a rotação é completado, o sistema permite o fraccionamento e quantificação de zonas correspondentes a centrifugadas traduzindo diferente ribossomos populações, resultando, assim, em um perfil de polissoma. As alterações no perfil de polissoma são indicativos de alterações ou defeitos de iniciação da tradução que ocorrem em resposta a vários tipos de stress. Esta técnica também permite avaliar the papel de proteínas específicas no início da tradução e, para medir a atividade de translação de mRNAs específicos. Aqui descrevemos o nosso protocolo para realizar perfis de polissomas, a fim de avaliar a iniciação da tradução de células e de tecidos eucarióticos, em condições de crescimento normais ou de stress.
Introduction
As células eucarióticas encontrar constantemente uma gama de condições de estresse fisiológicos e ambientais nocivos que exigem uma resposta celular adaptativa rápida. Resposta ao estresse celular envolve um equilíbrio preciso entre anti-sobrevivência e pró-sobrevivência fatores atuando. Perturbar este equilíbrio pode ter consequências irreversíveis que levam ao desenvolvimento de patologias humanas, como câncer e doenças neurodegenerativas. Durante o primeiro passo da resposta ao stress, as células de activar as vias pró-sobrevivência que envolvem o controlo coordenado de alterações na expressão do gene ao nível da tradução do mRNA.
tradução do mRNA em eucariotos é um processo celular complexo que envolve interações coordenadas entre os fatores de iniciação da tradução (EIFS), proteínas de ligação de RNA específico (RBDs) e moléculas de RNA 1. tradução do mRNA é dividido em três fases distintas: iniciação, alongamento e terminação. Embora todas as três fases estão sujeitos a regulamenmecanismos reguladoras nacionais, os mecanismos de controlo da tradução como alvo principalmente na fase de iniciação da tradução, que assim constitui o passo limitante da taxa de síntese de proteína 2.
De iniciação da tradução é um processo altamente ordenadas que começa com a formação da eIF2a.GTP.Met-ARNt eu Met complexo ternário e sua subsequente ligação à subunidade 40S do ribossoma, levando à formação do complexo de pré-iniciação. O próximo passo é o recrutamento do complexo de pré-iniciação de ARNm, que envolve a actividade de factores de iniciação da tradução, tais como eIF4F e eIF3. O complexo de pré-iniciação 48S assim formado sofre alterações conformacionais específicos que permitem que esta maquinaria para iniciar a digitalização da região 5 'não traduzida do mRNA, até que reconhece o codão de iniciação agosto A maioria dos fatores de iniciação da tradução são então liberados e 60 subunidades são recrutados para formar um ribossomo 80S complexo competente para a tradução, umat que começa síntese protéica ponto (Figura 1). Mais do que uma 80S monosome pode ser traduzindo o mesmo mRNA de cada vez produzindo assim chamados polissomas (ou polirribossomas). A densidade de polissomas num ARNm reflecte a iniciação, elongação e taxas de terminação e, assim, é uma medida da traductibilidade de um transcrito particular. No entanto, em polissoma perfil é utilizado principalmente para avaliar alterações na tradução do mRNA na etapa de iniciação. Aqui utilizámos um inibidor de proteassoma, como inibidor de iniciação da tradução. O tratamento de células cancerosas com esta droga induz uma resposta ao estresse caracteriza-se pela ativação do estresse chamado HRI quinase que fosforila o fator de iniciação da tradução eIF2a 3. A fosforilação de eIF2a é um dos principais eventos que levam à inibição da iniciação da tradução, em células de mamíferos 4.
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Protocol
O protocolo a seguir as orientações aprovado pelo Conselho de Revisão Ética de Laval.
1. Preparação de culturas de células e Manipulação do cérebro
- As células de mamíferos e de Drosophila
- Crescer HeLa células de câncer cervical e células embrionárias Schneider Drosophila como recomendado pela American Type Culture Collection. Trabalhar com células em uma passagem baixa.
- Células da placa, a fim de atingir 80% de confluência no dia da experiência. Para melhores resultados, utilizar ~ 12 x 10 6 de células para cada condição experimental. Antes de fazer extratos para análise polysome, estimular a tradução através da adição de meio completo fresco por pelo menos 90 min.
- Isolamento Cérebro: Isolar cérebros de camundongos com idade entre 9 e 16 dias após o nascimento. A eutanásia envolve inalação de CO 2 após anestesia e deslocamento cervical. Após o sacrifício, isolar todo o cérebro e quer lugar it a -80 ° C ou transferi-lo diretamente no frio PBS 1X, para uso imediato.
2. Preparação do Sistema de Gradiente de Densidade Fracionamento
- Lavar o sistema de tubagem com 0,1% de SDS durante 5 minutos.
- Lavar o sistema de tubos com 70% de etanol durante 5 minutos, em seguida, com solução RNaseZAP durante 5 min antes de lavá-la com água DEPC.
- Bomba de ar, a fim de secar o sistema de tubagem do aparelho.
3. Preparação dos gradientes de sacarose
- Adicione 15% e 55% de soluções de sacarose em 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, e 1 mM de DTT.
- Gerar a 15-55% de gradiente linear de sacarose utilizando um Isco Modelo 160 gradiente anterior, conforme descrito nas instruções do fabricante. No entanto, é importante para controlar bem a velocidade de TRIS bomba peristáltica, a fim de evitar a criação de bolhas ou de turbulências nos gradientes. Manter os gradientes a 4 ° C até à sua utilização.
- Durante o tempo em que o programa de formador de gradiente está em execução, esfriar a ultracentrífuga a 4 ° C.
4. Preparação de celular e cérebro do rato Extratos
- Preparação de Extratos celulares
- Coloque placa (s) em células de gelo e lavagem 3x com PBS frio 1X.
- Células colheita (~ 12 x 10 6) em 1 ml de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1% Nonidet P40, 5 U de inibidor / ml de RNase, suplementado com mini tabletes completos inibidor de protease cocktail livre de EDTA), transferi-los para um tubo de Eppendorf, e misture bem, passando-os 15x através de uma seringa 1cc U100 Insulina 28 G 1/2. Deixe o ligado de células repousar em gelo durante 15 min.
- Coloque algumas gotas de lisado de células numa lâmina de avaliar a lise celular por meio da observação de um microscópio de contraste de fase com uma objectiva 10X. Somente os núcleos devem estar visíveis e sem membranas celulares devem ser atestando visível para a lise celular. Como controle, observecélulas não lisadas.
- Clarificar o ligado celular por centrifugação a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter o lisado solúvel contendo os polirribossomas.
- Preparação do cérebro do rato Extratos
- Homogeneizar o cérebro inteiro isolado (~ 500 mg) por 10 movimentos de um homogeneizador Dounce gelado com 2 ml de tampão de lise e clarificação do homogenado por centrifugação a 11.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Carrega-se o sobrenadante resultante sobre uma almofada de sacarose a 50% e prosseguir com a sedimentação durante 2 h a 200.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento translúcido contendo os polirribossomas em 1 ml de tampão de lise e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo. Deixe o resto suspensão sobre o gelo por 30 minutos antes de carregar em gradientes.
5. Carregando os extratos em sacarose gradientes e Ultracentrifugação
- Medir a concentraçãode ARN presente no extracto citoplasmático utilizando um espectrofotómetro. Devagar e com cuidado carregar ~ 20 unidades de DO 260 do extracto sobre o gradiente de sacarose de 15% a 55%. Certifique-se de que não é de 2-3 mm de espaço disponível na superfície do tubo, para evitar transbordamento dos tubos, durante a centrifugação.
- Centrifugar os gradientes utilizando uma ultra-centrifugadora durante 2 h 30 min a 230.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. Quando termina a centrifugação, remover os tubos e colocá-los no gelo com cuidado para não perturbar os gradientes.
6. Fracionamento de extratos citoplasmáticos para polissomos Profiling
- Coloque gradientes de sacarose no Sistema Automatizado de fraccionamento de densidade e prosseguir com fraccionamento automatizado e recolha de fracções (0,5 ml cada), tal como descrito pelo fabricante.
- Recolhe cada fracção (~ 500 mL) em tubos de Eppendorf individuais, com monitorização contínua da absorvância a 254 nm. Em PARALLel da operação de fracionamento de gradiente, o perfil polyribosomal estará editando no papel gráfico. Como alternativa, use uma unidade de aquisição de dados conectado ao registrador gráfico para ter uma aquisição eletrônica do perfil polysome.
- No final de cada corrida, transferir Eppendorfs coletadas em gelo seco. Neste momento, qualquer loja recolhidas fracções a -80 ° C ou precipitar directamente complexos de ARN-proteína, como se segue.
7. Extração de proteínas e análise
- Para cada fracção recolhida do gradiente de sacarose, adicionar 2 volumes de etanol a 100% frio e deixar complexos de ARN-proteína precipitar a -20 ° C durante a noite.
- Centrifugar cada precipitado de ARN-proteína a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C, em seguida, lava-se com etanol a 70%. Seco e ressuspender o precipitado em tampão de amostra de SDS-PAGE antes de prosseguir com a Western blot usando anticorpos específicos (ver Figura 2).
8. Extração de RNA e Análise
- Precipitar complexos RNA-proteína como na secção 7.1. Ressuspender cada precipitado de ARN-proteína no tampão de lise contendo 0,1% de SDS. Digerir o componente proteína do precipitado com 2 mg / ml de proteinase K, durante 30 minutos num banho de água a 55 C °.
- Extrair os componentes de ARN precipitado por adição de 1 volume de "fenol: clorofórmio", 2 volumes de clorofórmio, e 0,1 volume de NaOAc 2 M pH 4, e centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 20 min. O precipitado de ARN a partir da fase aquosa resultante de cada amostra durante a noite a -20 ° C pela adição de um volume de isopropanol e de 0,2 mg / mL de glicogénio. Girar-se o precipitado durante 1 hora a 10.000 x g a 4 ° C. Lavar o sedimento de ARN com etanol a 70% frio.
- Ressuspender o sedimento de ARN em um pequeno volume de ARNase isenta de água. Avaliar a quantidade e qualidade de RNA utilizando o espectrofotómetro.
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Representative Results
Como referido acima, polysome perfil permite a análise de mudanças de iniciação da tradução em condições de estresse. Figura 1 é uma visão simplificada de iniciação da tradução, que, conforme descrito anteriormente é um processo de várias etapas que envolvem um conjunto ordenado de complexos de iniciação da tradução. Em condições normais de crescimento, os complexos de iniciação da tradução são convertidos em polirribossomos cuja detecção por perfil polysome atestam para uma iniciação da tradução ativa (Figura 2; não tratada). Sob condições de stress no entanto, de iniciação da tradução está bloqueada resultando na acumulação de 80S monosomes e uma redução dos picos de polissomas (Figura 2; inibidor de proteassoma).
Figura 1. Um s vista implified de iniciação da tradução. Iniciação da tradução envolve várias etapas: 1) A formação do eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met complexo ternário, 2) a associação do complexo ternário com 40S ribossomos formando o complexo de pré-iniciação 43S, 3) a associação de 43S complexos com mRNA formando o complexo de pré-iniciação 48S, 4) a digitalização da região 5 'não traduzida do ARNm de 48S ribossomas até atingir e identifica o codão de iniciação AUG, e 5) o recrutamento dos grandes subunidade ribossomal 60S para formar o complexo 48S 80S em que ponto polipéptidos começa síntese. Cada etapa de iniciação da tradução envolve a atividade de vários fatores de iniciação da tradução. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 2. Perfis e análise de polissomas polissomas proteínas associadas por western blot em células HeLa (A - B). Extractos citoplasmáticos foram preparados a partir de células HeLa cultivadas, quer em condições normais (A) ou após tratamento com o inibidor de proteassoma, durante 4 h (B ) e centrifugada num 15-55% v / w gradiente linear de sacarose. Perfis polissomos são indicados no painel superior. As posições dos ribossomos 40S, 60S, 80S monosomes ribossomos e polissomos são indicados em cada perfil. As fracções a partir do topo (15%) para a parte inferior (55%) do gradiente são mostrados a partir da esquerda para a direita. As fracções foram recolhidas e analisadas por western blot (painéis inferiores) com anticorpos contra a proteína grande L28 ribossomal bem como com a proteína associada FMRP-polissoma que servem como controlos para a integridade polissoma 5,6. Note-se que tretamento com o inibidor de proteassoma reduz polissomas picos com um concomitante aumento 80S monosomes indicando uma inibição da iniciação da tradução. Perfis típicos obtidos a partir de células de Drosophila Schneider ou camundongos cérebro foram descritos em outro 7-10. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
A análise do perfil de polissoma em gradientes de sacarose permite a medição da iniciação da tradução através da análise da densidade de polissomas isolados a partir de células ou tecidos de 9,11-14. Esta técnica é a melhor (se não o único) abordagem para medir a iniciação da tradução in vivo. Ele é utilizado para monitorizar o estado de crescimento de células de translação durante o ciclo de célula 15, e para avaliar os efeitos de vários tipos de stress, incluindo infecções virais, hipoxia, 13,16 radiação 17, e drogas químicas 18 utilizados em terapia, por iniciação da tradução. No entanto, enquanto que esta técnica funciona bem para avaliar o início da tradução de culturas de células e tecidos específicos, tais como cérebro e fígado, ele continua a ser estabelecida se que pode ser usado para comparar a iniciação da tradução de tecidos normais versus doentes e tumores.
Alterações nos perfis polissomas também pode ocorrer em condições que alteram a tradução elongaçãoção ou rescisão. Nestes casos, a inibição da taxa de alongamento de tradução irá levar a um aumento de polissomas picos enquanto uma inibição de terminação deve resultar em polissomas grandes em relação ao controle. Em contraste, os inibidores de evitar a iniciação da tradução de reformação polissomas porque a formação de complexos de iniciação da tradução activas está bloqueada. Isso se reflete em perfis polissomos por uma redução de polissomos picos com um aumento concomitante de 80S monosomes. Porque inibidores de tradução parar complexos de iniciação da tradução, espera-se que ambos os anos 40 e 60S picos também irá aumentar. No entanto, muitas vezes é observado um aumento em apenas 80S monosomes sobre a inibição da iniciação da tradução. A razão pela qual um aumento nos outros complexos ribossómicos não é observada é actualmente desconhecido. Uma possível explicação poderia ser que a associação fortuita entre complexos ribossomais paralisadas podem ocorrer durante a extração levando à acumulação observadação de apenas 80S monosomes.
Além da análise de iniciação da tradução, polysome técnica perfil pode ajudar a confirmar a identidade de fatores de iniciação de tradução (como eIF4E, eIF4A e eIF4G) e para identificar novos reguladores de tradução. Como fatores de iniciação da tradução são liberados de ribossomos na última etapa de iniciação da tradução, eles não devem ser detectados mais de traduzir ribossomos frações. A associação de proteínas, tais como FMRP 14, SMN 19,20, TDRD3 21 com ambos os polissomas e fracções não polissomas indica que o papel regulador na tradução destas proteínas não está restrito ao passo de iniciação. Acompanhamento da associação de proteínas com polissomos também constitui um poderoso meio para avaliar como as condições de estresse pode afetar a atividade de translação de proteínas específicas. No entanto, a associação de proteínas específicas com polissomos por si só, não é suficiente para concluir um rol de translaçãoe, que, em seguida, deve ser confirmado por estudos funcionais. Por fim, a técnica de perfil polysome permite a determinação da atividade de translação de mRNAs específicos sob várias condições, e para o exame de mecanismos específicos que regulam a tradução como miRNA mediada repressão translacional 22. O uso geral de análise polysome pode ser prorrogado usando uma variedade de aplicações a jusante, incluindo a análise microarray do genoma e, mais recentemente, o ribossomo transcriptoma escala de perfil 23-26 permitindo a previsão robusta de expressão de proteínas e mais importante fornecer uma nova e poderosa ferramenta experimental para análise de controle de translação 23-27.
Como acontece com qualquer metodologia, as precauções devem ser tomadas durante a execução polysome perfil. A este respeito, vários parâmetros, tais como a passagem de células, lise de células, a quantidade de extracto de células a serem carregados para o gradiente, e a integridade do RNA devem ser bem controlled. Optimização das condições de ultracentrifugação é também necessária a fim de obter a melhor separação da população do ribossoma através de gradientes de sacarose. Os componentes que constituem os gradientes e tampão de lise, tais como sacarose e detergentes, podem dar a absorvância no comprimento de onda de 254 nm. Assim, é importante incluir um gradiente de controle contendo tampão de lise apenas. Finalmente, os próprios gradientes devem ser manuseados com cuidado como perturbação mínima de gradientes pode causar enormes efeitos sobre perfis polissomos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
PA é um beneficiário de uma bolsa "Pierre Durand" pela Faculdade de Medicina da Universidade de Laval. Este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e Engenharia Research Council of Canada (MOP-CG095386) para RM O fraccionamento polysome foi adquirida através de uma Fundação Canadense para concessão inovação (MOP-GF091050) para RMR M tem um novo prêmio salário investigador CIHR.
Somos gratos aos drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco e A. Cammas para conselhos úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
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