Summary
Qui, descriviamo un metodo per analizzare le modifiche l'apertura di traduzione dell'mRNA di cellule eucariotiche in risposta alle condizioni di stress. Questo metodo si basa sulla separazione velocità su gradienti di saccarosio di traduzione ribosomi da ribosomi non traslanti.
Abstract
Controllo preciso della traduzione dell'mRNA è fondamentale per l'omeostasi cellula eucariotica, in particolare in risposta allo stress fisiologico e patologico. Alterazioni di questo programma può portare alla crescita di cellule danneggiate, una caratteristica di sviluppo del cancro, o morte cellulare prematura come visto nelle malattie neurodegenerative. Molto di ciò che è noto riguardante la base molecolare per controllo traduzionale è stato ottenuto dall'analisi polisoma utilizzando un sistema di frazionamento gradiente di densità. Questa tecnica si basa sulla ultracentrifugazione di estratti citoplasmatici su un gradiente lineare di saccarosio. Una volta che lo spin è completato, il sistema consente di frazionamento e la quantificazione delle zone centrifugati corrispondenti a diverse popolazioni traduzione ribosomi, risultando così in un profilo polisoma. Cambiamenti nel profilo polisoma sono indicativi di modifiche o difetti di inizio della traduzione che si verificano in risposta a vari tipi di stress. Questa tecnica permette anche di valutare the ruolo di specifiche proteine sulla traduzione iniziazione, e per misurare l'attività traduzionale di specifici mRNA. Qui si descrive il protocollo di eseguire profili polisoma per valutare inizio della traduzione di cellule e tessuti eucariotiche in condizioni di crescita sia normali o di stress.
Introduction
Le cellule eucariotiche incontrano costantemente una serie di condizioni nocive di stress fisiologici e ambientali che richiedono una rapida risposta cellulare adattiva. Risposta allo stress cellulare comporta un preciso equilibrio tra anti-sopravvivenza e pro-sopravvivenza fattori che agiscono. Perturbare questo equilibrio può avere conseguenze irreversibili che portano allo sviluppo di patologie umane come il cancro e le malattie neurodegenerative. Durante la prima fase della risposta allo stress, cellule attivano percorsi pro-sopravvivenza che coinvolgono il controllo coordinato di cambiamenti nell'espressione genica a livello della traduzione dell'mRNA.
Traduzione mRNA negli eucarioti è un processo cellulare complesso che coinvolge le interazioni coordinate tra i fattori di inizio della traduzione (EIF), proteine leganti RNA specifico (RBDS) e molecole di RNA 1. Traduzione mRNA è diviso in tre distinte fasi: inizio, allungamento e terminazione. Anche se tutte e tre le fasi sono soggette a regoMeccanismi lamentazione, meccanismi di controllo traslazionale colpiscono soprattutto la fase di inizio della traduzione, che costituisce quindi il fattore limitante della sintesi proteica 2.
Inizio della traduzione è un processo altamente ordinato che inizia con la formazione della eIF2a.GTP.Met-tRNA I Met complesso ternario e il suo successivo legame alla subunità 40S ribosoma, che porta alla formazione del complesso di pre-apertura. Il passo successivo è l'assunzione del complesso preinitiation di mRNA, che comporta l'attività dei fattori di inizio della traduzione come eIF4F e eIF3. Il complesso preinitiation 48S così formato sottoposto a specifici cambiamenti conformazionali che consentono tale macchinari per avviare la scansione della regione 5'-non tradotta dell'mRNA fino a quando non riconosce il codone di inizio agosto La maggior parte dei fattori di inizio della traduzione vengono poi rilasciati e 60S subunità sono reclutati per formare un complesso 80S ribosoma competente per la traduzione, unt che proteina punto inizia sintesi (Figura 1). Più di un 80S monosome può essere traducendo lo stesso mRNA in un momento produrre cosiddetti polisomi (o poliribosomi). La densità di polisomi su un mRNA riflette l'inizio, allungamento e tariffe di terminazione e quindi è una misura della traducibilità di un particolare trascrizione. Tuttavia, polisoma profilo viene utilizzato principalmente per valutare i cambiamenti nella traduzione dell'mRNA nella fase di iniziazione. Qui abbiamo usato un inibitore del proteasoma, come inibitore di inizio della traduzione. Il trattamento delle cellule tumorali con questo farmaco induce una risposta allo stress caratterizzato dall'attivazione della chinasi sollecitazione denominato HRI che fosforila il fattore di inizio della traduzione eIF2a 3. La fosforilazione di eIF2a è uno dei maggiori eventi che portano alla inibizione di inizio della traduzione in cellule di mammifero 4.
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Protocol
Il protocollo segue le linee guida approvato dal Ethical Review Board di Laval.
1. Preparazione di colture cellulari e Brain manipolazione
- Cellule di mammiferi e Drosophila
- Crescere HeLa cellule tumorali del collo dell'utero e le cellule embrionali Schneider Drosophila come raccomandato dalla American Type Culture Collection. Lavora con cellule a un passaggio basso.
- Cellule piastra in modo da raggiungere l'80% di confluenza il giorno dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare ~ 12 x 10 6 cellule per ogni condizione sperimentale. Prima di effettuare estratti per l'analisi polisoma, stimolare traduzione aggiungendo mezzo fresco completa per almeno 90 min.
- Isolamento Cervello: Isolare cervelli di topi di età compresa tra 9 e 16 giorni dopo il parto. Eutanasia coinvolge CO 2 inalazione dopo l'anestesia e dislocazione cervicale. Dopo il sacrificio, isolare l'intero cervello e sia posto it a -80 ° C o trasferire direttamente in PBS 1X per l'uso immediato.
2. Preparazione del gradiente di densità Frazionamento del sistema
- Lavare il sistema di tubi con 0.1% SDS per 5 min.
- Lavare il sistema di tubi con etanolo al 70% per 5 minuti, poi con RNaseZAP soluzione per 5 minuti prima di lavare con acqua DEPC.
- Pompare aria per asciugare il sistema di tubi dell'apparato.
3. Preparazione dei gradienti di saccarosio
- Rendere soluzioni di saccarosio del 15% e 55% in 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 1.25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, e 1 mM DTT.
- Generare il 15-55% gradiente di saccarosio lineare utilizzando un Isco Modello 160 gradiente ex, come descritto dalle istruzioni del produttore. Tuttavia, è importante controllare bene la velocità della pompa peristaltica TRIS per evitare la creazione di bolle o turbolenze nei gradienti. Mantenere i gradienti a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Durante il tempo in cui il programma gradiente caffè è in esecuzione, raffreddare ultracentrifuga a 4 ° C.
4. Preparazione di Cell and Brain Estratti mouse
- Preparazione di estratti cellulari
- Luogo piastra (s) su cellule di ghiaccio e lavare 3 volte con PBS freddo 1X.
- Celle di raccolta (~ 12 x 10 6) in 1 ml di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl a pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 inibitore U / ml RNasi, integrato con completi mini-free EDTA inibitore della proteasi cocktail compresse), trasferirli in una provetta Eppendorf, e mescolare bene passando loro 15x attraverso una siringa 1cc insulina U100 28 G 1/2. Sia il lisato cellulare riposare su ghiaccio per 15 min.
- Mettere alcune gocce di lisato cellulare su un vetrino per valutare lisi cellulare osservando in un microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 10X. Solo i nuclei devono essere visibili e senza membrane cellulari dovrebbero attestare visibili lisi cellulare. Come controllo, osservarele cellule non lisati.
- Chiarire il lisato cellulare mediante centrifugazione a 11.000 xg per 20 min a 4 ° C e mantenere il lisato solubile contenente le poliribosomi.
- Preparazione del cervello Estratti mouse
- Omogeneizzare l'intero cervello isolato (~ 500 mg) da 10 colpi in un omogeneizzatore Dounce ghiacciata con 2 ml di tampone di lisi e chiarire l'omogeneizzato mediante centrifugazione a 11.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Caricare il supernatante risultante su un cuscino di 50% di saccarosio e procedere con sedimentazione per 2 ore a 200.000 xg usando un rotore ultracentrifuga TH-641 a 4 ° C.
- Risospendere il pellet traslucido contenente le poliribosomi in 1 ml di tampone di lisi e mescolare bene pipettando su e giù. Lasciare riposare sospensione sul ghiaccio per 30 minuti prima di caricare su gradienti.
5. Caricamento dei Estratti sui gradienti di saccarosio e ultracentrifugazione
- Misurare la concentrazionedi RNA presenti nell'estratto citoplasmatico utilizzando uno spettrofotometro. Caricare con attenzione e lentamente ~ 20 OD 260 unità dell'estratto sul gradiente di saccarosio 15% al 55%. Assicurarsi che ci sia 2-3 mm di spazio disponibile sulla superficie del tubo per evitare traboccante le provette durante la centrifugazione.
- Centrifugare i gradienti utilizzando un ultra-centrifuga per 2 h 30 min a 230.000 xg usando un rotore ultracentrifuga TH-641 a 4 ° C. Quando termina la centrifugazione, rimuovere i tubi e disporli sul ghiaccio con attenzione per non disturbare i gradienti.
6. Frazionamento di estratti citoplasmatici di polisomi Profiling
- Posizionare gradienti di saccarosio in Automated Densità Frazionamento sistema e procedere con frazionamento automatizzata e raccolta di frazioni (0,5 ml ciascuna), come descritto dal produttore.
- Raccogliere ogni frazione (~ 500 microlitri) in singoli tubi Eppendorf con monitoraggio continuo di assorbanza a 254 nm. In parallel dell'operazione di frazionamento gradiente, il profilo polyribosomal sarà la modifica sulla carta grafico. In alternativa, utilizzare una unità di acquisizione dati collegato al registratore grafico per avere un'acquisizione elettronico del profilo polisoma.
- Al termine di ogni corsa, trasferire eppendorfs raccolti su ghiaccio secco. A questo punto, sia negozio frazioni raccolte a -80 ° C o precipitare direttamente complessi proteina-RNA come segue.
7. Estrazione di proteine e analisi
- Per ogni frazione raccolta del gradiente di saccarosio, aggiungere 2 volumi di etanolo 100% freddo e lasciate complessi RNA-proteina precipitano a -20 ° C per una notte.
- Centrifugare ogni precipitato RNA-proteina a 11.000 xg per 20 min a 4 ° C e poi lavare con etanolo al 70%. Lavaggio e risospendere il precipitato in tampone campione SDS-PAGE prima di procedere con Western blot utilizzando anticorpi specifici (vedi Figura 2).
8. RNA Estrazione e AANALISI
- Precipitare complessi RNA-proteina, come nella sezione 7.1. Risospendere ogni precipitato RNA-proteina in tampone di lisi contenente 0,1% SDS. Digerire la componente proteica del precipitato con 2 mg / ml proteinasi K per 30 minuti in un bagno d'acqua a 55 °.
- Estrarre componenti RNA precipitato per aggiunta di 1 volume di "fenolo: cloroformio", 2 volumi di cloroformio e 0,1 volume di 2 M NaOAc pH 4 e centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C per 20 min. RNA precipitato dalla fase acquosa risultante di ciascun campione per una notte a -20 ° C con l'aggiunta di 1 volume di isopropanolo e 0,2 mg / mL di glicogeno. Spin il precipitato per 1 ora a 10.000 xga 4 ° C. Lavare il pellet di RNA con il 70% di etanolo freddo.
- Risospendere il pellet di RNA in un piccolo volume di acqua RNasi libero. Valutare la quantità e qualità di RNA con uno spettrofotometro.
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Representative Results
Come suddetto, polisoma profilo consente l'analisi delle variazioni di inizio della traduzione in condizioni di stress. Figura 1 è una vista semplificata di inizio della traduzione che, come descritto in precedenza è un processo multifasico che coinvolge un insieme ordinato di complessi di inizio della traduzione. In condizioni normali di crescita, complessi di inizio della traduzione sono convertiti in poliribosomi cui il rilevamento da profilo polisoma attestare per un'iniziazione traduzione attiva (Figura 2; non trattato). In condizioni di stress però inizio della traduzione è bloccato conseguente accumulo di 80S monosomes e una riduzione dei picchi polisoma (Figura 2; inibitore del proteasoma).
Figura 1. A s Vista implified di inizio della traduzione. Iniziazione Traduzione prevede diversi passaggi: 1) La formazione del eIF2a.GTP.Met-tRNA ho incontrato complesso ternario, 2) l'associazione del complesso ternario con 40S dei ribosomi che formano il complesso preinitiation 43S, 3) l'associazione di 43S complessi con mRNA Formando il 48S preinitiation complesso, 4) scansione regione 5'-non tradotta dell'mRNA di 48S ribosomi fino a raggiungere e identifica l'iniziazione codone AUG, e 5) assunzione delle subunità ribosomiale 60S 48S per formare il complesso 80S a quel punto polipeptidi inizio di sintesi. Ogni passo di inizio della traduzione comporta l'attività di diversi fattori di inizio della traduzione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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. Figura 2 profili polisomi e analisi di polisomi associati proteine mediante western blot in cellule HeLa (A - B). Estratti citoplasmatici sono stati preparati da cellule HeLa coltivate in condizioni normali (A) o dopo il trattamento con l'inibitore di proteasoma per 4 hr (B ) e centrifugato su un 15-55% v / w gradiente lineare di saccarosio. Profili polisomi sono indicati nel pannello superiore. Le posizioni dei ribosomi 40S, 60S, 80S dei ribosomi monosomes, e polisomi sono indicati in ogni profilo. Frazioni dalla cima (15%) al fondo (55%) del gradiente sono indicati da sinistra a destra. Le frazioni sono state raccolte e analizzate mediante western blot (pannelli inferiori) con anticorpi contro il grande proteina ribosomale L28 nonché con la proteina FMRP polisoma-associata che servono come controlli di integrità polisoma 5,6. Si noti che treatment con l'inibitore del proteasoma riduce polisomi picchi con un concomitante aumento di 80S monosomes indicano una inibizione di inizio della traduzione. Profili tipici ottenuti da cellule di Drosophila Schneider o topi cervello sono state descritte altrove 7-10. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
L'analisi del profilo polisoma su gradienti di saccarosio consente la misurazione di inizio della traduzione analizzando la densità di polisomi isolati da cellule o tessuti 9,11-14. Questa tecnica è la migliore (se non l'unico) metodo per misurare inizio della traduzione in vivo. E 'utilizzato per monitorare lo stato traduzionale di crescita delle cellule durante il ciclo cellulare 15, e per valutare gli effetti di vari tipi di stress comprese le infezioni virali, ipossia 13,16, radiazioni 17 e droghe chimiche 18 utilizzato nella terapia, sulla inizio della traduzione. Tuttavia, mentre questa tecnica funziona bene per valutare inizio della traduzione di colture cellulari e tessuti specifici come il cervello e il fegato, rimane da stabilire se può essere utilizzata per confrontare inizio della traduzione di normali rispetto tessuti malati e tumori.
Cambiamenti nei profili polisoma possono verificarsi anche in condizioni che alterano la traduzione allungamentozione o cessazione. In questi casi, l'inibizione di tassi di allungamento della traduzione porterà ad un aumento di polisomi picchi mentre una inibizione di terminazione dovrebbe comportare polisomi grandi relativi al controllo. Al contrario, gli inibitori di inizio della traduzione impediscono riforma del polisomi perché la formazione di complessi inizio della traduzione attivi è bloccato. Ciò si riflette in profili polisomi da una riduzione di polisomi picchi con un concomitante aumento di 80S monosomes. Poiché gli inibitori traduzione stallo complessi di inizio della traduzione, si prevede che sia 40S e 60S picchi anche aumentare. Tuttavia, molto spesso un aumento solo 80S monosomes è osservato dopo inibizione di inizio della traduzione. Il motivo per cui un aumento degli altri complessi ribosomali non si osserva è attualmente nota. Una possibile spiegazione potrebbe essere che fortuita associazione tra complessi ribosomali stallo può verificarsi durante l'estrazione che porta all'accumulo osservatozione di soli 80S monosomes.
Accanto all'analisi di inizio della traduzione, polisoma tecnica profilo consente di confermare l'identità dei fattori di inizio della traduzione (come eIF4E, eIF4A e eIF4G) e per identificare nuovi regolatori di traduzione. Come fattori di inizio della traduzione vengono rilasciati dai ribosomi durante l'ultima fase di inizio della traduzione, non dovrebbero essere rilevati nel corso tradurre ribosomi frazioni. L'associazione di proteine come FMRP 14, SMN 19,20, TDRD3 21 con entrambe polisomi e frazioni non polisomi indica che il ruolo regolatore di queste proteine nella traduzione non è limitata alla fase di iniziazione. Monitorare l'associazione di proteine con polisomi costituisce anche un potente mezzo per valutare come le condizioni di stress possono influenzare l'attività traslazionale di proteine specifiche. Tuttavia, l'associazione di specifiche proteine con polisomi di per sé non è sufficiente per concludere un rol traslazionalee, che deve poi essere confermato da studi funzionali. Infine, la tecnica profilo polisoma consente determinazione dell'attività traduzionale di specifici mRNA in varie condizioni, e per l'esame di specifici meccanismi che regolano traduzioni come miRNA mediata repressione traduzionale 22. L'uso generale di analisi polisoma può essere ulteriormente estesa utilizzando una varietà di applicazioni a valle compresa l'analisi microarray genoma di ampiezza e più recentemente il ribosoma transcriptome scala profilatura 23-26 consentendo robusta previsione di espressione proteica e soprattutto fornendo un nuovo strumento sperimentale potente per l'analisi di controllo traduzionale 23-27.
Come con qualsiasi metodologia, le precauzioni devono essere prese durante l'esecuzione di polisoma profiling. A questo proposito, i parametri multipli come cellulare di passaggio, lisi cellulare, la quantità di estratto cellulare da caricare sul gradiente, e l'integrità dell'RNA devono essere ben controlled. Ottimizzazione delle condizioni ultracentrifugazione è anche necessario per ottenere la migliore separazione della frazione ribosomale attraverso i gradienti di saccarosio. I componenti che costituiscono i gradienti e tampone di lisi come saccarosio e detergenti, possono dare assorbanza a lunghezza d'onda 254 nm. E 'quindi importante includere un gradiente di controllo contenente solo tampone di lisi. Infine, i gradienti stessi devono essere maneggiati con cautela, come minimo perturbazione dei gradienti può causare effetti enormi sui profili polisomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
PA è un destinatario di una borsa di studio "Pierre Durand" presso la Facoltà di medicina di Laval University. Questo lavoro è stato supportato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (MOP-CG095386) a RM La colonna di frazionamento polisoma è stato acquisito attraverso una Fondazione canadese per l'innovazione concessione (MOP-GF091050) per RMR M in possesso di un nuovo premio di stipendio investigatore CIHR.
Siamo grati a Drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di Marco e A. Cammas per consigli utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
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