Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Résumé

Un contrôle précis de la traduction des ARNm est fondamentale pour l'homéostasie des cellules eucaryotes, en particulier en réponse à un stress physiologique et pathologique. Des modifications de ce programme peuvent conduire à la croissance des cellules endommagées, une caractéristique de développement de cancer, ou à une mort cellulaire prématurée tel que vu dans les maladies neurodégénératives. Une grande partie de ce qui est connu au sujet de la base moléculaire pour la commande de translation a été obtenue à partir de polysomes analyse en utilisant un système de fractionnement à gradient de densité. Cette technique repose sur des extraits cytoplasmiques ultracentrifugation sur un gradient de saccharose linéaire. Une fois l'essorage est terminé, le système permet le fractionnement et la quantification des zones correspondant à la traduction centrifugés ribosomes populations différentes, conduisant ainsi à un profil de polysomes. Les changements dans le profil de polysomes sont indicatifs de changements ou de défauts dans l'initiation de traduction qui se produisent en réponse à différents types de stress. Cette technique permet également d'évaluer èmee rôle des protéines spécifiques sur initiation de la traduction, et pour mesurer l'activité de traduction des ARNm spécifiques. Nous décrivons ici notre protocole pour effectuer des profils de polysomes, afin d'évaluer l'initiation de traduction de cellules eucaryotes et des tissus dans des conditions de croissance normales, ou soit contrainte.

Introduction

Les cellules eucaryotes rencontrent constamment une gamme de conditions de stress physiologiques et environnementaux néfastes qui nécessitent une réponse cellulaire adaptative rapide. réponse au stress cellulaire implique un équilibre précis entre anti-survie et pro-survie facteurs agissant. Perturber cet équilibre peut avoir des conséquences irréversibles menant au développement de pathologies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives. Au cours de la première étape de la réaction de stress, les cellules activent des voies pro-survie qui comportent la commande coordonnée des changements dans l'expression génétique au niveau de la traduction....

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices approuvé par la commission d'examen éthique de l'Université Laval.

1. Préparation des cultures de cellules et de manipulation du cerveau

1. Les cellules de mammifères et de Drosophila
   1. Cultiver des cellules HeLa du cancer du col et les cellules embryonnaires Schneider drosophile comme recommandé par l'American Type Culture Collection. Travailler avec des cellules à un passage bas.
   2. Cellules de la plaque afin d'atteindre 80% de confluence le jour de l'expérience. Pour de meilleurs résultats, utilisez ~ 12 x 10 ⁶

Résultats

Comme mentionné précédemment, polysome profil permet l'analyse de l'évolution de l'initiation de traduction dans des conditions de stress. Figure 1 est une vue simplifiée de l'initiation de la traduction qui, comme décrit plus haut est un processus en plusieurs étapes impliquant un assemblage ordonné de complexes d'initiation de traduction. Dans des conditions de croissance normales, les complexes d'initiation de traduction sont convertis en polyribosomes dont la détection par le.......

Discussion

L'analyse de profils de polysomes sur des gradients de saccharose permet la mesure de l'initiation de traduction en analysant la densité de polysomes isolés à partir de cellules ou de tissus ^9,11-14. Cette technique est la meilleure (si ce n'est pas l'Unique) approche pour mesurer initiation de la traduction in vivo. Il est utilisé pour surveiller l'état de translation de la croissance de cellules au cours du cycle cellulaire ^15, et à évaluer les effets de différents ty.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules
HeLa cellules cancéreuses du col de l’utérus	Collection de cultures de type américain (Manassas, VA ; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila cellules embryonnaires	American Type Culture Collection (Manassas, VA ; ATCC)	CRL-1963
Milieu de culture et suppléments
Schneider' s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml	;
DMEM	Life technologies	11995-073	;
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03	;
Pénicilline/streptomycine	Life technologies	15140122
Solutions de saccharose
D-saccharose	Fisher Scientist	BP220-212	;
Glycérol	Sigma-Aldrich	49767	;
Bleu de bromophénol	Fisher Scientist	B3925
Tampon de lyse
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05	;
TNT	Sigma-Aldrich	D 9779	;
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628	;
FDS	Tekniscience	4095-02	;
Inhibiteur de la RNase (Inhibiteur de la ribonucléase recombinante RnaseOUT)	Life technologies	10777-019	;
Antiprotéases (complètes, mini, sans EDTA)	Roche	11,836,170,001	;
Extraction de l’ARN
Protéinase K	Life technologies	AM2542	;
Phénol :chloroforme	Fisher Scientist	BP1754I-400	;
Chloroforme	Fisher Scientist	C298-500	²
Glycogen	Life technologies	10814-010	;
Isopropanol	Acros organics	327270010
Anticorps
anticorps anti-FMRP	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010		;