الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع قدرة عالية على يبلعم أو تبتلع المواد في بيئتهم خارج الخلية. هنا، يوصف مقايسة المطبقة على نطاق واسع وموثوق بها، والكمية غاية لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها من مكونات متشابك.
البلعمة هي العملية التي خلية تبتلع المواد (الخلية بأكملها، وأجزاء من خلية، والحطام، وغيرها) في البيئة خارج الخلية المحيطة بها وبالتالي يساعد على هضم هذه المواد، عادة من خلال تدهور الليزوزومية. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتي تم وصفها في مجموعة واسعة من الشروط من مرض الاعصاب (على سبيل المثال، والتخليص بيتا اميلويد في مرض الزهايمر) لتطور الدماغ صحية (على سبيل المثال، متشابك وظيفة البلعمة التقليم) 1-6. بروتوكول التالية هي فحص الإحاطة وضعت لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة الإحاطة المدخلات قبل المشبكي في الماوس تطوير نظام retinogeniculate 7. في حين تم استخدام هذا الاختبار لتقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا السياق على وجه الخصوص، يمكن استخدام نهج مماثل لتقييم البالعات الأخرى في جميع أنحاء الدماغ (مثل الخلايا النجمية) وباقي الجسم(على سبيل المثال، الضامة الطرفية)، وكذلك السياقات الأخرى التي يحدث فيها إعادة عرض متشابك (على سبيل المثال، إصابات الدماغ / مرض).
الدوائر متشابك يعيد طوال حياة الحيوان. في الدماغ النامية، تشكل نقاط الاشتباك العصبي في الزائدة ويجب أن تخضع التقليم متشابك الذي ينطوي على إزالة انتقائية من مجموعة فرعية من نقاط الاشتباك العصبي وصيانة وتعزيز نقاط الاشتباك العصبي من تلك التي لا تزال 8-10. هذه العملية ضرورية لتحقيق سمة الربط الدقيق للنظام العصبي الكبار. في البالغين، ويمكن أيضا أن تكون نقاط الاشتباك العصبي البلاستيكية، ولا سيما في سياق التعلم والذاكرة. يعتقد أن يرتبط هذا اللدونة الهيكلية لتشمل إضافة و / أو القضاء على العمود الفقري شجيري وحبات قبل المشبكي 11-13. بالإضافة إلى هذه الأدوار في سلامة الجهاز العصبي، وتشارك أيضا في إعادة عرض متشابك العصبي مرض 12،14،15 نظام / إصابة. على سبيل المثال، بعد إصابة الحبل الشوكي، يجب إعادة تشكيلها في وقت لاحق قطعت محاور وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية جديدة لتحقيق الانتعاش 16-19.
الإقليم الشمالي "> الناشئة كجانب هام من اللدونة متشابك هو عملية البلعمة أو الابتلاع من نقاط الاشتباك العصبي متجهة لإزالة 3،5،20. أظهرنا مؤخرا هذه الظاهرة في سياق التقليم متشابك في صحية، وبعد الولادة مخ الفأر 7. على وجه التحديد ، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الجهاز العصبي المركزي وجهاز المناعة البالعات المقيمين عرضت، لتبتلع المدخلات قبل المشبكي خلال فترة الذروة وفي منطقة التقليم متشابك التنموية، والظهرية الجانبية بعد الولادة الركبي النواة (dLGN) من المهاد. الحصار الوراثية أو الدوائية من هذا الغمر أسفرت عن العجز المستمر في اتصال متشابك.في هذا البروتوكول، ونحن تصف مقايسة موثوقة والكمي للغاية لقياس بوساطة بلعمية الإحاطة المدخلات قبل المشبكي. لأغراض هذه المادة، وسيقدم هذا الاختبار في سياق منظومة تطوير retinogeniculate، والذي يتضمن خلايا الشبكية العقدة (RGCs) المقيمين في شبكية العين التيمشروع المدخلات قبل المشبكي إلى dLGN (الشكل 1A). لتبدأ، وسوف يمكن وصفها استراتيجية وضع العلامات تقدمي مقاومة للتدهور الليزوزومية، والذي يستخدم لتصور المدخلات قبل المشبكي RGC محددة في dLGN (الشكل 1) 7،21. بعد هذا الوصف، منهجية مفصلة للتصوير وقياس كميا الغمر باستخدام المجهر متحد البؤر جنبا إلى جنب مع 3 الأبعاد (3D) حجم سطح التقديم سوف تعطى. ويستند هذا المنهج على إعداد الأنسجة ثابتة ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لاستخدامها في دراسات التصوير الحي. الأهم من ذلك، في حين تم التحقق من صحة الفحص في سياق صحي، ونظام retinogeniculate ما بعد الولادة، يمكن للمرء أن يطبق نفس الأساليب الأخرى لتقييم التفاعلات بلعمية الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ وأثناء المرض، فضلا عن وظيفة بلعمية في أجهزة الجسم الأخرى.
من أجل قياس بدقة البلعمة، ويجب أن يكون المسمى المواد غارقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن للباحث تصور مرة واحدة حدث تدهور الليزوزومية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب عالية الدقة والتصوير، تليها استخدام البرمجيات التي تمكن الباحث لتصور حجم الخلية بأكملها وتحديد محتوياته. في ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سميث الأسرة (BS)، ومؤسسة دانا (BS)، جون برنامج علماء ميرك (BS)، NINDS (RO1-NS-07100801؛ BS)، NRSA (F32-NS-066698؛ DPS)، نانسي لوري ماركس مؤسسة (DPS)، المعاهد الوطنية للصحة (P30-HD-18655؛ MRDDRC التصوير الأساسية).
Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
594: C22842 | |||
647: C34778 | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
#55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |