Summary
Болезнь Паркинсона представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое возникает в результате дегенерации допаминергических нейронов в центральной нервной системе, в результате чего передвижения, дефекты. Модели Ротенон болезнь Паркинсона у дрозофилы. В настоящем документе излагаются два анализов, которые характеризуют как спонтанные и поразить индуцированные недостатки передвижения, вызванные ротенона.
Abstract
Болезнь Паркинсона представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое возникает в результате дегенерации допаминергических нейронов в центральной нервной системе, прежде всего, в черной субстанции. Болезнь вызывает двигательные недостатки, которые представляют как жесткость, тремор и деменции у людей. Ротенон является инсектицид, который вызывает окислительное повреждение путем ингибирования функции электрон-транспортной цепи в митохондриях. Он также используется для моделирования болезни Паркинсона в дрозофилы. Мухи имеют неотъемлемое негативное geotactic ответ, который заставляет их подняться вверх на время вздрогнул. Было установлено, что ротенон вызывает ранней смертности и передвижения, дефекты, которые нарушают способность мух, чтобы подняться после того как они были постучал вниз. Тем не менее, влияние ротеноном на спонтанное движение не очень хорошо документированы. Это исследование описывает два чувствительные, воспроизводимые, и высокой пропускной анализов охарактеризовать недостатки Ротенон индуцированных вкраткосрочный испуга, вызванного передвижения и долгосрочный спонтанное передвижение у дрозофилы. Эти анализы могут быть легко адаптированы для характеристики других моделей Drosophila передвижения дефектов и эффективности терапевтических агентов.
Introduction
Недостатки локомоции являются основным симптомом болезни Паркинсона и в значительной степени вызвано ухудшением дофаминергических нейронов черной субстанции 1. Ротенон является кетоновая инсектицид, который хорошо изучена для моделирования дефицита моторных Паркинсона в Drosophila 2-6. Ротенон вызывает окислительное повреждение, блокируя окислительного фосфорилирования путь, который в конечном итоге приводит к гибели клеток 7. Дофаминергических нейронов, более склонны к ротенона токсичности, что делает последствия химической первую очередь двигатель на основе 2,7. По индукции симптомы болезни Паркинсона у мух, мы можем лучше понять болезнь и устранить ее симптомы 6,8-11. Drosophila представляет собой хорошую модель для изучения этого эффекта, потому что они генетически сговорчивым, просты в обслуживании, и есть быстрый жизненный цикл.
Несколько исследований показали, что ротенон вызывает кратковременное испуга, вызванногопередвижение дефекты Drosophila -Когда мух ведутся на ротенона-дополняется пищи, они показывают медленнее негативное geotactic ответ после испуга 2-6. Их неспособность подняться вверх в флаконе аппарата так быстро, как испытаний контрольных свидетельствует о испуга, вызванного локомоции дефектов.
Эффект ротенона на долгосрочной перспективе, спонтанное движение не очень хорошо описано. Мониторы Drosophila деятельности (плотин) успешно используются для контроля движения в Drosophila циркадный ритм изучает 12,13. Мухи помещаются в отдельные пробирки, которые загружаются в РСВ. Этот аппарат оснащен инфракрасным сенсором, который подсчитывает количество раз муха пробитием инфракрасный луч. Эти отсчеты могут быть использованы в качестве меры невозмущенного движения и активности 12,13. Размещая мух в плотине, эффект ротенона на их долгосрочной передвижения можно охарактеризовать. Это исследование описывает методы в МПСЮр краткосрочный испуга, вызванного передвижения и долгосрочный спонтанное передвижение для того, чтобы лучше понять последствия Ротенон опосредованной недостатков двигателя. Характеристика опорно-двигательного недостатков, имитирующих болезнь Паркинсона важны, поскольку они позволяют для изучения других соединений, которые могут повернуть вспять эти передвижения, дефекты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Drosophila испуга, вызванного Передвижение Анализ
- Лечение наркотиками
- Sedate для иммобилизации желаемого количества (примерно 8-12) из 1-3 день-летний мужчина летит с помощью CO 2 и перевезти их в пробирки, содержащие пищу наркотиков дополняется. Примечание: Еще один анестетик, например, простой эфир или льда может быть использован, чтобы успокоить мух, чтобы позволить подсчета и обработки.
- Разрешить мухи для восстановления после седации в течение 20 мин (или до восстановления) с флакона в горизонтальном положении (чтобы предотвратить застревание мух на продукты питания), а затем поместить флакон в вертикальном положении в течение 12 ч темноты, свет 12 ч инкубаторе при 25 ° C на оставшуюся часть эксперимента.
- Экспериментальная установка
- Разделите эту двойную флакон установки на три равные разделах 6,33 см, пометив круги вокруг флаконов с постоянным маркером.
- После 3 дней воздействия лекарственного средства, передача летит без анестезии в нижнюю флакона и быстро разместить верхнюю флаконнад отверстием. Лента двух флаконов вместе с ясной лентой.
- Разрешить мухи, чтобы акклиматизироваться к новым условиям в течение 15 мин.
- Место флаконов на белом фоне и настроить цифровую камеру на соответствующем расстоянии от двойной флакона аппарата с таймером в поле зрения. Убедитесь, весь аппарат видна в одном фоторамку и что все мухи находятся в фокусе. Для поддержания согласованных кадры между испытаний, отметьте расположение камеры и флакона.
- Мобильность Анализ
- Очевидно отображения тройственное число, медикаментозное лечение, и таймер в поле зрения камеры.
- Плотно нажмите на двойную флакон аппарат по отношению к столешнице 3 раза, и обеспечить, чтобы все мухи падают на дно флакона. Одновременно запустить таймер.
- Каждый 5 сек в течение 1 мин, сфотографировать аппарата. Примечание: В качестве альтернативы, видео могут быть захвачены и остановился через соответствующие промежутки времени для измерений.
- Разрешить мухи восстановить в покое на 1 мин.
- Анализ данных
- Просмотрите фотографии и записывать количество мух в каждой секции с течением времени. Вычислить процент мух в каждой секции с течением времени. Примечания: Повторите всю процедуру с теми же мух в 2 или 3 временных точек интереса, например, день 3, 5, и 7 Если слишком много мух умирают в течение всего эксперимента, то можно масштабировать до оригинального тройственное число, чтобы компенсировать для смертности. Используйте соответствующий статистический анализ, чтобы сравнить данные.
Анализ 2 Drosophila Спонтанное Передвижение
- Приготовление пищи
- Восстановить 3 г быстрорастворимого Drosophila среды с 15 мл деионизированной воды и желаемой ротенона(Или другой препарат интерес) дозировка.
- Как только еда смесь стала фирма (около 5 мин), тщательно загрузить, что еда была примерно 1 см в высоту в производителя поставляются прозрачные трубки (5 мм X 65 мм). Добавить препарат настоянный еду в пробирки, тщательно помещая пробирки вертикально в пищу и, поворачивая их, пока они не могут быть удалены с едой внутри трубки. Примечание: Это полезно поместить палец на открытии трубки для создания вакуума. Пища не должна содержать пузырьки воздуха или имеют неровную поверхность, как мухи может застрять.
- Экспериментальная установка
- Поместите пластиковую крышку на конце трубки ближайшего еде. Нажмите пластиковый колпачок на тюбике как можно меньше, так как это может создать воздушный пузырь во флаконе, если толкнул насильно.
- Sedate 1 день-летний мужчина летит с помощью CO 2 и осторожно вставьте 1 мужчина летать в каждую пробирку с кисти. Повторите в зависимости от количества требуемых испытаний.
- ПодключитеКонец трубки дальней от пищи с небольшим ватным тампоном, которые могут быть стороны проката из большего хранилища купил ватные шарики.
- Разрешить мухи, чтобы восстановить с трубками в горизонтальном положении в течение 15 мин и обеспечить, чтобы все мухи живы и активны. Вставьте трубки в РСВ и убедитесь, что все трубки находятся в том же положении по отношению к плотине. Примечание: Можно поместить их в области мониторинга в середине флакона, или нажать все флаконы в сторону, так, чтобы конец трубки находится под контролем. Примечание: Смотрите обсуждение для вариации этого метода.
- Сбор данных
- Поместите DAM в 12 час темноте, 12 ч света инкубатор установлен на 25 ° C. Подключите DAM к системе сбора данных. Откройте программу DAM и под предпочтений Выберите длину бен 10 мин. Начните сбор данных и запустить программу для сбора данных в течение 7 дней. Примечание: длина Bin можно регулировать при необходимости.
- Анализ данных
Примечание: Процессданные для получения импульсов в мин в качестве меры для долгосрочного спонтанного передвижения.- Открыть файл DAM сканирования программ и монитор для доступа к данным, нажав выберите входные данные.
- Выберите соответствующий диапазон монитора и выберите длину бен к 10-минутные интервалы.
- В выходной типа файла выбрать файлы каналов. Оставьте все другие варианты, как по умолчанию.
- Нажмите данные сканирования и сохранения в указанную папку.
- Импорт данных в циркадных программного обеспечения для анализа данных для получения импульсов в мин. Примечание: Для анализа данных Clocklab программное обеспечение обычно используется. Другие опции также доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila испуга, вызванного Передвижение Анализ
Дикого типа, Canton-S, мухи показал надежную негативное geotactic ответ с только приблизительно 88% и 5% от мух в верхней и нижней секций соответственно, аппарата двойной флакон через 30 сек (Рисунок 1). Мухи подвергаются 125 мкм и 250 мкм ротенона в течение 3 дней показал небольшое снижение количества мух в верхней части и небольшим увеличением количества мух в нижней секции. Мухи подвергаются до 500 мкм ротенона показали значительное дефект в отрицательной geotactic ответ (р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнение), о чем свидетельствует меньшее количество мух в верхней части и более мух в нижней части по сравнению с контрольными мух (Рисунок 1). Этот дефект в отрицательной geotactic ответ в связи с невозможностью быстро подняться в аппарате свидетельствует о дефекте в вздрагивания заезданаведенной передвижения.
Анализ Drosophila Спонтанное Передвижение
Дикого типа, Canton-S, мухи показал 0,57 импульсов в минуту в качестве меры спонтанной подвижности на четвертый день на РСВ (Рисунок 2). Мухи подвергаются 125 мкм ротенона показали такой же уровень спонтанного передвижения. Напротив, мухи подвергаются до 250 мкм и 500 мкм ротенон показали примерно на 50% ниже меры (р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнения) спонтанного передвижения (Рисунок 2). Эти мухи перемещается около 0,20 импульсов в минуту, что свидетельствует о ротенона вызванной дефектом в спонтанной локомоции.
Для учета начальных расхождений (если таковые имеются) в передвижении не вызванных воздействием ротенона, мы вычли передвижения, данные между день 4 и 3 день мух управления показал рост на 0,1 импульсов в минуту в spontaneoнам локомоции между днями, в то время как мухи подвергаются 125 мкм ротенона выставлены незначительное снижение примерно 0,15 импульсов в минуту (рисунок 3). Мухи подвергаются до 250 мкм и 500 мкм ротенона отображается более серьезные уменьшается в передвижении между дней, с разницы быть примерно 0,3 и 0,5 (р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнение) импульсов в минуту соответственно. Эти данные говорят о дефицит в спонтанной локомоции в течение долгого времени с воздействием ротенона и подтверждает один анализ день уже упоминалось выше - мухи подвергаются более высокие дозировки ротенона показали снижение спонтанной локомоции. Взятые вместе, эти методы надежно измерить недостатков Ротенон индуцированных в спонтанной и поразить индуцированной передвижения.
Рисунок 1. испуга, вызванного локомоции участокмух воздействию возрастающих доз ротеноном. дикого типа, Canton-S, мужские мух воздействию различных доз ротеноном в течение 3 дней и выживших мух (8-12), а затем прослушивались в нижней части флакона двойной аппарата. Мухи подвергаются до 500 мкм ротенона показывают значительное уменьшение процента мух в верхней (А) и увеличить в процентах от мух в нижней части (B) аппарата после 30 сек. Это свидетельствует о недостатке в реакции испуга в мух, подверженных ротеноном. Колонны представляют средний процент 6 независимых экспериментов. Усы представляют стандартную ошибку среднего; * Р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнение.
Рисунок 2 Спонтанное передвижение участок мух воздействию увеличением дозыс ротенона. дикого типа, Canton-S, мужчины мух воздействию различных доз ротенона и импульсов в мин на четвертый день после экспозиции были построены. Графы были измерены в РСВ. Мухи воздействию до 250 мкм и 500 мкм ротеноном показывают снижение количества импульсов в мин. Это свидетельствует о недостатке в спонтанной локомоции мух, подверженных ротенона. Колонны представляют собой средние импульсов в мин на четвертый день 5 независимых испытаний. Усы представляют стандартную ошибку среднего; * Р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнение.
Рисунок 3 Изменение спонтанной двигательной участке мух, подвергшихся воздействию возрастающих дозах ротенона. Дикого типа, Canton-S, мужчины мух воздействию различных доз ротенона и разница в импульсах в мин Oн третий и четвертый день после воздействия были нанесены. Графы были измерены в РСВ. Существует дозозависимое тенденция снижения спонтанной локомоции с мухами, подвергшихся воздействию высоких доз, имеющих более негативные изменения в передвижении. Это свидетельствует о снижении движения. Колонны представляют среднее изменение передвижения за минуту 5 независимых испытаний. Усы представляют стандартную ошибку среднего; * Р <0,05 ANOVA, Бонферрони пара мудрый сравнение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании, мы опишем две процедуры измерения как долгосрочный спонтанное передвижение и краткосрочный испуга, вызванного передвижения в ротенона вызванной Drosophila модели болезни Паркинсона. Наконец, можно оценить эти передвижения, характеристики в мух, подверженных других фармакологических агентов, известных для моделирования заболевания, например, Паркинсона, параквата 14, генетические модели заболевания, например, Паркинсона, альфа-синуклеина мутантов 15, и другие мухи моделей заболеваний, поражающих передвижения. Для обоих методов, альтернативные методы и модификации могут быть рассмотрены. Мухи могут быть под наркозом с использованием льда, которые могли бы облегчить ограничения CO 2 обезболивания например отставание в сборе данных, чтобы CO 2 эффект стираться.
В испуга, вызванного локомоции анализа, так как мухи показывают циркадные изменения в мобильности, важно, чтобы собрать данные в то же времядень между экспериментами. Важно также, чтобы ввести летит в испытательной установки без анестезии. В отличие от большинства реагирования испуга локомоции анализов, которые полагаются на снимок прохождения порога в заданном количестве времени 10,11,15,16, наш подход, аналогичный быстрых итерационных негативных geotaxis (кольцо) анализе 17,18, контролирует Движение в последовательные нескольких экземпляров в течение определенного периода времени. Этот подход непрерывного мониторинга распределения мух в разных зонах может решить тонкие различия между группами лечения. Кроме того, наш подход расчета процент мух в нескольких зонах арены может помочь свести к минимуму вклад выбросов в данных.
Мы также в это время точки систематически решил взять данные для сравнения групп лечения. После принятия данных каждые 5 секунд в течение 1 мин, мы построили данные и обнаружили, что наиболее заметные различия между процедурами можно было бэ увидеть на 30 сек. После этот момент времени, мухи подвергаются ротенона способны компенсировать свои опорно-двигательного аппарата дефектов. Поэтому мы рекомендуем пользователям оптимизировать сроки сбора данных, чтобы лучше урегулировать разногласия между их контрольных и экспериментальных наборов. Этот подход также имеет то преимущество, определения относительных недостатков опорно-двигательного аппарата между фармакологических агентов и / или генетических моделей. Например, более токсичный химикат, чем ротенона может показать наиболее заметные различия ранее, чем 30 времени сек точки.
Для долгосрочного спонтанное двигательного анализа, так как мухи наркозом ввести их в трубах, не считают данные из первого 24-48 часов, чтобы позволить для анестезии, чтобы носить-офф и акклиматизации мух на мониторе труб. Еще одно соображение для этого анализа является относительное положение трубки и датчика движения в РСВ, который мы думаем может воздействовать на спонтанные данные передвижения. Мы разместили пробирки с мухами на мониторетак, чтобы датчик был мониторинга треть промежуток трубки дальнего от еды и не середина трубки, как это обычно делается в традиционной использования РСВ в циркадных исследований. Это позволило нам изучить способность мух для прохода по крайней мере, две трети длины трубки и привело к более последовательных данных. Вполне вероятно, что на счету деятельности могут быть затронуты в Ротенон кормили мух в связи с очередями движения и / или подергивание фенотипа. Другие возможные сопутствующие факторы для графов деятельности может быть вкусовой и / или обонятельные отвращение / влечение к ротенона и других химических веществ, представляющих интерес для пользователя. Поэтому дополнительная отслеживания видео 17,19 могут быть использованы для дополнения данных DAM для более тщательного анализа фенотипа передвижения.
В случае, когда экспериментальные мухи подобные счетчики активности по сравнению с контрольными мух, вполне возможно, что они отличаются по циркадного распределения движения Так как Fложь более активны вокруг света включения / выключения и выключения / включения перехода в 12 час свет-12 ч темно цикла. Поэтому, было бы полезно, чтобы определить число импульсов за мин в нескольких точках времени и длины бен в 24-часовой период, чтобы определить точное распределение передвижения. В заключение, этот анализ, благодаря своей способности оценивать характеристики движения не ограничиваясь движений в ответ, чтобы поразить, обеспечит новый взгляд на шагающих дефектов и характеристики корректирующих мер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Qiuli Wang, язык Resource Center, Колби колледж, для оказания технической помощи с обработкой видео и Эрик Томас, отдела музыки, колледжа Колби, для обеспечения фоновой музыки. Этот проект был поддержан грантами Национального центра исследовательских ресурсов, INBRE (P20RR016463-12), Национального института по общим медицинских наук (P20 GM103423-12), Граждане институты здравоохранения и науки дивизии Грант, колледжа Колби (STA). JL и LWM были поддержаны грантами от Летнего Scholar фонда, колледжа Колби.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
- Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
- Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
- Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
- St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
- Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
- Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640 (2011).
- Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
- Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
- Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
- Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).
