Summary
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que resulta de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el sistema nervioso central, causando defectos de locomoción. Rotenona modelos de la enfermedad de Parkinson en Drosophila. Este documento describe dos ensayos que caracterizan a las deficiencias de locomoción tanto espontáneos como inducidos por el sobresalto causado por la rotenona.
Abstract
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que resulta de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el sistema nervioso central, principalmente en la sustancia negra. La enfermedad provoca deficiencias motoras, que presentan como rigidez, temblores y la demencia en los seres humanos. Rotenona es un insecticida que causa el daño oxidativo mediante la inhibición de la función de la cadena de transporte de electrones en la mitocondria. También se utiliza para modelar la enfermedad de Parkinson en la Drosophila. Las moscas tienen una respuesta geotáctico negativo inherente, que los obliga a subir hacia arriba al ser sorprendido. Se ha establecido que la rotenona causa defectos de mortalidad y de locomoción principios que alteran la capacidad de las moscas para subir después de haber sido golpeado ligeramente hacia abajo. Sin embargo, el efecto de la rotenona en movimiento espontáneo no está bien documentada. Este estudio describe dos ensayos de rendimiento sensibles, reproducibles y de alta para caracterizar deficiencias inducida rotenona-inlocomoción y la locomoción espontánea a largo plazo a corto plazo de sobresalto-inducida en Drosophila. Estos ensayos pueden ser convenientemente adaptados para caracterizar otros modelos de Drosophila de defectos de la locomoción y la eficacia de los agentes terapéuticos.
Introduction
Deficiencias de locomoción son el principal síntoma de la enfermedad de Parkinson y son causadas en gran parte por el deterioro de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra 1. Rotenona es un insecticida cetónico que se ha estudiado ampliamente para modelar los déficits motores de Parkinson en Drosophila 2-6. Rotenona causa daño oxidativo mediante el bloqueo de la vía de la fosforilación oxidativa, lo que provoca en última instancia, la muerte celular 7. Las neuronas dopaminérgicas son más propensos a la toxicidad rotenona, por lo que los efectos de la sustancia química principalmente motor basa 2,7. Mediante la inducción de síntomas de la enfermedad de Parkinson en las moscas, podemos comprender mejor la enfermedad y remediar sus síntomas 6,8-11. Drosophila proporciona un buen modelo para el estudio de este efecto, ya que son genéticamente manejable, fácil de mantener, y tienen un ciclo de vida rápido.
Varios estudios han demostrado que la rotenona causa inducida por sobresalto corto plazodefectos de locomoción en la mosca Drosophila -cuando se mantienen en los alimentos suplementados con rotenona, que muestran una respuesta más lenta geotáctico negativo después de sobresalto 2-6. Su incapacidad para subir hacia arriba en un aparato vial lo más rápidamente pruebas de control es indicativo de defectos de locomoción inducida de sobresalto-.
El efecto de la rotenona en a largo plazo, movimiento espontáneo no está bien descrita. Monitores de actividad Drosophila (presas) se han utilizado con éxito para controlar el movimiento en el ritmo circadiano de Drosophila estudia 12,13. Las moscas se colocan en tubos individuales, que se cargan en el DAM. Este aparato está equipado con un sensor de infrarrojos, que cuenta el número de veces que una mosca rompe el haz de luz infrarroja. Estos recuentos se pueden utilizar como una medida de la locomoción y la actividad 12,13 sin molestias. Mediante la colocación de las moscas en un DAM, el efecto de la rotenona en su locomoción a largo plazo puede ser caracterizado. Este estudio describe los métodos de medición alocomoción y la locomoción espontánea a largo plazo ure corto plazo de sobresalto inducida con el fin de comprender mejor los efectos de la rotenona mediada por deficiencias motoras. Caracterización de las deficiencias de locomoción que imitan la enfermedad de Parkinson son importantes porque permiten el estudio de otros compuestos que pueden revertir estos defectos de locomoción.
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Protocol
1.-Ensayo de locomoción inducida sobresalto Drosophila
- Tratamiento de Drogas
- Sedate para inmovilizar el número deseado (aproximadamente 8-12) de 1-3 días de edad moscas macho usando CO 2 y transportarlos a los viales que contengan el alimento suplementado con las drogas. Nota: Otro anestésico por ejemplo, el éter o el hielo puede ser utilizado para sedar a las moscas para permitir el recuento y la manipulación.
- Permitir que las moscas para recuperarse de la sedación durante 20 minutos (o hasta que la recuperación) con el vial en posición horizontal (para evitar que las moscas se queda pegada en la comida) y luego coloque el vial en posición vertical en una oscuridad de 12 h, 12 h luz incubadora a 25 ° C para el resto del experimento.
- Experimental Set Up
- Divida esta configuración doble vial en tres secciones iguales de 6,33 cm, marcando círculos alrededor de los viales con un marcador permanente.
- Después de 3 días de exposición al fármaco, transferencia vuela sin anestesiar en el vial inferior y colocar rápidamente el vial superiorsobre la abertura. Pegue las dos viales junto con cinta adhesiva transparente.
- Permitir que las moscas se aclimaten al nuevo ambiente durante 15 min.
- Coloque los viales en un fondo blanco y establecieron una cámara digital a una distancia apropiada del aparato vial doble con un contador de tiempo en la vista. Asegúrese de que el conjunto quede visible en un único marco de imagen y que todas las moscas están en foco. Para mantener marcos consistentes entre los ensayos, marque la ubicación de la cámara y el vial.
- Ensayo de Movilidad
- Claramente mostrar el número de prueba, el tratamiento farmacológico y el cronómetro en vista de la cámara.
- Pulse firmemente el aparato vial doble contra la encimera 3 veces y asegurarse de que todas las moscas caen al fondo del vial. Simultáneamente iniciar el temporizador.
- Cada 5 segundos durante 1 minuto, toma una foto del aparato. Nota: Como alternativa, un video podría ser capturado y se detuvo a intervalos apropiados para las mediciones.
- Permitir que las moscas se recuperen en reposo durante 1 min.
- Análisis de Datos
- Revise las imágenes y grabar el número de moscas en cada sección a través del tiempo. Calcular el porcentaje de moscas en cada sección con el tiempo. Notas: repetir todo este procedimiento con las mismas moscas a los 2 o 3 puntos de tiempo de interés, por ejemplo, los días 3, 5, y 7 Si demasiadas moscas mueren durante el experimento es posible ampliar el número juicio original para compensar para la mortalidad. Utilice el análisis estadístico apropiado para comparar los datos.
Ensayo 2. Drosophila espontánea Locomotion
- Preparación de Alimentos
- Reconstituir 3 g de medio Drosophila instantánea con 15 ml de agua desionizada y rotenona deseada(U otro fármaco de interés) dosis.
- Una vez que la mezcla de los alimentos se ha convertido en firme (aproximadamente 5 minutos), cargue con cuidado la comida que es de aproximadamente 1 cm de alto en fabricante suministra tubos transparentes (5 mm x 65 mm). Añadir el fármaco infundido alimentos a los tubos colocando cuidadosamente los tubos verticalmente en la comida y torcer hasta que puedan ser retirados con la comida en el interior del tubo. Nota: Es útil colocar un dedo en la abertura del tubo para crear un vacío. Los alimentos no deben contener burbujas de aire o tienen una superficie irregular como las moscas se pueden atascar.
- Configuración Experimental
- Colocar una tapa de plástico sobre el extremo del tubo más próximo a la comida. Empuje la tapa de plástico en el tubo de tan poco como sea posible, ya que puede crear una burbuja de aire en el vial, si se empuja a la fuerza.
- Sedate 1 días de edad moscas macho usando CO 2 e inserte con cuidado 1 macho vuela en cada tubo con un pincel. Repita dependiendo del número de ensayos deseados.
- Enchufe elfinal del tubo más alejado de la comida con una pequeña bola de algodón, que se puede enrollar la mano más grande comprados en la tienda de bolas de algodón.
- Permitir que las moscas se recuperen con los tubos en posición horizontal durante 15 minutos y asegurarse de que todas las moscas están vivos y activos. Inserte los tubos en DAM y asegúrese de que todos los tubos están en la misma posición respecto a la represa. Nota: Es posible colocar con el área de vigilancia en el centro del vial, o para empujar todos los viales a un lado, de manera que se está supervisando el extremo del tubo. Nota: Véase la discusión para variantes de este método.
- Recogida de datos
- Coloque el DAM en una oscuridad de 12 h, 12 h incubadora luz ajustado a 25 ° C. Conecte el DAM al sistema de recolección de datos. Abra el software DAM y en las preferencias de selección de longitud bin a 10 min. Comienza la recogida de datos y permitir que el programa para recoger datos durante 7 días. Nota: la longitud Bin se puede ajustar si es necesario.
- Análisis de Datos
Nota: Procesolos datos para obtener recuentos por min como una medida para la locomoción espontánea a largo plazo.- Abrir archivos DAM programar y supervisar el acceso de exploración de datos haciendo clic en Seleccionar datos de entrada.
- Seleccionar rango apropiado de monitor y seleccione la longitud bin a intervalos de 10 min.
- En salida de tipo de archivo, elija Archivos de canal. Deje el resto de opciones por defecto.
- Haga clic en los datos de exploración y guardar en una carpeta designada.
- Importar datos en un circadiano software de análisis de datos para obtener los recuentos por min. Nota: Para el análisis de datos de software Clocklab es de uso general. Otras opciones están también disponibles.
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Representative Results
Ensayo de locomoción inducida por sobresalto Drosophila
Wildtype, Cantón-S, las moscas mostraron una respuesta negativa geotáctico robusto con sólo aproximadamente el 88% y el 5% de las moscas en las secciones superior e inferior, respectivamente, del aparato de doble vial después de 30 segundos (Figura 1). Las moscas expuestas a 125 M y 250 M rotenona durante 3 días mostraron una ligera disminución en el número de moscas en la sección superior y ligero aumento en el número de moscas en la sección inferior. Las moscas expuestas a 500 mM rotenona mostraron defecto importante en la respuesta geotáctico negativo (p <0,05 ANOVA, Bonferroni par sabia comparación) como se evidencia por un menor número de moscas en la sección superior y más moscas en la sección inferior en comparación con el control de moscas (Figura 1). Este defecto en respuesta geotáctico negativo debido a la incapacidad para subir rápidamente en el aparato es indicativo de un defecto en sobresalto-enlocomoción reduce.
Ensayo Drosophila espontánea Locomotion
Wildtype, Cantón-S, moscas mostró 0,57 cuentas por minuto como una medida de la movilidad espontánea en el cuarto día en el DAM (Figura 2). Las moscas expuestas a 125 M rotenona mostraron un nivel similar de la locomoción espontánea. Por el contrario, las moscas expuestas a 250 M y 500 M rotenona mostró mide aproximadamente 50% más bajos (p <0,05 ANOVA, Bonferroni par de comparación en cuanto a) de la locomoción espontánea (Figura 2). Estas moscas se movieron en alrededor de 0,20 recuentos por minuto, lo cual es indicativo de un defecto inducida por rotenona en la locomoción espontánea.
Para dar cuenta de las discrepancias iniciales (si los hay) en la locomoción no causados por la exposición rotenona, restamos los datos de locomoción entre el día 4 y el día 3. moscas de control mostró un aumento de alrededor de 0,1 cuentas por minuto en spontaneonos locomoción entre días, mientras que las moscas expuestas a 125 mM rotenona mostraron una ligera disminución de alrededor de 0,15 recuentos por minuto (Figura 3). Las moscas expuestas a 250 M y 500 M rotenona muestran descensos más severos en la locomoción entre los días, con diferencias siendo aproximadamente 0,3 y 0,5 (p <0,05 ANOVA, Bonferroni par sabia comparación) cuentas por minuto, respectivamente. Estos datos sugieren una deficiencia en la locomoción espontánea en el tiempo con la exposición a la rotenona y confirma el análisis mencionado anteriormente solo día - moscas expuestas a dosis más altas de rotenona mostró una disminución en la locomoción espontánea. Tomados en conjunto, estos métodos miden fiable deficiencias inducida rotenona en espontánea y sobresaltan inducida locomoción.
Figura 1. inducida sobresalto-locomoción parcela demoscas expuestas a dosis crecientes de rotenona. tipo salvaje, Canton-S, moscas macho fueron expuestas a diferentes dosis de rotenona durante 3 días y moscas supervivientes (8-12) fueron entonces golpeado ligeramente en la parte inferior del aparato vial doble. Las moscas expuestas a 500 mM rotenona muestran una disminución significativa en el porcentaje de moscas en la parte superior (A) y aumento en el porcentaje de moscas en la sección inferior (B) del aparato después de 30 seg. Esto es indicativo de una deficiencia en la respuesta de sobresalto en las moscas expuestas a la rotenona. Las columnas representan el porcentaje promedio de 6 experimentos independientes. Las barras de error representan el error estándar de la media; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par sabia comparación.
Figura 2. la locomoción espontánea parcela de moscas expuestas a dosis crecientess de la rotenona. tipo salvaje, Cantón-S, las moscas macho fueron expuestas a diferentes dosis de rotenona y recuentos por min en el cuarto día después de la exposición se trazan. Los conteos se miden en un DAM. Las moscas expuestas a 250 M y 500 M rotenona muestran una reducción en los recuentos por min. Esto es indicativo de una deficiencia en la locomoción espontánea en las moscas expuestas a la rotenona. Las columnas representan las cuentas promedio por minuto en el cuarto día de 5 ensayos independientes. Las barras de error representan el error estándar de la media; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par sabia comparación.
Figura 3 Cambio en la locomoción espontánea parcela de moscas expuestas a dosis crecientes de la rotenona. Tipo salvaje, Cantón-S, las moscas macho fueron expuestas a diferentes dosis de rotenona y la diferencia en los recuentos por min on el tercer y cuarto día después de la exposición se trazan. Los conteos se miden en un DAM. Hay una tendencia dependiente de la dosis para el declive en la locomoción espontánea con las moscas expuestas a dosis superiores que tienen un cambio más negativo en la locomoción. Esto es indicativo de una disminución en el movimiento. Las columnas representan el cambio promedio en la locomoción por minuto de 5 ensayos independientes. Las barras de error representan el error estándar de la media; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par sabia comparación.
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Discussion
En este estudio, se describen dos procedimientos para medir tanto la locomoción espontánea a largo plazo y la locomoción inducida de sobresalto-a corto plazo en un modelo de Drosophila inducida por rotenona de la enfermedad de Parkinson. También se puede medir estas características de locomoción en las moscas expuestas a otros agentes farmacológicos conocidos para modelar la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, paraquat 14, modelos genéticos de la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, mutantes de alfa-sinucleína 15, y otros modelos de la mosca de las enfermedades que afectan a la locomoción. Para ambos métodos, los métodos y modificaciones alternativas pueden ser consideradas. Las moscas pueden ser anestesiados utilizando hielo, lo que podría aliviar las limitaciones de CO 2 anestesia, por ejemplo, retraso en la recolección de datos para permitir que el CO 2 efecto desaparece después.
En el ensayo de locomoción inducida sobresalto-, ya que las moscas muestran variación circadiana en la movilidad, es importante recoger datos en el mismo momento de ladía entre los experimentos. También es importante introducir las moscas en el aparato de prueba sin anestesia. Contrariamente a la mayoría de los ensayos de locomoción de respuesta de sobresalto, que dependen de una instantánea de pasar un umbral en una cantidad de tiempo predeterminada 10,11,15,16, nuestro enfoque, similar a los rápidos geotaxis negativos iterativos (anillo) ensayo de 17,18, supervisa el el movimiento en varias instancias sucesivas durante un período de tiempo. Este enfoque de la monitorización continua de la distribución de moscas en diferentes zonas puede resolver las diferencias sutiles entre los grupos de tratamiento. Además, nuestro enfoque de calcular el porcentaje de moscas en múltiples zonas de la arena puede ayudar a minimizar la contribución de los valores atípicos en los datos.
También decidimos sistemáticamente momento en el que el punto de tomar datos para comparar los grupos de tratamiento. Después de tomar los datos cada 5 segundos durante 1 minuto, se trazan los datos y encontramos que las diferencias más notables entre tratamientos podrían be visto en 30 seg. Después de este punto de tiempo, las moscas expuestas a la rotenona son capaces de compensar sus defectos del aparato locomotor. Por lo tanto, recomendamos a los usuarios a optimizar el tiempo de adquisición de datos para resolver mejor las diferencias entre el control y los juegos de experimentos. Este enfoque también tiene la ventaja de la determinación de las deficiencias del aparato locomotor relativos entre agentes farmacológicos y / o modelos genéticos. Por ejemplo, un producto químico más tóxico que la rotenona puede mostrar diferencias más notables antes de 30 seg punto de tiempo.
Para el largo plazo ensayo de locomoción espontánea, ya que las moscas son anestesiados para introducirlos en los tubos, no considera los datos de primeras 24-48 horas para permitir que la anestesia desaparezca-off y la aclimatación de las moscas en los tubos del monitor. Otra consideración para este ensayo es la posición relativa del tubo y el sensor de movimiento en DAM, que creemos que puede afectar los datos de locomoción espontánea. Colocamos los tubos que contienen las moscas en el monitorde manera que el sensor estaba monitoreando la de un tercer tramo de tubo desde el más lejano de la comida y no el centro del tubo como por lo general se hace en el uso tradicional de DAM en estudios circadianos. Esto nos permitió examinar la capacidad de las moscas para atravesar al menos dos tercios de la longitud del tubo y condujo a los datos más consistentes. Es probable que los recuentos de actividad pueden verse afectados en las moscas de la rotenona alimentados por ráfagas de movimiento y / o fenotipo crispar. Otros factores de confusión posibles para los recuentos de actividad podría ser un gustativa y / o una aversión olfativa / atracción hacia rotenona y otros productos químicos de interés para el usuario. Por lo tanto, el seguimiento de vídeo adicional 17,19 se puede emplear para complementar los datos de DAM para un análisis más profundo del fenotipo locomoción.
En un escenario donde las moscas experimentales tienen recuentos de actividad similar en comparación con el control de moscas, es posible que difieren en la distribución circadiano de movimiento desde fmentiras son más activos en torno a la luz de encendido / apagado y el encendido / apagado de transición en un 12 hr luz-12 h oscuridad ciclo. Por lo tanto, sería de gran ayuda para determinar los recuentos por min a múltiples puntos de tiempo y longitudes de basura en un período de 24 horas para determinar la distribución exacta de la locomoción. En conclusión, este ensayo, debido a su capacidad para evaluar las características del movimiento no se limita a los movimientos en respuesta a asustar, proporcionará nuevos conocimientos sobre los defectos de locomoción y la caracterización de las estrategias correctivas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Qiuli Wang, Centro de Recursos de Idiomas, Colby College, para la asistencia técnica con el procesamiento de vídeo y Eric Thomas, departamento de música, Colby College, para proporcionar la música de fondo. Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Centro Nacional para Recursos de Investigación, INBRE (P20RR016463-12), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM103423-12 P20), los nacionales de los Institutos de la Salud y la división de ciencia de Grant, Colby College (STA). JL y LWM fueron apoyados por becas de Fondo Académico de Verano, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
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