Summary
A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona.
Abstract
A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, principalmente na substantia nigra. A doença provoca deficiências motoras, que apresentam como rigidez, tremores e demência em humanos. Rotenone é um inseticida que causa dano oxidativo, inibindo a função da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria. É também usado para modelar a doença de Parkinson na Drosophila. As moscas têm uma resposta geotactic negativa inerente, o que os obriga a subir para cima ao ser assustado. Foi estabelecido que a rotenona causa defeitos de mortalidade e de locomoção primeiros que perturbam a capacidade das moscas para subir depois de terem sido aproveitado para baixo. No entanto, o efeito de rotenona em movimento espontâneo não está bem documentada. Este estudo descreve dois ensaios sensíveis, reprodutíveis e de alto rendimento para caracterizar deficiências induzida por rotenona ema curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo em Drosophila. Estes ensaios podem ser convenientemente adaptados para caracterizar outros modelos de Drosophila de defeitos de locomoção e a eficácia de agentes terapêuticos.
Introduction
Deficiências de locomoção são um dos principais sintomas de doença de Parkinson e são em grande parte causadas por deterioração dos neurónios dopaminérgicos da substância negra 1. Rotenone é um inseticida cetônico que tem sido estudado extensivamente para modelar déficits motores de Parkinson em Drosophila 2-6. Rotenone provoca danos oxidativos, bloqueando a via de fosforilação oxidativa, o que acaba por causar a morte de células 7. Neurónios dopaminérgicos são mais propensas a toxicidade de rotenona, fazendo com que os efeitos do produto químico principalmente motor baseado 2,7. Ao induzir sintomas da doença de Parkinson em moscas, podemos entender melhor a doença e seus sintomas remediar 6,8-11. Drosophila fornece um bom modelo para estudar o efeito, porque eles são geneticamente dócil, de fácil manutenção, e têm um ciclo de vida rápido.
Vários estudos têm mostrado que provoca rotenona induzida por sobressalto de curto prazodefeitos de locomoção em moscas Drosophila -quando são mantidos em alimentos suplementados com rotenona, eles mostram uma resposta mais lenta geotactic negativo após susto 2-6. Sua incapacidade de subir para cima em um aparelho de frasco tão rapidamente quanto os ensaios de controle é indicativo de defeitos de locomoção induzida pelo sobressalto.
O efeito de rotenona no longo prazo, o movimento espontâneo não está bem descrita. Monitores de actividade de Drosophila (DAMS) têm sido utilizados com sucesso para controlar o movimento em Drosophila ritmo circadiano estuda 12,13. As moscas são colocadas em tubos individuais, as quais são carregadas para o DAM. Este aparelho é equipado com um sensor de infravermelhos, o qual conta o número de vezes que uma mosca divide o feixe de infravermelhos. Estas contas podem ser utilizados como uma medida de actividade de locomoção e 12,13 imperturbável. Ao colocar as moscas em um DAM, o efeito de rotenona na sua locomoção de longo prazo pode ser caracterizado. Este estudo descreve métodos para mediçãoure a curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo, de modo a compreender melhor os efeitos da rotenona mediada deficiências motoras. Caracterização de deficiências de locomoção que imitam a doença de Parkinson são importantes porque permitem o estudo de outros compostos que podem reverter esses defeitos de locomoção.
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Protocol
1 induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção
- Tratamento de Drogas
- Sedate para imobilizar o número desejado (aproximadamente 8-12) de 1-3 dias de idade do sexo masculino voa usando CO 2 e transportá-los para os frascos que contêm o alimento suplementado com a droga. Nota: Um outro anestésico por exemplo, éter ou gelo podem ser usados para sedar moscas para permitir a contagem e manuseamento.
- Permitir moscas para se recuperar de sedação por 20 minutos (ou até que a recuperação), com o frasco em posição horizontal (para evitar moscas ficar preso em alimentos) e em seguida, coloque o frasco na posição vertical em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora a 25 ° C para o resto da experiência.
- Experimental Set Up
- Divida esta configuração frasco duplo em três partes iguais de 6,33 centímetros, marcando círculos em torno dos frascos com um marcador permanente.
- Depois de 3 dias de exposição ao fármaco, a transferência voa sem anestesia no frasco de fundo e rapidamente colocar o topo do frascoatravés da abertura. Tape os dois frascos em conjunto com fita adesiva transparente.
- Permitir moscas para se aclimatar ao novo ambiente por 15 min.
- Coloque os frascos em um fundo branco e configurar uma câmera digital a uma distância adequada do aparelho frasco duplo com um temporizador em vista. Certifique-se de todo o aparelho é visível em um único quadro de imagem e que todas as moscas estão em foco. Para manter quadros consistentes entre ensaios, marcar a localização da câmera e no frasco.
- Mobility Assay
- Claramente exibir o número de teste, o tratamento medicamentoso, e temporizador de visão da câmera.
- Bata firmemente o aparelho de frasco duplo contra a bancada 3 vezes e assegurar que todas as moscas cair para o fundo do frasco. Simultaneamente iniciar o temporizador.
- A cada 5 segundos para 1 min, tirar uma foto do aparelho. Nota: Como alternativa, um vídeo pode ser capturado e fez uma pausa em intervalos apropriados para medições.
- Permitir que as moscas se recuperar em repouso durante 1 minuto.
- Análise de Dados
- Veja as fotos e registrar o número de moscas em cada seção ao longo do tempo. Calcula-se a percentagem de moscas em cada secção ao longo do tempo. Notas: Repita esse procedimento inteiro com as mesmas moscas em 2 ou 3 pontos de tempo de interesse, por exemplo, dia 3, 5 e 7 Se muitas moscas morrem durante todo o experimento, é possível ampliar o número de julgamento original para compensar para a mortalidade. Use a análise estatística adequada para comparar os dados.
2. Drosophila espontânea Locomotion Assay
- Preparação de Alimentos
- Reconstituir 3 g de meio de Drosophila instante com 15 ml de água desionizada e rotenona pretendido(Ou outro fármaco de interesse) de dosagem.
- Uma vez que a mistura de alimentos tornou-se firme (cerca de 5 minutos), coloque cuidadosamente o alimento a ser de aproximadamente 1 cm de altura em fabricante fornecido tubos transparentes (5 mm X 65 mm). Adicionar o fármaco infundido alimentos para os tubos, colocando cuidadosamente os tubos verticalmente no alimento e torcendo-os até que eles possam ser removidos com o alimento para dentro do tubo. Nota: É útil para colocar um dedo na abertura do tubo, para criar um vácuo. Os alimentos não devem conter quaisquer bolhas de ar ou ter uma superfície irregular, como as moscas podem ficar presos.
- Configuração Experimental
- Colocar uma tampa de plástico na extremidade do tubo mais próximo ao alimento. Empurre a tampa de plástico do tubo tão pouco quanto possível, uma vez que pode criar uma bolha de ar no frasco, se levado a força.
- Sedate masculino 1 dia de idade, voa usando CO 2 e cuidadosamente inserir um homem voar em cada tubo com um pincel. Repetir dependendo do número de ensaios desejados.
- Ligue oextremidade do tubo mais distante do alimento com uma bola de algodão pequeno, que pode ser de mão rolou maior loja comprou bolas de algodão.
- Permitir moscas para recuperar com os tubos em posição horizontal durante 15 min e assegurar que todas as moscas estão vivos e activos. Inserir os tubos em DAM e certifique-se que todos os tubos estão na mesma posição em relação a barragem. Nota: É possível colocá-los com a área de monitorização no meio do recipiente, ou para apertar todos os frascos para o lado, de modo que a extremidade do tubo está a ser monitorizado. Nota: Veja a discussão de variações sobre este método.
- Coleta de Dados
- Coloque o DAM em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora regulada a 25 ° C. Conecte o DAM para o sistema de coleta de dados. Abra o software DAM e sob preferências selecione comprimento bin para 10 min. Comece a coleta de dados e permitir que o programa para coletar dados durante 7 dias. Nota: comprimento Bin pode ser ajustado, se necessário.
- Análise de Dados
Nota: Processoos dados para se obter contagens por min como uma medida para a locomoção espontânea de longo prazo.- Arquivo DAM abrir o programa e monitorar o acesso de digitalização de dados, clicando em dados de entrada selecionados.
- Selecione a faixa de monitor apropriado e selecione comprimento bin para intervalos de 10 minutos.
- Em tipo de arquivo de saída escolher arquivos do canal. Deixe todas as outras opções como padrão.
- Clique dados de digitalização e salvar em uma pasta designada.
- Importar dados em um software de análise de dados circadiano obter contagens por min. Nota: Para a análise dos dados software Clocklab é comumente usado. Outras opções também estão disponíveis.
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Representative Results
Induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção
De tipo selvagem, Canton-S, as moscas apresentaram uma resposta negativa geotactic robusta com apenas cerca de 88% e 5% das moscas nas partes superior e inferior, respectivamente, do aparelho duplo frasco após 30 segundos (Figura 1). Moscas expostos a 125 mM e 250 mM rotenone por 3 dias apresentaram um ligeiro decréscimo no número de moscas na parte superior e ligeiro aumento no número de moscas na área do fundo. Moscas expostas a 500 uM rotenona mostrou defeito significativa na resposta geotactic negativo (p <0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação inteligente) como evidenciado pelo menor número de moscas na secção superior e mais moscas na secção inferior, em comparação com o controle moscas (Figura 1). Este defeito na resposta geotactic negativo devido à incapacidade de subir rapidamente no aparelho é indicativo de um defeito de sobressalto emduzido locomoção.
Drosophila espontânea Locomotion Assay
Tipo selvagem, Canton-S, moscas mostrou 0,57 contagens por minuto, como uma medida de mobilidade espontânea no quarto dia na DAM (Figura 2). Moscas expostos a 125 mM rotenona mostrou um nível semelhante de locomoção espontânea. Em contraste, as moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona medidas mostraram cerca de 50% mais baixos (p <0,05 ANOVA, Bonferroni par de comparação inteligente) da locomoção espontânea (Figura 2). Estas moscas movido em cerca de 0,20 contagens por minuto, o que é indicativo de um defeito induzida por rotenona na locomoção espontânea.
Para explicar as discrepâncias iniciais (se houver) na locomoção, não causada por exposição a rotenona, subtraiu-se dados de locomoção entre o dia 4 eo dia 3. moscas controle apresentaram um aumento de cerca de 0,1 contagens por minuto em spontaneonos locomoção entre dias, enquanto que as moscas expostas a 125 uM rotenona exibiu um ligeiro decréscimo de cerca de 0,15 a contagem por minuto (Figura 3). Moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona apresentado diminuições mais severas na locomoção entre os dias, sendo as diferenças de aproximadamente 0,3 e 0,5 (p <0,05 ANOVA, par de Bonferroni comparação sábio) contagens por minuto, respectivamente. Estes dados sugerem uma deficiência na locomoção espontânea ao longo do tempo, com exposição a rotenona e confirma a análise único dia mencionado acima - moscas expostos a dosagens mais elevadas de rotenona mostrou uma diminuição na locomoção espontânea. Tomados em conjunto, estes métodos medir de forma confiável deficiências induzida por rotenona em espontânea e assustá-induzida locomoção.
Figura 1 induzida por Startle locomoção lote demoscas expostos a doses crescentes. rotenona tipo selvagem, cantão-S, as moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona, durante 3 dias e as moscas sobreviventes (8-12) foram, em seguida, aproveitado para a parte inferior do aparelho de frasco duplo. Moscas expostas a 500 uM rotenona mostram um decréscimo significativo na percentagem de moscas na parte superior (A) e aumentar a percentagem de moscas da secção de fundo (B) do aparelho, depois de 30 seg. Isto é indicativo de uma deficiência na resposta de sobressalto em moscas expostas a rotenona. As colunas representam a percentagem média de seis experimentos independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio.
Figura 2. locomoção espontânea trama de moscas expostas a dose crescentes de rotenona. tipo selvagem, Canton-S, moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona e contagens por minuto no quarto dia após a exposição foram plotados. As contagens foram medidas num DAM. Moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona mostram uma redução nas contagens por minuto. Isto é indicativo de uma deficiência na locomoção espontânea em moscas expostas a rotenona. As colunas representam média das contagens por minuto no quarto dia de 5 ensaios independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio.
Figura 3 Variação na locomoção espontânea trama de moscas expostas a doses crescentes de rotenona. Tipo selvagem, Canton-S, as moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona e a diferença de contagens por min on o terceiro e quarto dia após a exposição foram plotados. As contagens foram medidas num DAM. Existe uma tendência para a diminuição dependente da dose na locomoção espontânea com moscas expostos a doses mais elevadas com uma mudança mais negativo na locomoção. Isto é um indicativo de uma redução em movimento. As colunas representam a variação média de locomoção por minuto de 5 ensaios independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio.
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Discussion
Neste estudo, são descritos dois procedimentos para medir tanto a locomoção espontânea a longo prazo e a locomoção induzida pelo sobressalto a curto prazo num modelo de doença de Parkinson induzida por Drosophila rotenona. Pode-se também medir essas características de locomoção em moscas expostas a outros agentes farmacológicos conhecidos para modelar a doença de Parkinson, por exemplo, paraquat 14, modelos genéticos da doença de Parkinson, por exemplo, alfa-sinucleína mutantes 15, e outros modelos da mosca de doenças que afetam a locomoção. Para ambos os métodos, os métodos alternativos e modificações podem ser consideradas. As moscas podem ser anestesiados com gelo, o que poderia aliviar limitações de CO 2 anesthetization por exemplo atraso na coleta de dados para permitir que o CO 2 efeito desgastar.
No ensaio de locomoção induzida por sobressalto, uma vez que as moscas de variação circadiana da mobilidade, que é importante para a recolha de dados, ao mesmo tempo dodia entre os experimentos. Também é importante introduzir moscas para o aparelho de teste, sem anestesia. Contrariamente à maioria dos ensaios de locomoção resposta de sobressalto, que contam com um instantâneo de passagem de um limiar em um período de tempo predeterminado 10,11,15,16, a nossa abordagem, semelhante à rápida geotaxis negativos iterativos (anel) ensaio 17,18, monitora o movimento em várias instâncias sucessivas ao longo de um período de tempo. Esta abordagem de monitoramento contínuo da distribuição de moscas em diferentes zonas podem resolver as diferenças sutis entre os grupos de tratamento. Além disso, a abordagem de calcular a percentagem de moscas em várias zonas da arena podem ajudar a minimizar a contribuição de valores extremos nos dados.
Decidimos também sistematicamente altura em que ponto a ter dados para comparar os grupos de tratamento. Depois de levar os dados a cada 5 segundos para 1 min, nós traçamos os dados e descobriu que as diferenças mais notáveis entre os tratamentos poderia be visto em 30 seg. Depois deste ponto de tempo, moscas expostas a rotenona são capazes de compensar os defeitos de locomoção. Por isso, recomendamos que os usuários otimizem o tempo de aquisição de dados para melhor resolver as diferenças entre seu controle e conjuntos experimentais. Esta abordagem também tem a vantagem de determinar deficiências motoras relativas entre os agentes farmacológicos e / ou em modelos genéticos. Por exemplo, um produto químico mais tóxico do que rotenone podem apresentar diferenças mais notáveis mais cedo do que 30 pontos tempo sec.
Para o ensaio de locomoção espontânea de longo prazo, uma vez que as moscas são anestesiados para introduzi-las no interior dos tubos, não se consideram os dados do primeiro 24-48 horas para permitir a anestesia para fora e usar-a aclimatação das moscas nos monitores de tubos. Outra consideração para este ensaio é a posição relativa do tubo e do sensor de movimento em DAM, pensamos que os dados podem ter um impacto na locomoção espontânea. Colocamos os tubos contendo moscas no monitorde modo que o sensor de monitorização foi de um terço do período de mais distante a partir do tubo de alimentação e não do meio do tubo, como é normalmente feito em utilização tradicional de DAM em estudos circadianos. Isto permitiu-nos a examinar a capacidade das moscas para atravessar, pelo menos, dois terços do comprimento do tubo e levado com dados mais consistentes. É provável que as contagens de atividade podem ser afetados em moscas alimentados com rotenona devido a rajadas de movimento e / ou espasmos fenótipo. Outros fatores de confusão possíveis para a contagem de atividade poderia ser uma gustativa e / ou olfactiva uma aversão / atração para rotenone e outras substâncias químicas de interesse para o usuário. Portanto monitoramento de vídeo adicional 17,19 pode ser utilizado para complementar os dados DAM para uma análise mais aprofundada do fenótipo locomoção.
Em um cenário onde as moscas experimentais têm contagens de atividades semelhantes, em comparação com moscas de controle, é possível que eles diferem na distribuição circadiana de movimento desde fmentiras são mais ativos em torno de luz on / off e on / off de transição em uma luz-12 ciclo escuro h 12 h. Portanto, seria útil para determinar as contagens por minuto em pontos de tempo múltiplos e comprimentos de lixo durante um período de 24 horas para determinar a distribuição exacta de locomoção. Em conclusão, este ensaio, devido à sua capacidade de avaliar as características de movimento não limitados a movimentos em resposta a assustar, vai fornecer novos insights sobre defeitos de locomoção e caracterização de estratégias terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Qiuli Wang, Language Resource Center, Colby College, de assistência técnica, com processamento de vídeo e Eric Thomas, do departamento de música, Colby College, para fornecer a música de fundo. Este projecto foi apoiado por doações do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, INBRE (P20RR016463-12), do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (P20 GM103423-12), os cidadãos Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL e LWM foram apoiados por bolsas do Fundo Escolar Verão, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
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