Summary
帕金森病是一种神经退行性疾病而导致的多巴胺能神经元在中枢神经系统的变性，造成运动缺陷。鱼藤酮车型帕金森氏症的果蝇 。本文概述了两种检测的特点所造成的鱼藤酮是自发性的，惊吓引起的运动缺陷。
Abstract
帕金森病是一种神经退行性疾病而导致的多巴胺能神经元的变性，在中枢神经系统中，主要在黑质。这种疾病会导致电机的不足，这表现为强直，震颤和老年痴呆症的人。鱼藤酮是一种杀虫剂，通过抑制线粒体的电子传递链的功能引起的氧化损伤。它也被用来建模帕金森氏病的果蝇 。苍蝇有一个固有的负面geotactic反应，这迫使他们在被吓了一跳向上攀升。它已经确定，鱼藤酮引起早期死亡率和运动缺陷扰乱果蝇的爬它们已被窃听向下之后能力。然而，鱼藤酮对自发运动的效果没有记载。本研究概述了两个敏感，重复性好，高通量检测的表征鱼藤酮诱导的缺陷短期惊跳诱导运动和长期自发运动的果蝇 。这些测定法可便利地适用于表征运动缺陷和治疗剂的效力的其他果蝇模型。
Introduction
运动缺陷是帕金森氏病的主要症状，并在很大程度上引起黑质1的多巴胺能神经元的退化。鱼藤酮是已被广泛研究的模型帕金森运动障碍果蝇 2-6酮类杀虫剂。鱼藤酮通过阻断氧化磷酸化途径，最终导致细胞死亡7导致的氧化损伤。多巴胺能神经元更容易产生鱼藤酮毒性，使得主要马达基于2,7的化学品的影响。通过在果蝇诱发帕金森氏病的症状，我们就可以更好地了解疾病和纠正其症状6,8-11。 果蝇提供了一个很好的模型来研究这种影响，因为它们的基因听话，易于维护，并且具有快速的生命周期。
几项研究已经表明，鱼藤酮引起短期惊跳诱导在果蝇 -当果蝇运动缺陷被保持在鱼藤酮补充食品，他们表现出惊人死不休2-6后以较慢的负geotactic回应。他们未能在小瓶设备，迅速向上攀升对照试验表明了惊吓引起的运动缺陷。
鱼藤酮对长期的效果，自发运动不能很好地说明。 果蝇活动监视器（DAMS）已被成功地用于监测果蝇的昼夜节律运动研究12,13。苍蝇被放置在单独的管，其被加载到DAM。该装置配备有红外线传感器，该计数的次数蝇打破了红外线光束的数目。这些计数可以用作原状的运动和活动12,13的量度。通过将苍蝇在一个坝，鱼藤酮对他们的长期运动的效果可以表征。这项研究描述的方法来MEAS茜短期惊跳诱导运动和长期的自发运动，以便更好地理解的鱼藤酮介导的运动缺陷的影响。对运动缺乏模仿帕金森氏症表征是很重要的，因为它们允许它可以扭转这些运动缺陷等化合物的研究。
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Protocol
1， 果蝇惊吓引起的步态分析
- 药物治疗
- 稳重的固定化所需的数字1-3（约8-12）日龄雄蝇使用二氧化碳 ，并将其输送到含有药物的补充食品瓶。注：另麻醉剂如乙醚或冰可用于镇静苍蝇，使数量和处理。
- 允许蝇从镇静在水平位置上恢复20分钟（或直到恢复）与小瓶（防止蝇卡住上的食物），然后竖直放置的管形瓶中在12小时黑暗，12小时光照培养箱中在25℃下对于实验的其余部分。
- 实验设置
- 通过标记周围的圆瓶用永久性记号笔分这双瓶设置成6.33厘米三个相等的部分。
- 后药物暴露3天后，转移蝇无麻醉入底小瓶中，并很快将样品瓶在开口上。用胶带将两小瓶加上透明胶带。
- 让苍蝇来适应新的环境15分钟。
- 在白色背景上把试管放入，并成立了数码相机从双瓶装置，在视图中的计时器适当的距离。确保整个装置是在一个单一的图像帧可见的，并且所有的苍蝇都在焦点。保持试验之间是一致的帧，马克相机和小瓶的位置。
- 流动性分析
- 清晰地显示试验次数，药物治疗，并在摄像头视图计时器。
- 牢固地挖掘双小瓶装置对对接的3倍，并确保所有的苍蝇落入到小瓶的底部。同时启动定时器。
- 每隔5秒，1分钟，取该装置的图片。注：另外，视频可以被捕获并停在适当的时间间隔进行测量。
- 允许蝇恢复原状，持续1分钟。
- 数据分析
- 查看照片和在每个部分随时间记录蝇的数目。计算苍蝇在每个部分随时间的百分比。注释：重复此用相同的苍蝇整个过程在感兴趣2或3个时间点，例如，3天，5和7。如果太多苍蝇死整个实验过程中，可以按比例增加原试验编号，以补偿对于死亡率。使用适当的统计分析的数据进行比较。
2， 果蝇自发活动分析
- 食品制作
- 重组3克瞬间果蝇培养基用15ml去离子水和所需的鱼藤酮（或感兴趣的另一种药物）的剂量。
- 一旦食物混合，成为坚定的（约5分钟），谨慎地装载食物是约为1厘米，高为制造商提供透明管（3毫米x 65毫米）。通过小心地放置在管垂直于食品和扭转，直到它们可以与管内的食品被移除添加灌注食品的管中的药物。注意：它有利于把一个手指放在该管的开口，以形成真空。食品中不应含有任何气泡或有凹凸不平的表面的苍蝇能成为卡住。
- 实验装置
- 放置在管的末端最接近食品的塑料盖。推在管尽可能少的塑料帽，因为它可以在小瓶内建立一个气泡，如果推到有力。
- 稳重1天岁的雄蝇以CO 2，并小心将1男飞入各管画笔。重复这取决于所需的试验次数。
- 堵塞该管最远离食品用小棉球，这可以从较大的商店手卷的端购买棉球。
- 允许苍蝇与管子来恢复在水平位置15分钟，确保所有的苍蝇都活着和活性。插入管放入DAM，并确保所有的管子都在同一位置相对于水坝。注意：可以将它们与监测的区域在所述小瓶的中间，或对所有的小瓶推到一边，以使管的端部正在被监视。注：在这个变化的方法请参见讨论。
- 数据收集
- 将大坝在12小时黑暗，12小时光照培养箱设定为25℃。大坝连接到数据采集系统。打开坝软件，并根据喜好选择彬长至10分钟。开始收集数据，并允许该程序收集的数据为7天。注意：滨长度可以根据需要进行调整。
- 数据分析
注：过程的数据，以获得每分钟的计数作为长期自发运动的量度。- 打开大坝文件扫描程序和访问监控数据通过点击选择输入数据。
- 选择合适的显示器系列，并选择10分钟的间隔彬长。
- 在输出文件类型选择通道的文件。让所有其他选项为默认值。
- 点击扫描数据保存到指定的文件夹中。
- 在昼夜数据分析软件导入数据以得到每分钟的计数。注意：对于数据分析Clocklab软件常用。其他的选择也可以。
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Representative Results
果蝇惊吓引起的步态分析
野生型， 州-S，苍蝇30秒（ 图1）后表现出的双管形瓶装置的仅约88％和苍蝇的顶部和底部部分的5％的鲁棒负geotactic响应分别。暴露于125μM和250μM的鱼藤酮3天蝇表明在果蝇中的顶端部分，并在果蝇中的底部的数目略有增加的数量略有减少。暴露于500μM的鱼藤酮蝇显示显著缺陷在负geotactic反应（P <0.05 ANOVA，邦弗朗尼成对比较）如在底部部分证明了在顶端部分较少苍蝇和更蝇相比，控制苍蝇（ 图1）。在因无法在设备迅速攀升的负面geotactic响应这一缺陷指示的缺陷不惊人死不休，在duced运动。
果蝇自发活动分析
野生型， 广-S，果蝇表现出每分钟0.57算作第四天大坝衡量自发的流动性（ 图2）。暴露在125微米鱼藤酮苍蝇表明自发运动的水平相近。相比之下，果蝇暴露于250μM和500μM的鱼藤酮显示出较低的大约50％的措施（P <0.05 ANOVA，邦弗朗尼成对比较）自发运动的（ 图2）。这些蝇移动以每分钟约0.20计数，其表示在自发运动Â鱼藤酮诱导的缺陷。
考虑到初始差异（如果有的话）中的运动不鱼藤酮曝光引起的，我们减去4天及每天3，控制苍蝇之间运动数据显示增加的spontaneo每分钟约0.1计数我们运动天之间，而苍蝇暴露于125μM的鱼藤酮表现出为每分钟约0.15计数（ 图3）略有下降。暴露于250μM和500μM的鱼藤酮蝇显示更加严重降低在运动天之间，以不同点是大约0.3和0.5（P <0.05 ANOVA，邦弗朗尼成对比较）每分钟分别计数。该数据表明自发运动不足随着时间的推移暴露在鱼藤酮，并确认上述单日分析 - 果蝇暴露于鱼藤酮高剂量呈自发运动减少。两者合计，这些方法可靠地测量鱼藤酮诱导的缺陷在自发和惊吓诱发运动。
图1惊吓引起的运动剧情果蝇暴露于剂量逐渐增加的鱼藤酮。野生型， 州-S，雄性果蝇暴露于鱼藤酮的不同剂量的3天，存活的果蝇（8-12）然后，挖掘到的双管形瓶装置的底部。暴露于500μM的鱼藤酮蝇显示在果蝇中的顶端（A）的％的显著下降和30秒后增加的苍蝇在装置的底部（B）的百分比。这表明在果蝇暴露于鱼藤酮的惊吓反应不足的。列表示的6个独立实验的平均百分比。误差棒代表平均值的标准误差; * P <0.05方差分析，邦费罗尼成对比较。
图2：自发运动苍蝇情节暴露剂量增加鱼藤酮，野生型， 广-S的S，雄蝇暴露于鱼藤酮每分钟不同的剂量和次数第四天曝光绘制后。计数是衡量一个大坝。暴露在250微米至500微米鱼藤酮苍蝇显示每分钟的计数减少。这表明在自发运动不足的苍蝇暴露在鱼藤酮。列代表对5个独立审判第四天每分钟的平均计数。误差棒代表平均值的标准误差; * P <0.05方差分析，邦费罗尼成对比较。
图3：改变果蝇暴露于增加鱼藤酮剂量的自发运动情节。野生型， 广-S，雄蝇暴露于鱼藤酮不同剂量和每分钟O数量的差异Ñ曝光后的第三天和第四天进行作图。计数是衡量一个大坝。这里是下降的自发运动与苍蝇接触到高剂量的具有运动更负面的变化呈剂量依赖的趋势。这表明在运动中减少了。列表示每5个独立审判分钟运动的平均变化。误差棒代表平均值的标准误差; * P <0.05方差分析，邦费罗尼成对比较。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了两个过程中帕金森病的鱼藤酮诱导的果蝇模型中同时测量长期自发运动和短期惊吓诱发运动。还可以测量在果蝇暴露于已知的建模帕金森氏病如其他药剂，百草枯14，帕金森氏病，例如遗传模型，阿尔法-突触核蛋白突变体15中，并影响运动疾病其他蝇模型这些运动特征。对于这两种方法，替代的方法和修改可以被考虑。苍蝇可以使用冰，这可能会在数据收集方面减轻二氧化碳麻醉的局限性，例如滞后，让二氧化碳的影响穿脱被麻醉。
在惊恐诱发的运动检测中，由于蝇显示出流动性的昼夜变化，它在的同时收集数据是很重要的实验之间的一天。同样重要的是引入果蝇进入测试装置无需麻醉。相反，最惊吓反应的运动检测，依赖于通过阈值的时间10,11,15,16预定量的快照，我们的做法，类似的快速迭代的负趋地性（环）测定17,18，监视在经过一段时间的连续的多个实例运行。连续监测果蝇在不同区域的分布，这种方法可能解决治疗组之间的细微差别。此外，我们的计算苍蝇在舞台上的多个区域中的百分比的方法可以帮助减少异常值的数据的贡献。
我们还系统地决定在哪些时间点取的数据进行比较的处理组。服用后数据每隔5秒，1分钟，我们绘制的数据，发现治疗之间的最显着的差别可以b见过30秒。在此之后的时间点，果蝇暴露于鱼藤酮能够补偿其运动缺陷。因此，我们建议用户优化数据采集的定时到最佳解决他们的对照组和实验组之间的差异。这种方式也有确定的药理学活性剂和/或遗传模型之间的相对运动的缺陷的优点。例如，更多的有毒化学品比鱼藤酮可表现最显着的区别早于30秒的时间点。
对于长期自发运动测定中，由于苍蝇麻醉的介绍他们的管，不考虑从第24-48小时的数据，以允许对麻醉穿通断的监视管的苍蝇和驯化。这个实验的另一个考虑因素是管坝运动传感器，我们认为这可能会影响自发运动数据的相对位置。我们把含有苍蝇管的显示器使得传感器被监测管最远的三分之一跨度从食物和没有在管的中间如通常在生理研究传统使用DAM的完成。这允许我们研究苍蝇遍历至少三分之二的管的长度的能力，并导致更一致的数据。它是可能的活动计数可在鱼藤酮供给苍蝇由于运动脉冲串和/或抽动表型受到影响。其他可能的混杂因子的活性计数可能是味觉和/或朝向鱼藤酮和用户感兴趣的其他化学物质的嗅觉厌恶/吸引力。因此，额外的视频跟踪17,19可以用来补充大坝的数据为运动型的更透彻的分析。
在这样一个场景，实验苍蝇具有相似的活性计为与对照相比，苍蝇，它是可能的，它们在运动中因为f昼夜分布不同在于更活跃周围光的开/关和关/开在12小时光照，12小时黑暗周期的过渡。因此，这将有助于确定每分钟的计数在多个时间点和彬长在24小时内，以确定运动的准确分布。总之，该试验中，由于其以评估并不限于运动响应于惊跳运动特征的能力，会提供新的见解运动缺陷和补救策略表征。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢秋里王，语言资源中心，科尔比学院，用于视频处理和埃里克·托马斯，音乐系，科尔比学院技术援助，用于提供背景音乐。该项目由来自国立普通医学科学（P20 GM103423-12）国家研究资源中心，INBRE（P20RR016463-12），资金支持，健康和科学部资助，科尔比学院（STA）的国民研究院。 JL和LWM由来自夏季学者基金，科尔比学院资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
- Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
- Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
- Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
- St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
- Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
- Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640 (2011).
- Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
- Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
- Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
- Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).
